疏水性相互作用色谱课件
疏水色谱的原理和应用
疏水色谱的原理和应用概述疏水色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是一种常用的分离技术，基于样品中疏水性物质与固定相之间的相互作用而实现分离。
疏水色谱广泛应用于生物分子的纯化和分析中，特别适用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子。
原理疏水色谱的原理基于疏水作用，即非极性物质在水溶液中倾向于聚集在一起。
固定相通常是由疏水性材料制成，如疏水性基团修饰的凝胶或疏水性的磁性微球等。
样品在进样时会与固定相中的疏水性基团发生相互作用，疏水性物质在固定相上停留时间较长，而亲水性物质则快速通过。
分离机理疏水色谱的分离机理主要是基于溶剂极性对样品和固定相之间相互作用的影响。
当样品在经过固定相时，疏水性物质会与固定相上的疏水性基团产生静电相互作用和范德华相互作用等力。
疏水性物质与固定相的相互作用力较强，因此在固定相上停留的时间较长。
而亲水性物质由于与水分子中的氢键形成更稳定的结构，因此在固定相上的停留时间较短。
应用生物分子纯化疏水色谱在生物分子纯化中起到关键的作用。
通过调整溶剂体系中的离子强度和pH值等条件，可以有效地实现生物分子的分离和纯化。
疏水色谱常用于从复杂的混合物中纯化特定的蛋白质、酶和抗体等生物分子。
蛋白质结构分析疏水色谱也可用于蛋白质的结构分析。
通过在不同的溶剂条件下进行疏水色谱分离，可以得到蛋白质在不同溶剂条件下的保留时间信息，从而揭示蛋白质的疏水性特征，进一步了解蛋白质的结构和功能。
药物分析疏水色谱在药物分析中也有广泛的应用。
许多药物分析方法采用疏水色谱技术进行样品的分离和纯化。
疏水色谱对药物分析的应用领域包括药物开发、药物代谢和药物残留等。
氨基酸和肽段分析疏水色谱可以用于氨基酸和肽段的分析。
氨基酸和肽段具有疏水性的特点，因此可以通过疏水色谱进行分离。
疏水色谱在氨基酸和肽段的定量分析和序列分析中有很高的选择性和敏感性。
核酸分离和纯化疏水色谱也可以应用于核酸的分离和纯化。
疏水相互作用层析和反相层析
疏水相互作用层析和反相层析疏水相互作用层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）和反相层析（reverse phase chromatography，RPC）是两种常用的分离技术，广泛应用于生物制药、蛋白质纯化和分析等领域。
疏水相互作用层析是基于样品中疏水性成分与疏水性基质之间的相互作用而实现分离的一种方法。
在HIC中，固定相通常是由疏水性聚合物或疏水性修饰的材料构成，而样品溶液中的疏水性分子则会与固定相发生相互作用，从而被滞留在柱中。
相比于其他色谱技术，HIC具有操作简单、分离效果好、易于工业化生产等优点。
同时，HIC还可以在非变性条件下进行，保留了样品的天然构象和生物活性。
反相层析是一种常用的液相色谱技术，其分离原理是基于样品中成分与固定相之间的亲疏水性差异。
在RPC中，固定相通常是由亲水性材料表面修饰成疏水性的材料构成，而样品溶液中的亲水性分子则会与固定相发生相互作用，从而被滞留在柱中。
与HIC相比，RPC 在生物大分子的纯化中更为常用，尤其适用于蛋白质和多肽的分离。
RPC不仅可以根据亲疏水性差异实现分离，还可以根据分子的大小、电荷和极性等性质进行选择性分离。
疏水相互作用层析和反相层析在分离技术中具有广泛的应用。
它们可以用于蛋白质的纯化和富集，从而提高后续分析的灵敏度和准确性。
此外，它们还可以用于药物研发过程中的药物分离和纯化，以及生物制药工艺中的产品纯化。
在研究领域，疏水相互作用层析和反相层析也被广泛应用于蛋白质相互作用的研究，如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-药物相互作用等。
虽然疏水相互作用层析和反相层析都是基于亲疏水性的分离原理，但它们在柱填充物和操作条件上存在一定的差异。
疏水相互作用层析中，常用的固定相材料有羟基磷灰石、聚乙烯醇、硅胶等，操作条件通常在中性或弱酸性条件下进行。
而反相层析中，常用的固定相材料是疏水性的C18烷基硅烷，操作条件通常在酸性或中性条件下进行。
《疏水层析7组》PPT课件
疏水层析原理：
特点：利用样品与介质疏水性大小进展分别，样品不用脱盐。 利用被分别组分分子外表的疏水微区、〔可逆〕变性后暴显露
的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子外表的疏水残基与 固定相的疏水性 配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子 强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分别分开。 *洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出；
流动相B为含盐量较低的缓冲液，缓冲液类型与流动相 A一致。
洗脱的方式：
采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱〔最常 用〕；
经过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、 丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗 脱 〔溶剂中稳定性良好的物质〕
往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与 介质发生剧烈吸附，从而将结合在其上的目 的组分置换下来〔分别膜蛋白〕
介质的选择：
❖ 在HIC中，应选机械强度较大的刚性基质；假设待分 别物质分子量很大，且样品量较大，那么应选大孔基 质，如琼脂糖凝胶；假设待分别物质较小，或样品量 很小，但分辨率的要求高，那么可选孔径小的基质甚 至非孔型基质。
❖ HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间， 苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生π-π相 互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固 定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。
疏水电荷诱导层析(HCIC)
❖ HCIC是近几年来开展起来的一类不同于HIC的新 技术，由Burton等 1998年提出；
❖ HCIC与蛋白质的作用除了疏水作用，还有电荷间 的相互作用；
❖ HCIC与蛋白质的结合是由疏水作用推进的，与 HIC不同的是，这一过程通常是在不改动离子强度 的条件下实现的；
盐浓度低，疏水强的Pr后流出。
三、疏水层析过程
凝胶处置
疏水层析色谱的原理及应用
疏水层析色谱的原理及应用1. 简介疏水层析色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，简称 HIC）是一种常用的色谱技术，利用样品中溶质与柱上固定相之间的疏水作用来分离和纯化目标蛋白质。
本文将介绍疏水层析色谱的原理和应用。
2. 原理疏水层析色谱的原理基于疏水作用。
在疏水层析柱上，通常使用亲疏水性互补的固定相材料。
样品中的溶质通过与固定相发生疏水作用，从而被留下来。
疏水层析柱的选择参数主要包括固定相的亲水/疏水程度、样品溶液的 pH 值以及溶液中的盐浓度。
3. 疏水层析色谱的应用3.1 蛋白质分离与纯化疏水层析色谱广泛应用于蛋白质的分离与纯化。
根据蛋白质的疏水性质，可以通过调节溶液 pH 值和盐浓度来改变蛋白质与固定相之间的疏水相互作用，实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。
3.2 病毒和肽的富集疏水层析色谱也可以用于病毒和肽的富集。
一些疏水层析柱可以选择性地吸附病毒和肽，并去除其他的杂质物质。
这样可以提高样品中目标物的浓度，方便后续的分析和研究。
3.3 降低样品的复杂性对于复杂样品，疏水层析色谱可以通过去除一部分干扰物质，降低样品的复杂性。
通过人为调节固定相的亲疏水性质，可以实现不同溶质的选择性吸附，并采用洗脱方法将目标物质洗脱出来。
3.4 聚合物分离疏水层析色谱还可以应用于聚合物的分离。
通过调节溶液 pH 值和盐浓度，可以改变聚合物与固定相之间的疏水作用，实现聚合物之间的分离和纯化。
3.5 生物药物制剂的纯化疏水层析色谱在生物药物制剂的纯化中发挥重要作用。
对于重组蛋白质等生物药物，疏水层析色谱可以有效地去除杂质蛋白质和其他有机物，提高药物纯度。
4. 优势和限制4.1 优势•疏水层析色谱对样品中溶质的选择性吸附具有一定的调节性，适用于多种样品分离与纯化；•疏水层析色谱操作简单、设备要求低，易于应用于实验室和工业生产中。
4.2 限制•疏水层析柱通常需要根据样品性质进行特定的预处理和优化；•高盐浓度的使用可能导致样品与固定相缓慢结合，降低目标物质的得率。
疏水作用色谱原理
疏水作用色谱原理
疏水作用色谱是一种基于样品中分子间的疏水相互作用实现分
离的色谱方法。
在疏水作用色谱中，分离材料通常是一种疏水性的固定相，如碳氢化合物和硅氧化合物。
这些固定相的表面上具有疏水性，可以吸附和保持疏水性分子，而使其他分子在固定相表面上滞留时间较短，从而实现分离。
在疏水作用色谱中，流动相通常是一种极性溶剂，如水和乙醇。
通过调节流动相中极性溶剂的比例和流速，可以实现不同分子的选择性分离。
疏水作用色谱已广泛应用于多种分离领域，如生物分子分离、环境水质分析和药物分离纯化等。
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亲水作用色谱和疏水作用色谱
亲水作用色谱和疏水作用色谱
亲水作用色谱和疏水作用色谱是两种常用的分离技术，它们在化学分析、生物医药等领域中广泛应用。
亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC）是一种基于样品和固定相之间亲水作用进行分离的色谱技术。
在亲水作用色谱中，固定相通常采用极性的硅胶或亲水性的高性能液相色谱（HPLC）柱。
亲水作用色谱适用于分离极性化合物，如极性小分子、多肽、糖类、核酸等。
在亲水作用色谱中，样品溶液中的化合物与固定相之间通过氢键、静电相互作用等亲水作用进行分离。
通过调节流动相的组成和pH值，可以实现对目标化合物的选择性分离。
疏水作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是一种基于样品和固定相之间疏水作用进行分离的色谱技术。
在疏水作用色谱中，固定相通常采用疏水性的高性能液相色谱柱，如碳链（C4、C8、C18等）柱。
疏水作用色谱适用于分离非极性和中等极性的化合物，如脂类、蛋白质、抗体等。
在疏水作用色谱中，样品溶液中的化合物与固定相之间通过疏水作用进行分离。
通过调节流动相的组成和温度，可以实现对目标化合物的选择性分离。
总的来说，亲水作用色谱和疏水作用色谱是两种互补的分离技术，可根据待分离化合物的性质选择合适的色谱方法，实现高效、精确的分析和纯化。
疏水色谱201306051..
添加文本 3. 非多孔填料
这种填料粒度一般为1～3μm,在分离过程中可有效地避 免溶质在固定相颗粒内部的吸附和扩散,使溶质在固定 相与流动相之间能进行迅速的质量迁移,而且由于粒度 小、刚性好,对改善柱效、提高样品回收率、保持溶质 分子的生物活性都十分有利,特别适合于生物大分子的 高分辨分离与快速分析。目前,以硅胶和聚合物为基质 的非多孔型HPHIC固定相均有报道,比如在硅胶表面键 合聚醚制成的非多孔硅胶填料能在2m in内对4种蛋白混 合物进行快速分离。将大孔琼脂糖凝胶经收缩、交联和 非极性配基衍生制成的非多孔树脂以及在亲水高聚物表 面键合丁基制成的非多孔树脂也很有特色。在含有环氧 基的交联共聚物微球上键合PEG制成非多孔树脂亦取 得较好的效果。
疏水色谱的进展研究
前言 添加文本
随着生命科学的发展,用生物技术生产的产品需要进行 分离和分析。作为分离、纯化和制备生物大分子有效手 段的高效液相色谱法(HPLC)在生物工程的下游技术中 占有重要的地位。但是,众所周知,在生化分离过程中,普 遍存在蛋白质易失活问题,特别是用反相高效液相色谱 法(RP-HPLC)纯化时,由于流动相中大量有机溶剂的存 在,使蛋白质的生物活性难以保持。高效疏水色谱法 (HPHIC)则克服了这一缺点。由于它是用含盐水溶液作 为流动相,固定相的疏水性适中,具有分离条件温和、不 损伤蛋白质活性、分离效率高以及柱容量大等优点,因 此在生化分离中,特别在活性蛋白质的分离中,日益成为 人们优先考虑的色谱分离手段。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
添加文本 4 、大孔膜
高效膜色谱法是一种新型色谱方法,它采用容量大、渗 透性好的膜作为载体,最大特点是不用复杂的仪器,并且 能将膜分离过程中分离速度快、处理量大等优点与柱色 谱法中选择性好、分离效率高、负载量大等优点有效的 结合起来,分离速率比HPLC柱高2～3个数量级。关于 大孔膜的研究主要集中于亲和膜和离子交换膜,Kubota 等利用辐射诱导接枝法制成的疏水大孔膜在分离和制备 生物大分子方面颇具特色。Tennikova等用甲基丙烯酸 缩水甘油酯-辛基甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙烯交联得 到的三元聚合物膜为基体,分别制成了离子交换、疏水、 反相大孔膜,并利用混合蛋白质研究了置换剂浓度、流 速、梯度斜率等对分离结果的影响。
疏水作用色谱和共价色谱——高等生物分离技术
Water molecules Hydrophobic ligand 疏水配体
会通中外 并育德才
Sample application 加样
1. Equilibration
2. Sample application
3. Washing 4. Elution
Gel matrix
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Hydrophobic groups 疏水基团
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会通中外 并育德才
Why should I use it?
• Complementary to ion exchange (离子交换色谱，IEX) and gel filtration (凝胶色谱，GF)
• Mild, non-denaturing • High selectivity • High recovery(高回收率) • Concentrating technique（高效富集技术）
Proteins
会通中外 并育德才
Washing out unbound material 洗脱未结合的物质
1. Equilibration 2. Sample application
3. Washing
4. Elution
Non-bound proteins 未结合的自由蛋白
Abs吸光度
Conc. Salt 盐浓
4. Elution
More strongly bound proteins 更强结合的目标蛋白的洗脱
Abs
Conc. salt
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会通中外 并育德才
疏水作用色谱（HIC）
1. 什么是疏水色谱？
2. 介质是什么?
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Interaction principle 作用机制