疏水层析填料
层析填料介绍
层析填料介绍
一、离子交换层析柱
1. 弱阳离子交换填料：以羧基为主，常用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
2. 强阳离子交换填料：以氨基为主，常用于有机物、生物小分子、金属离子等的分离。
3. 弱阴离子交换填料：以胺基为主，通常用于无机阴离子、有机酸、磷酸等的分离。
4. 强阴离子交换填料：以季铵盐为主，常用于离子的选择性吸附分离、蛋白质去除等。
二、凝胶层析柱
1. 大孔凝胶层析填料：具有大的孔径和大的分子量，适用于大分子的分离和纯化，如蛋白质、糖类等。
2. 中孔凝胶层析填料：孔径和分子量较小，适用于中小分子的分离和纯化，如抗体、糖体、药物等。
3. 小孔凝胶层析填料：孔径和分子量非常小，适用于小分子有机物、酶、激素等的分离和纯化。
4. 离子交换凝胶层析填料：同时具有凝胶和离子交换功能，适用于对分子量和电荷具有选择性的物质的分离和纯化。
三、亲和层析柱
1. 金属亲和层析填料：以Ni、Co、Zn等为配位离子的柱子，适用于含有带金属结构的肽、蛋白质、核酸等的分离。
2. 免疫亲和层析填料：以特异性抗体为配体的柱子，可用于分离和纯化含有特定表位的蛋白质等物质。
3. 亲和层析填料：利用配位、化学键合、反相作用等与物质之间的亲和力实现分离和纯化。
以上是常见的层析柱填料种类及其特点，选择合适的填料可提高层析分离效率和纯化效果。
不同层析填料结构及性能汇总
不同层析填料结构及性能汇总层析填料是一种在化学工艺过程中常用的颗粒填料，用于物质的分离、提纯和反应等操作中。
不同的层析填料结构具有不同的特点和性能，下面是几种常见的层析填料结构及其性能的汇总。
1.球形填料：球形填料是层析填料中常见的一种，主要特点是球形颗粒，表面光滑。
球形填料的优点是具有较好的流动性，易于装填和拆卸，而且堆积密度较大，具有较高的载液处理能力。
球形填料的局限性是接触面积相对较小，不适合用于需要更大的接触面积的反应。
常用的球形填料有玻璃微珠和石英微珠等。
2.塔板填料：塔板填料是一种层析填料，其结构为多孔板状结构。
塔板填料的主要优点是填料与流体的接触面积大，具有很高的传质效果。
而且利用塔板填料可实现对流体的逆向流动和分布，能够达到较好的分离效果。
不过塔板填料的缺点是容易堵塞，需要定期维护和清洗。
常见的塔板填料有不锈钢网格填料和陶瓷塔板填料等。
3.散堆填料：散堆填料是一种高度散装的层析填料，其结构松散，流体在填料之间能够较为均匀地流动。
散堆填料的主要优点是填料之间通道较大，流体阻力小，能够获得较大的固液接触面积，有利于物质的分离和传质。
散堆填料的缺点是装填和拆卸比较困难，而且流体流动过程中易造成填料的堵塞。
常见的散堆填料有活性炭、陶瓷颗粒和聚苯乙烯微珠等。
4.结构化填料：结构化填料是一种具有规则几何形状的层析填料，可以是板状、网状或块状等。
结构化填料的主要优点是填料具有统一的形状和大小，能够获得较好的流体分布和传质效果，而且填料之间的通道大小可以根据需要进行调整。
结构化填料的缺点是成本较高，制造过程复杂。
常见的结构化填料有金属泡沫填料和陶瓷梯度填料等。
综上所述，不同的层析填料结构具有不同的特点和性能，可以根据具体的应用需求选择适合的填料结构。
球形填料具有良好的流动性和高的载液处理能力；塔板填料具有高的传质效果和分离能力；散堆填料具有较大的固液接触面积；结构化填料具有统一的形状和大小等特点。
层析填料介绍
层析填料介绍摘要：一、层析填料的概念与分类1.层析填料的定义2.分类方法及常见类型二、层析填料的工作原理1.分离原理2.固定相与流动相三、层析填料的应用领域1.生物制药2.食品工业3.环境保护四、我国层析填料的发展现状与趋势1.发展现状2.技术挑战3.未来发展趋势五、结论正文：层析填料是一种具有特定孔径和分离效果的微球或膜材料，广泛应用于生物分离和纯化领域。
本文将介绍层析填料的概念、分类、工作原理、应用领域以及我国的发展现状与趋势。
一、层析填料的概念与分类层析填料是一种具有多孔结构的材料，其分离效果主要取决于固定相（填料）与流动相（样品）之间的分配系数差异。
根据分离原理和固定相的性质，层析填料可分为多种类型，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
二、层析填料的工作原理层析填料的分离效果主要依赖于样品中各组分与固定相之间的吸附和解吸作用。
在层析过程中，样品在流动相的带动下，经过填料层，各组分根据与固定相的亲和力不同，发生不同程度的吸附和解吸，从而实现分离。
三、层析填料的应用领域层析填料在生物制药、食品工业和环境保护等领域具有广泛应用。
在生物制药领域，层析填料可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化；在食品工业中，可用于天然产物、食品添加剂等的提纯与精制；在环境保护方面，可应用于水质处理、废气净化等。
四、我国层析填料的发展现状与趋势我国层析填料行业在近年来取得了显著的发展，但与国际先进水平相比，仍存在一定的技术差距。
目前，我国层析填料产业面临着技术挑战，如提高填料的分离效果、降低生产成本、开发新型填料等。
未来，我国层析填料行业将朝着高技术含量、高附加值、绿色环保的方向发展。
综上所述，层析填料作为一种重要的生物分离材料，具有广泛的应用前景。
蛋白质分离纯化的原理
蛋白质分离纯化的原理
蛋白质分离纯化的原理主要基于不同蛋白质之间的化学性质和生物活性的差异。
以下是一些常用的蛋白质分离纯化原理：
1. 尺寸排除层析（Size Exclusion Chromatography）：利用各种不同孔径的柱填料，通过蛋白质在柱中流动时，根据分子量的大小来进行分离。
较大分子量的蛋白质会逐渐流过柱床，而较小分子量的蛋白质则会进入柱床的孔隙中。
2. 亲和层析（Affinity Chromatography）：利用蛋白质与特定配体之间的亲和性进行分离。
通常在柱填料上固定对目标蛋白质有选择性结合的配体，通过向柱中加入蛋白质混合物，目标蛋白质可以与柱填料上的配体结合，而其他非特异性结合的蛋白质则会迅速流出。
最后，通过改变条件，如改变pH或加入竞争性配体，可以使目标蛋白质从柱上解离。
3. 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）：利用蛋白质与固定的离子交换基团之间的静电相互作用进行分离。
在柱填料上固定有阴离子交换基团的柱填料，当蛋白质混合物从柱中通过时，具有不同电荷的蛋白质会与柱填料上的离子交换基团发生相互作用，从而实现分离。
4. 疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography）：利用蛋白质与柱填料上的疏水基团之间的疏水相互作用进行分离。
在柱填料上固定有疏水基团，当蛋白质混合物从柱中通过时，具有较强疏水性的蛋白质会与柱填料上的疏水基团发生相互作用，从而实现分离。
这些方法经常结合使用，以提高对目标蛋白质的纯化程度和产量。
在实际应用中，选择适当的分离纯化方法还需要考虑蛋白质性质、产量要求以及研究目的等因素。
疏水作用色谱填料研究进展
值）３ 如磷酸盐体系、 （） ２， 乙酸－ 乙酸盐体系等， 可以避
免残 留硅 醇带来 的阴离 子效应及硅基填 料的溶解 损 失 。另 外 在 酸 性 ｐ 值 下 ， 白 质 会 部 分 变 质 失 Ｈ 蛋
出现， 使得原先缓慢的疏水色谱分离技术实现快速
分 成 可 （０ 离 为 能９ ２） ， ３
２ １４ 贯穿 （ｅｆ ｉ ） ．． ｐｒ ｓ ｎ 孔基质 ｕｏ
快速 分离（ ｍｎ 的活性 回收率很高（ ＜５ ｉ） ８ ）
２１３ 聚合物基质 ．．
针对硅 胶在碱 性条 件下 易溶 解 的缺点 ， 也为 了
２２ 疏水性配基 ． ＨＣ填料的一个重要特点是配基具有很弱的疏 Ｉ
水性 ， 与蛋 白质作用很温和 ， 从而能很 好地保 留蛋 白 质的生物活性（） 水配 基的类 型 、 ２。疏 ６ 烷基配 基 的碳 链长 短都是决 定填 料疏 水性 的关键 。前面 已提到 ，
甲氧基聚乙二醇修饰的葡糖氧化酶与良他酶素的共
轭产物 。 张 仁斌 等（） 聚 乙二 醇键 合在 大 颗粒 基 质如 ３将 ３
多孔玻璃和琼脂糖软凝胶和硅胶上制成键合相可用 于蛋白质的疏水分离。其中Ｐ Ｇ１０ 键合填料 Ｅ －５０
（０ｍ） ５ｎ 有最佳分离效 能 ， 白质在此柱上 可得 ９ ％ 蛋 ０
以上的活性回收率。２ ｇ以上的蛋白质样品可一次 ｍ 注入 １０ ｍ×５ ｍ ｉ ． ０ｍ ｍ ． 分析柱中而不影响分辨率 ． ｄ
满足某些特殊场合分离的需要， 人们开发了高分子 聚合物填料， ｏａｓ ｎ５ １７ 年研究了不同 如Ｊｈｎｓ （ 于 ９４ ｏ２ ）
组成的丙烯 酰胺和 甲基丙烯酸 酯合 成的共聚物填 料 与醇脱氢酶 的疏水作用对酶活性 的影响 。
ＨＣ填料的碳链与Ｒ Ｌ Ｉ Ｐ Ｃ不同， 一般偶联密度很低，
疏水层析填料
2008-6 Volume 8疏水层析填料疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）色谱柱：8.2 x 150 mm柱体积：8 ml流动相：2.0 – 0.0MAmmonium Sulfatein 0.01M phosphate, pH 7.0流速：1.32 ml/min样品：5 mg/3 ml– 100 µl2008-6 Volume 8Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。
Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
疏水层析填料种类
疏水层析填料种类疏水层析填料是一种常用于色谱分析中的填料材料，它具有疏水性能，能够在分离过程中有效地分离样品中的混合物。
下面将介绍几种常见的疏水层析填料种类。
1. 碳链疏水层析填料碳链疏水层析填料是一种以疏水性为基础的填料材料。
它由具有碳链结构的有机化合物制成，具有较高的疏水性能。
碳链疏水层析填料在分离过程中能够有效地吸附和分离样品中的非极性化合物，如脂肪酸、烷烃等。
碳链疏水层析填料常用于食品、医药、环境等领域的分析中。
2. 硅胶疏水层析填料硅胶疏水层析填料是一种以硅胶为基础的填料材料。
硅胶具有较高的孔隙度和比表面积，能够提供较大的吸附表面，因此适用于分离和富集样品中的疏水性化合物。
硅胶疏水层析填料广泛应用于有机合成、药物分析和环境监测等领域。
3. 疏水性分子筛层析填料疏水性分子筛层析填料是一种以分子筛为基础的填料材料。
分子筛是一种具有特殊孔隙结构的材料，能够通过选择性吸附分离混合物中的特定成分。
疏水性分子筛层析填料主要应用于石油化工、精细化工和环境保护等领域，能够有效地分离和富集样品中的疏水性物质。
4. 疏水性聚合物层析填料疏水性聚合物层析填料是一种以聚合物为基础的填料材料。
疏水性聚合物具有较高的亲水性，能够在分离过程中选择性地吸附和分离样品中的疏水性化合物。
疏水性聚合物层析填料在生物医药、食品分析和环境监测等领域具有广泛的应用。
总结起来，疏水层析填料种类多样，每种填料都具有独特的特点和适用范围。
选择合适的疏水层析填料能够提高色谱分析的分离效果和分析灵敏度，为科研和生产提供可靠的数据支持。
在实际应用中，需要根据样品特性和分离要求选择合适的疏水层析填料，以获得准确、可靠的分析结果。
层析填料选择
•柱效/分辨率 •表面特性 •压力/流速特性
14 / GE /
按照层析技术原理分类选择填料
• 凝胶过滤填料选择 • 离子交换填料选择
• 亲和填料选择
• 疏水填料选择 • 反相填料选择
15 / GE /
离子交换（IEX）－最受欢迎的层析方法
原理：根据生物分子的表面电荷性质进行分离纯化，
可以应用在层析的各个阶段。
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
小
高
90um
Q、SP、DEAE、CM、ANX Sepharose Fast Flow
DEAE、CM Sepharose CL-6B
100-300um
Q、SP Sepharose Big Beads
Sreamline SP and DEAE
颗 粒
大
分 辨 率 低
18 / GE /
Q、SP Sepharose XL －－超高载量填料
27 / GE /
Capto MMC
－－耐高盐浓度的弱阳离子交换凝胶
• 高盐吸附
• 新的选择性
28 / GE /
Layered beads-Two Examples
Shell Beads
22 / GE /
Capto基架刚性更强
•高流速、低反压 •高载量
Capto™ Q and Sepharose™ 6 Fast Flow in BPG™ 300, 20 cm bed height
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2008-6 Volume 8
疏水层析填料
疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）
色谱柱：8.2 x 150 mm
柱体积：8 ml
流动相：2.0 – 0.0M
Ammonium Sulfate
in 0.01M phosphate, pH
7.0
流速：1.32 ml/min
样品：5 mg/3 ml– 100 μl
2008-6 Volume 8
Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）
Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。
Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨
基柱的柱寿命比较
左图为Asahipak NH2P色谱
柱与硅胶基材氨基柱的寿命对
比试验。
结果显示：随着使用时
间的延长，硅胶基材氨基柱对单
糖、二糖的保留快速下降，其原
因应是硅胶基材氨基柱的氨基
降解所致。
色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E,
其它公司的氨基柱
(4.6mmID*250mm)
流动相：CH3CN/H2O=75/25
流速：1.0mL/min
检测器：Shodex RI
柱温：30度
Asahipak NH2P色谱柱可在正相模式下分离糖类物质，糖类
物质按照分子量由小到大的顺序依次被洗脱。
增加洗脱液中有
机溶剂的比例可以延迟糖类的洗脱时间。
Asahipak NH2P色谱柱
可以在碱性，室温条件下分离单糖、二糖和糖醇混合物。
右图
为Asahipak NH2P色谱柱分离单糖、二糖及三糖混合物的应用
实例。
单糖、二糖及三糖混合物的分离
色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6mmID*250mm)
流动相：H2O/CH3CN=25/75
流速：1.0mL/min
检测器：Shodex RI
柱温：30度
2008-6 Volume 8
学习园地
导致色谱柱柱压升高的原因及解决方案
第一阶段：确认是柱子导致的压力上升，还是HPLC系统导致的压力上升。
由于HPLC系统有很多环节，如泵、管路等，都容易吸附和积聚杂质，这些因素均会导致压力上升，所以，应先对HPLC系统进性排查。
排查方法：取下色谱柱，仅用管路连接并正常输送流动相时记录系统压力。
如果此时HPLC系统压力正常，则考虑是柱压升高。
第二阶段：确定是否使用了保护柱（预柱）。
一般在测定容易堵塞色谱柱的样品时，应该使用保护柱。
如果使用了保护柱，那么压力的升高就有可能是保护柱的柱压升高导致的。
排查方法：取下色谱柱，仅以保护柱连接管路并正常输送流动相测试柱压，再反过来取下保护柱仅以色谱柱连接管路正常输送流动相测试柱压，如果仅当连接保护柱时柱压高的话，则为保护柱引起的柱压升高，请清洗、或更换保护柱。
第三阶段：如果不是上述第一、第二点原因造成压力升高，就可以确认是色谱柱的原因了。
如果柱压是随着使用时间的延长，慢慢上升，这属于正常现象，是色谱柱达到使用寿命了，只能更换色谱柱了。
如果柱压是在实验开始时，实施中或经过一次、几次实验后，突然上升，则要结合实验情况考虑原因解决方案
色谱柱
柱长色谱柱越长，柱压越高。
可根据实验情况适当减小柱长。
柱内径柱内径越小，柱压越高。
可选择大内径色谱柱。
填料基质的形态填料的形态也会对柱压有影响。
硅胶基质的形态可以分为无定形和球形两种，现在一般装柱使用球形硅胶。
常规的色谱柱清洗方法（正向冲洗）
使用比目前使用的流动相对样品溶解能力更强的试剂清洗色谱柱。
如果您使用的流动相是乙腈：水（70:30），请使用更高浓度的乙腈水溶液进行清洗，比如乙腈：水（80:20）或乙腈：水（90:10）。
但是，如果高浓度的乙腈水溶液导致样品溶解困难的话，请停止使用上述流动相，转而使用对样品易溶的流动相。
如果该方法仍不见效，请试用下述方法。
色谱柱清洗方法（反向冲洗）
将色谱柱反向连接（即与色谱柱上箭头标识相反的方向使流动相由出口处流入、入口处流出）输送流动相试试。
此时，如果柱压太高会对色谱柱造成损坏，所以请将流速调至平时操作时的一半。
但是，如果使用相同的流速，反洗比正向清洗柱压还低的话，可能会发生色谱柱入口处的填料在筛板处聚集，那么就使用原有流速进行反洗。
反洗流动相的选择与上述正向冲洗相同，请选用比平时使用的流动相溶解性更强的、更易溶解样品的流动相。
注意，反洗时请断开检测器的管路连接，以避免污染检测器。
反洗色谱柱容易对色谱柱造成伤害，不到万不得已不要轻易使用。
本期的内容就先介绍到这里，欢迎大家各抒己见，希望以上内容能对大家的学习工作有所帮助。