液相色谱

流动相(flow phase) 洗脱液(elution) 检测器(detector) 分部收集器(portion collector)
恒流泵
图2.11.1
紫外检测 器
层析分离流程简图
电脑记 录
二、色谱分离的分类


按应用目的分类
按固定相及流动相的状态分类
按固定相的形状分类
按压力分类 按流动方式分类 按展开方式分类 按分离机理分类

径向流色谱：在柱心设一通透性细管，料液及流动相 从柱的圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中
心管流出，使溶质在半径方向上得到分离。
优点：规模放大时半径不变，通过增大柱高提高处理
能力，而增加柱高不会增大压降，对固定相的机械强
度要求不高，更适合于大规模分离过程。
按展开方式分类

洗脱展开（洗脱色谱）：由于料液中的 溶质在固定相和流动相间分配行为的不 同，在色谱柱出口处被展开形成相互分 离的色谱峰。
① 凡是色谱分离都具有固定相（stationary phase）和流 动相（mobile phase）。
② 固定相是不动的，流动相对固定相作相对的运动。
③ 被分离的组分与流动相和固定相有不同的作用力。这种 作用力有吸附力，溶解力，离子交换能力等。在色谱分 析中常用分配系数来描述组分对流动相和固定相的作用 力的差别： K= Cs/Cm 分配系数的差异是色谱分离的根本原因。
低，但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生物活性 物质活性降低。

中压色谱分离（0.5～4 MPa） 高压色谱分离（4～40 MPa）：流动相流动速率高，分离 时间短，分辨率高。缺点是设备昂贵，此外在高压作用下 有些生物物质有变性的可能。主要用于分析。
按流动方式分类

轴向流色谱：色谱操作中流动相从固定 床的一端输入，沿轴向流向另一端。

溶质1：相对分子量很大，不能进入凝胶的细孔中，从凝 胶间的床层空隙流过，洗脱体积为色谱柱的空隙体积V0； 溶质4：相对分子量很小，能进入凝胶的所有细孔中，其 洗脱体积接近柱体积Vt；


溶质2和3：相对分子质量介于1、4之间，可进入到凝胶 的部分细孔中，其洗脱体积介于V0 、 Vt之间；
相对分子质量大于溶质1或小于溶质4的溶质的洗脱体积 分别与溶质1、4相同。
第五节 离子交换层析（重点） 第六节 疏水性相互作用色谱（次重点） 第七节 其他层析方法
第一节 层析原理与分类 一、原理

色谱法（chromatography）是利用混合物中各 组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品 中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复
多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。

气相色谱（gas chromatography，GC）仅限于能够气 化的物质，且主要用于分析。气相色谱包括气液色谱、气 固色谱。 液相色谱（liquid phase chromatography，LPC）可分 为液液色谱、液固色谱。
超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography, SFC）流动相为超临界流体。
按应用目的分类
分析性色谱

又可分为实验室用色谱、工业生产分析性色谱。如GC 、
HPLC
制备性色谱

又可分为实验室用制备型色谱和工业用大型制造纯物质的 制备色谱。制备型色谱可以完成一般分离方法难以完成的 纯物质制备任务，如纯化学试剂的制备，蛋白质的纯化。
按固定相及流动相的状态分类
根据流动相的相态分为
例如为了达到同样的分离度，当 = 1.01时，所需
的时间是 = 1.1时的84倍。

= 1时，Rs为零，两组份的分离是不可能的。
第四节 凝胶过滤层析 一、原理与操作
凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC） 是利用凝胶过滤介质为固定相，根据料液中溶质相对分子质 量的差别进行分离的液相色谱法。

由上式知，存在某一流速使H最小，在此流速下色谱 柱的理论板数最大，分离效果最好。 在液相色谱中，一般分子扩散的影响可忽略不计，即 A约等于0。因此，为提高分离效果，可通过降低流速 u或减少固定相粒径C值来降低H值。

第三节
柱效n
衡量柱效的指标是n(或neff)
分离度
选择性
为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比


固定相有：固体、液体和以固体为载体的液体薄层
按固定相的形状分类

柱层析（column chromatography） 纸层析（paper chromatography ） 薄层层析（thin layer chromatography）
按：装置比较简单，操作费用
一、色谱的名词术语

分配系数：
m cs cm
cs和cm分别为组份在固定相和流动
相中的浓度。

基线 峰高：色谱峰顶与基线间的垂直距离，以h表示。 死时间tm：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时， 从进样到出现峰极大值所需的时间。物质不被固定相吸附， 故其流动速度与流动相的流动速度相近： 保留时间 tr ：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的 时间。可用时间/ 距离/体积单位表示。 调整保留时间tr’：
调整保留体积V’r：某组份Vr扣除Vm后，称该组份的V’r ， 即：


分配比k， 即容量因子：
意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数

区域宽度：色谱主峰的区域宽度是组份在
色谱柱中谱带扩张的函数。度量色谱峰区 域宽度通常有三种方法： 标准差：0.607倍峰高处峰宽的一半。 半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它 与的关系为： 基线宽度Y：色谱两侧拐点上的切线在基 线上的截距。它与的关系是：
意义：

增加塔板数，可增加分离度，但通过增加柱长来增加塔
板数，会延长分析时间。所以，设法降低塔板高H，才
是增大分离度的最好方法。

加大容量因子可增加分离度，通常将k控制在2-7之间。 选择性的微小增大，会使分离度得到较大的改善。 > 2时，即使在很短的时间内，组份也会完全分离。


1时，要完成分离，必须增加柱长，延长分析时间。
上式说明：在tr一定时，色谱峰越窄，则n越大，H越小，
柱效越高。
在实际工作中，按上式计算出来的 n和 H 值有时并不能充分地反映 色谱柱的分离效能，因为采用 tr计算时，没有扣除死时间 tm，所以，常
用有效塔板数n有效表示柱效： 有效塔板高为：
例1 已知某组分峰的峰底宽为40S，保留时间为400S，计算此色谱柱的 理论塔板数。


GFC操作中溶质的分配系数m只是相对分子质量、 分子形状和凝胶结构（孔径分布）的函数，与所
例2 已知一根 1米长的色谱柱的有效塔板数为 1600块，组份A在该柱上 的调整保留时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔塔板高度。
三、速率理论
荷兰学者范姆特提出色谱过程的动力学理论 —— 速率 理论。吸收塔板理论中塔板高的概念，同时考虑影响塔板 高的动力学因素，指出：填充柱的柱效受分子扩散、涡流 扩散、传质阻力等因素的控制，较好地解释了影响塔板高 的各种因素。HETP为理论板当量高度
第六章 液相色谱
色谱现象
纸层析
In 1903，俄国植物学家Michael Tsweett’s Work Chromatography = (chromatus = color, graphein = to write)
本章内容
第一节 层析原理与分类（重点）
第二节 层析过程理论基础
第三节 分离度
第四节 凝胶过滤层析（重点）
不同之处：所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相 的亲和力比料液中各个组分都大的物质，称为置换剂。 置换剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不 同从柱中次序置换（洗脱）出来。可使溶质区带得到浓 缩，适于大量处理稀溶液。
按分离机理分类

凝胶过滤色谱


离子交换色谱
反相色谱


疏水性相互作用色谱


tr意义：色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到 流动相流速的影响，因此有时用保留体积等参数进行定 性检定。

死体积Vm：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色 谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和， 当后两项很小而可忽略不计时，Vm可由tm与流动相流速 F0计算：

保留体积Vr：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度 极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系如下：
2 dp u 2 Dz m H ( HETP) u 30De 1 m 2 1
谱峰受三个动力学因素的控制，即分子扩散项，涡流 扩散项，传质阻力项。

上述塔板高方程表示为
A H B Cu u
A、B、C为常数，分别代表分子扩散项系数、涡流扩 散项系数和传质阻力项系数。
ø Ñ ½ ù ±¿ Ê Ì A ±¿ Ê Ì B ±¿ Ê Ì C « Æ É ×Ö ù ±¿ Ê Ì D ±¿ Ê Ì E ±¿ Ê Ì F
ì ² ¼ â Æ ÷
« Æ É ×Í ¼
层析 柱 自 动部分 收集 器
组件及过程：

色谱柱(column)


固定相(stationary phase)
n 称为理论塔板数。色谱柱的柱效随理论塔板数 n 的增加 而增加，随塔板高H的增大而减小。
进流动相
平衡
K=1
1/2
1/4 2/4 1/4
1/8 3/8 3/8 1/8
1/16 ¼ 3/8 ¼ 1/16

n与半峰宽及峰底的关系式：
式中：tr为溶质的保留时间；