核酸的分离和纯化专题培训课件
合集下载
医学课件-核酸的分离与纯化
技术发展推动
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
THANKS
xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
CATALOGUE
目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
THANKS
xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
CATALOGUE
目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
核酸的分离与纯化.
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
Home
2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
6核酸的分离与纯化剖析PPT课件
2020年9月28日
5
• 3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物 色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。
• 4.用水饱和的乙醚抽提最后一次，彻底去除 迹量酚和氯仿。然后68℃水浴10分钟蒸发迹 量乙醚。
• 5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生 气泡。
• 酚/氯仿抽提法标准程序是：
• 酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一 次。
2020年9月28日
10
• 1.CsCl沉降平衡超速离心
• CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方 法：
• ①可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、 L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三 种结构分子与EB结合能力不同（L>OC>CC），EB 插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越 多、浮力密度越小。。
• 2. 酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心 后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条 件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平 衡使其pH值在7.8以上。
制好的饱和酚贮于棕色瓶中4℃可保存1个月。因酚 的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的 pH值＞8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。
• 2.蔗糖密度梯度超速离心
• 可用于分离不同大小的DNA片段
2020年9月28日
13
• 五.核酸的沉淀浓缩法
• 原理：核酸与Na、K、Mg等形成的盐在许多种有 机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性。
• （一）核酸沉淀的盐类及浓度
• 1.NaAc：最常用，终浓度为0.3M（pH5.0）
• 2.NaCl：终浓度为0.2M，除去SDS。
2020年9月28日
医学课件-核酸的分离与纯化
医学课件-核酸的分离与纯化
xx年xx月xx日
目 录
• 核酸的分离与纯化概述 • 核酸的分离与纯化技术 • 核酸的分离与纯化步骤 • 核酸的分离与纯化挑战及解决方案 • 核酸的分离与纯化展望
01
核酸的分离与纯化概述
核酸的分离与纯化的定义和重要性
定义
核酸的分离与纯化是生物学和医学研究中的一项基本技术， 主要是通过一系列的离心、过滤、萃取等步骤将样品中的核 酸与其他大分子物质、小分子物质、细胞结构等进行分离， 同时进一步纯化核酸的过程。
核酸的鉴定和检测
核酸鉴定
利用紫外吸收光谱、分子量测定、凝胶电泳等方法，对纯化的核酸进行鉴定 ，确认其是否为目标核酸。
核酸检测
利用特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测目标核酸的存在和含量 。
04
核酸的分离与纯化挑战及解决方案
样品中核酸的降解和损失问题
稳定性差
核酸在体内易被核酸酶降解，影响分离效果。
鉴定方法选择
采用多种鉴定方法，如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，以确保鉴 定结果的准确性。
标准化操作
通过使用标准化的操作流程和试剂盒，减少操作误差。
05
核酸的分离与纯化展望
核酸的分离与纯化技术的发展趋势
高效分离方法
在核酸分离方面，开发高效、快速、安全的分离方法将是未来的发展趋势，例如 ，改进离心技术、色谱技术等，提高分离效率和纯度。
生物技术应用
核酸的分离与纯化在生物技术领域也具有很大的应用潜力， 例如，用于基因工程、细胞工程和蛋白质工程等领域。通过 核酸分离，可以获得特定基因序列，用于基因克隆、基因敲 除和蛋白质表达等研究。
核酸的分离与纯化技术的未来研究方向
新技术的研发
xx年xx月xx日
目 录
• 核酸的分离与纯化概述 • 核酸的分离与纯化技术 • 核酸的分离与纯化步骤 • 核酸的分离与纯化挑战及解决方案 • 核酸的分离与纯化展望
01
核酸的分离与纯化概述
核酸的分离与纯化的定义和重要性
定义
核酸的分离与纯化是生物学和医学研究中的一项基本技术， 主要是通过一系列的离心、过滤、萃取等步骤将样品中的核 酸与其他大分子物质、小分子物质、细胞结构等进行分离， 同时进一步纯化核酸的过程。
核酸的鉴定和检测
核酸鉴定
利用紫外吸收光谱、分子量测定、凝胶电泳等方法，对纯化的核酸进行鉴定 ，确认其是否为目标核酸。
核酸检测
利用特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测目标核酸的存在和含量 。
04
核酸的分离与纯化挑战及解决方案
样品中核酸的降解和损失问题
稳定性差
核酸在体内易被核酸酶降解，影响分离效果。
鉴定方法选择
采用多种鉴定方法，如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，以确保鉴 定结果的准确性。
标准化操作
通过使用标准化的操作流程和试剂盒，减少操作误差。
05
核酸的分离与纯化展望
核酸的分离与纯化技术的发展趋势
高效分离方法
在核酸分离方面，开发高效、快速、安全的分离方法将是未来的发展趋势，例如 ，改进离心技术、色谱技术等，提高分离效率和纯度。
生物技术应用
核酸的分离与纯化在生物技术领域也具有很大的应用潜力， 例如，用于基因工程、细胞工程和蛋白质工程等领域。通过 核酸分离，可以获得特定基因序列，用于基因克隆、基因敲 除和蛋白质表达等研究。
核酸的分离与纯化技术的未来研究方向
新技术的研发
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
核酸的分离纯化
（2）异丙醇 ）
优点： 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀 一般不需低温长时间放置。 样品沉淀。 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀． DNA共沉淀 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70 乙醇漂洗数次。 70％ 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐 (C2H5OCOOCOOC2H5) 二乙基焦碳酸盐) 二乙基焦碳酸盐
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中 结合使蛋白变性 结合使蛋白变性。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 ） 也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 ～ 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； ）容易降解，保存在 或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿 ℃ 2 h。 ） 浸泡器皿37℃ 时 浸泡器皿 。 4）剧毒。 ）
1.1.2 分离核酸原则： 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 温度不要过高； 不要过高 控制pH 范围(pH pH值 (pH值 2）控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度 离子强度; 3）保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力 机械剪切力. 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
Home
2.2
核蛋白的解聚、 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合) 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。 极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 最困难 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
《核酸的分离与纯化》课件
凝胶层析
柱体上填充的凝胶为物质提供 分子筛作用，不同大小的分子 在凝胶中被阻碍的程度不同。
结论与要点
1 核酸是由核苷酸组成的生物高分子。 2 常见的核酸类型有DNA和RNA。
3 分离技术包括盐析、凝胶电泳、超
速离心和柱层析等。
5 超速离心技术包括差速离心和密度
梯度离心。
4 凝胶电泳可分为琼脂糖凝胶、聚丙
差速离心
通过旋转离心管，根据密度差异使分子分层。
密度梯度离心
将不同密度的离子或分子加入离心管，创建密 度梯度，然后离心管使分子按照密度梯度分 层。
柱层析
吸附层析
利用柱体上填充的化学吸附剂 与物质的亲和性差异使其分离。
离子交换层析
利用电荷性质进行分离，负载 离子的功能团能够与物质中带 正电荷的离子相互作用。
《核酸的分离与纯化》 PPT课件
此课件旨在介绍核酸的分离与纯化方法，从而为纯核酸的获得提供帮助。
核酸是什么
1 分子组成
核酸是由核苷酸组成的生物高分子。每个核苷酸由糖、碱基和磷酸基团三部分组成。
2 功能与作用
核酸参与了生命活动的多个方面，包括传递遗传信息、调控基因表达等。
3 常见类型
常见的核酸有DNA、RNA等多种类型，它们在分子组成和生物功能上存在差异。
核酸的分离方法
1
盐析
通过调节溶液的离子强度，使核酸与溶
凝胶电泳
2
液中的其他物质分离。
利用电场作用使核酸在凝胶中移动，根
据大小和电荷差异分离不同的核酸。
3
超速离心
通过调节离心力和离心时间，使不同重
柱层析
4
量的分子沉淀到不同位置。
利用柱体中填充的吸附剂、离子交换剂、 凝胶等材料，按照不同的物性实现分离。
最新核酸分离纯化
核酸分离纯化
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
Home
2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含 量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
Home
2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含 量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
核酸提取方法——细胞裂解
——物理作用：
包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、 冻融裂解和颗粒破碎等方法。这些方法 用机械力使细胞破碎,但机械力也可引 起核酸链的断裂,因而不适用于高分子 量长链核酸的分离。
超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp 到 > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。
核酸提取方法——细胞裂解
——化学作用：
变性：
加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、 Tween- 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、 Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、 肌酸胍)
碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
——酚氯仿法 简介：1976，Stafford及其同事创立。现已经不断
改进。 关键技术：
酚的使用
用酚来分离核酸首先是Kirty，1956年首次报道。 当时发现酚可以从水相中抽提蛋白质，使用阴离子 盐时，可以实现核酸分配在水相，而蛋白质在有机 相。
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法
4. 转移水相，重复步骤3，直至满意为止。 5. 核酸沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,终浓度为0. 3M
的NaAc 或KAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性 环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～3倍体积的预冷的无水乙 醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。 6. 14000g离心30分钟@室温，或者如果产量较大可直接用玻璃钩子 取出。 7. 70%乙醇洗涤2-3次，即可将沉淀溶于TE保存。
核酸提取时应遵循以下原则: 1、保证核酸分子一级结构的完整性;法一般都包 括：
细胞裂解、酶处理、核酸与其他 生物大分子物质分离、核酸纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
◦ 发展和改进：
SDS取代阴离子盐
酚：氯仿混合液（增加了对糖、脂的溶解）
异戊醇的使用（减少泡沫、使RNase失活）
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法
1. 裂解缓冲液（异硫氰酸胍）处理
2. 蛋白酶K消化，（根据需要亦可加入Dnase或RNAase）
3. 50:48:2苯酚:氯仿:异戊醇混合液，与等量的裂解处理液混合，依 据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简 单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白 质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。
主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分 离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙 酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。 蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有 EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提 高对高分子量核酸的提取效率。
RNA：细胞质中，mRNA，rRNA， tRNA
通常与蛋白质结合，形成RNP
核酸的理化性质
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水， 不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离 酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中， DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
核酸提取方法——酶处理
在核酸提取过程中,可通过加入适当的 酶使不需要的物质降解,以利于核酸的 分离与纯化。
如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白 酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase)；
或者加入DNase 或RNase 去除不需要的DNA或 RNA。
核酸提取方法——分离与纯化
核酸的分离和纯化
背景
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生 物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象，因此核酸提取也成为了分子生物 学实验技术中的最重要、最基本的操作。
核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操 作，直接关系到实验的成败与否，是临 床分子诊断容易发生问题步骤。
核酸的存在形式
DNA：细胞核DNP 线粒体 环状DNA
DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%， 随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠 中的溶解度很大，比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。
核酸提取方法
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、 多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法 纯度高，RNA回收效率极高，尤其是
<200bp的RNA，比如：siRNA，miRNA， mRNA和tRNA等 除核酸外，可提取蛋白质 耗时，繁琐，不利于自动化。
正式名称：异硫氰酸胍-酚-氯仿核酸提取法 By Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、 蛋白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属 离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——细胞裂解
——酶作用（生物作用）：
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法
◦ 酚的准备 重蒸酚(去除可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA 的交联的醌类氧化物）； 加入8一羟基喹咛，以防止酚氧化，（酚氧化发黄，而 氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交 联）； 水饱和酚、平衡PH（大于7.8）（不饱和的酚能与15%其 提及的水互溶，从而降低水相中核酸产量）
核酸提取方法——细胞裂解
——物理作用：
包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、 冻融裂解和颗粒破碎等方法。这些方法 用机械力使细胞破碎,但机械力也可引 起核酸链的断裂,因而不适用于高分子 量长链核酸的分离。
超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp 到 > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。
核酸提取方法——细胞裂解
——化学作用：
变性：
加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、 Tween- 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、 Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、 肌酸胍)
碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
——酚氯仿法 简介：1976，Stafford及其同事创立。现已经不断
改进。 关键技术：
酚的使用
用酚来分离核酸首先是Kirty，1956年首次报道。 当时发现酚可以从水相中抽提蛋白质，使用阴离子 盐时，可以实现核酸分配在水相，而蛋白质在有机 相。
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法
4. 转移水相，重复步骤3，直至满意为止。 5. 核酸沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,终浓度为0. 3M
的NaAc 或KAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性 环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～3倍体积的预冷的无水乙 醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。 6. 14000g离心30分钟@室温，或者如果产量较大可直接用玻璃钩子 取出。 7. 70%乙醇洗涤2-3次，即可将沉淀溶于TE保存。
核酸提取时应遵循以下原则: 1、保证核酸分子一级结构的完整性;法一般都包 括：
细胞裂解、酶处理、核酸与其他 生物大分子物质分离、核酸纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
◦ 发展和改进：
SDS取代阴离子盐
酚：氯仿混合液（增加了对糖、脂的溶解）
异戊醇的使用（减少泡沫、使RNase失活）
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法
1. 裂解缓冲液（异硫氰酸胍）处理
2. 蛋白酶K消化，（根据需要亦可加入Dnase或RNAase）
3. 50:48:2苯酚:氯仿:异戊醇混合液，与等量的裂解处理液混合，依 据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简 单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白 质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。
主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分 离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙 酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。 蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有 EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提 高对高分子量核酸的提取效率。
RNA：细胞质中，mRNA，rRNA， tRNA
通常与蛋白质结合，形成RNP
核酸的理化性质
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水， 不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离 酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中， DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
核酸提取方法——酶处理
在核酸提取过程中,可通过加入适当的 酶使不需要的物质降解,以利于核酸的 分离与纯化。
如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白 酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase)；
或者加入DNase 或RNase 去除不需要的DNA或 RNA。
核酸提取方法——分离与纯化
核酸的分离和纯化
背景
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生 物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象，因此核酸提取也成为了分子生物 学实验技术中的最重要、最基本的操作。
核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操 作，直接关系到实验的成败与否，是临 床分子诊断容易发生问题步骤。
核酸的存在形式
DNA：细胞核DNP 线粒体 环状DNA
DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%， 随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠 中的溶解度很大，比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。
核酸提取方法
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、 多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法 纯度高，RNA回收效率极高，尤其是
<200bp的RNA，比如：siRNA，miRNA， mRNA和tRNA等 除核酸外，可提取蛋白质 耗时，繁琐，不利于自动化。
正式名称：异硫氰酸胍-酚-氯仿核酸提取法 By Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、 蛋白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属 离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——细胞裂解
——酶作用（生物作用）：
核酸提取方法——分离与纯化
——酚氯仿法
◦ 酚的准备 重蒸酚(去除可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA 的交联的醌类氧化物）； 加入8一羟基喹咛，以防止酚氧化，（酚氧化发黄，而 氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交 联）； 水饱和酚、平衡PH（大于7.8）（不饱和的酚能与15%其 提及的水互溶，从而降低水相中核酸产量）