04第五章__疏水层析
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
下面是疏水层析的标准操作规程，供参考：一、实验前的准备工作1. 根据实验目的，选择合适的疏水相和适宜的反相色谱柱，并进行校准。
2. 配制高纯度的溶剂，保证溶剂的质量，并按照方法要求调节溶剂的pH值。
3. 确保色谱仪及其相关设备准备就绪，包括流速泵、样品自动进样器、检测器等。
二、样品的处理1. 准备样品溶液，并通过过滤或离心将悬浮物去除，以保证样品的纯度。
2. 根据样品特性选择合适的提取方法，如溶剂萃取、固相萃取等。
3. 根据实验要求，进行必要的前处理，如稀释、酸化、碱化等。
三、系统的初始设置1. 对色谱系统进行初始设置，包括流速、检测器的温度、波长等。
2. 开始预洗柱，选择合适的洗柱溶剂，将样品进样口与引入口连接，设置洗柱时间。
四、方法的优化和验证1. 选择合适的进样量和洗柱时间，确定最佳的色谱条件。
2. 根据样品的复杂程度，适当调整固定相的选择和柱温。
3. 针对不同样品进行方法验证，包括线性度、准确度、精密度等指标的验证。
五、正式实验过程1. 将样品进样器与色谱仪连接，并设置好进样量和进样速度。
2. 开始注入样品，根据方法要求选择适当的流速，并同时进行监测。
3. 在实验过程中，密切注意流速、柱温和检测器的响应。
六、数据处理和结果分析1. 对实验结果进行数据处理，包括峰面积的计算、峰高的测量等。
2. 根据标准曲线或参考物质进行定量分析，计算样品中目标物质的含量。
3. 分析结果的统计学处理，包括平均值、相对标准偏差等指标的计算。
七、实验结束后的工作1. 关闭色谱仪及相关设备，清洁色谱柱和进样器，并存储在适当的环境中。
2. 处理实验废液和废物，保证环境安全和实验室的整洁。
3. 归档实验数据和结果，记录实验过程中的问题和改进方向。
疏水层析标准操作规程需要根据具体实验目的和方法要求进行调整，上述只是一个基本的操作指南，希望对您有所帮助。
疏水相互作用层析
疏水相互作用层析
液体分子中存在着由疏水相互作用层（hydrophobic interactions）引起的吸引力或者排斥力，即在表面上构成一个光滑的膜状结构，从而使相邻的分子能够彼此吸引。
疏水相互作用可分为氢键形成的疏水相互作用（hydrogen bonding）和电位效应（ion-pairing）。
氢键形成的疏水相互作用主要是由液体分子中的氢原子及其离子之间，形成氢键来构成的，这个相互作用层相对稳定，能够加强其他分子的相互结合作用，使其保持在稳定的状态中。
电位效应（ion-pairing）主要是由中性分子中离子（并非完全离子化）之间形成，它们之间不受静电力的影响，构成一个轻微的膜状结构，从而使分子之间产生互相吸引和排斥的作用力。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
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二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
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疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
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4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
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5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
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三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
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四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是一种常用的色谱分析技术，其原理基于样品分离时固定相与移动相之间的亲疏水性差异。
疏水层析中，固定相通常是一种非极性材料，如疏水性树脂或疏水性硅胶。
移动相则是一种有机溶剂，如甲醇或乙腈，其疏水性介于固定相和要分离的样品之间。
在疏水层析柱中，样品溶液由于亲疏水性差异而与固定相发生不同程度的相互作用。
亲疏水性强的物质会与固定相发生较强的相互作用，停留时间相对较长，而亲疏水性弱的物质则会较快地通过固定相，停留时间较短。
疏水层析的分离原理可解释为两种相互竞争的作用力。
一方面，固定相表面具有较大的亲疏水性，使得亲疏水性强的物质更容易与其发生相互作用，并在固定相上停留。
另一方面，移动相中的有机溶剂对固定相表面也有一定的亲疏水性，这种亲疏水性决定了溶剂与固定相之间的相互作用力。
当亲疏水性强的物质进入移动相后，相互作用力较弱，从而更容易通过固定相。
在实际应用中，疏水层析常用于分离极性较强的化合物，如多肽、核苷酸、脂肪酸等。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
总而言之，疏水层析利用样品与固定相之间亲疏水性差异实现分离。
疏水性强的物质在固定相上停留时间较长，而疏水性弱的物质则更容易通过固定相。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
疏水层析
生物大分子的分离与表征第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第3章、色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术A)疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术。
从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)。
非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应 (Hydrophobic effect) 。
疏水作用(hydrophobic interaction):非极性分子进入水中，有 聚集在一起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。
最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果。
就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌 酶。
最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。
最亲水部 分显示在深蓝色的,更少的亲 水部分是浅蓝色。
1.2、疏水层析原理A)B)高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。
疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。
在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。
盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理◦ 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)；◦ 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基；◦ 高盐作用。
疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。
疏水作用层析
第二部分 药学生化实验实验一. 疏水作用层析【实验目的】通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
【实验原理】疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 结构示意图如下。
O CH 2CH CH 2O OH【实验材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm ）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计2．实验试剂（1）疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow（2）溶液A ：0.1M Na 2HPO 4, pH7.0+ WP ：固相支持物L ：疏水性配体S ：蛋白质或多肽等生物大分子H ：疏水补丁W ：溶液中水分子P（3）溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4（4）蛋白质样品溶于溶液B【实验操作】1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
4 疏水层析
（二）吸附剂
根据基质的性质不同分为： 根据基质的性质不同分为： 1.亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖 1.亲水性吸附剂： 亲水性吸附剂 Sepharose） 配体有苯基和辛基化合物。 （Sepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成 特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统 特点：不耐压， 2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等， 2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等， 配体为苯基、辛基和烷基等， 配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合 特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析， 特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适 用于高压层析（ 用于高压层析（如HPLC等） 等
二、操作
1.制备层析柱 1.制备层析柱 2.加样与洗脱 2.加样与洗脱 3.层析柱再生 3.蛋白[2] ．
2．纯化苯丙氨酸裂解酶 ．
纯化钙调蛋白的流程图
纯化苯丙氨酸裂解酶
疏水层析的概念
疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction 疏水层析亦称疏水作用层析 chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看， ， 离纯化生命物质的机制来看， ，从分离纯化生命物质的机制来看 它也属于吸附层析一类 根据被分离组分分子表面的疏水残基与固定相的 根据被分离组分分子表面的疏水残基与固定相的疏水 疏水残基与固定相的疏水 配基之间结合力差异进行的层析分离方法 配基之间结合力差异进行的层析分离方法
一、基本原理
利用被分离组分分子表面的疏水补丁、（可逆） 利用被分离组分分子表面的疏水补丁、（可逆）变性 疏水补丁、（可逆 后暴露出的疏水残基， 后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的 疏水残基 疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱 之间的作用强弱， 疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱，依次用 从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分 高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分 离开
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疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC) 从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸 吸 附层析一类。 附层析 疏水层析和反相层析(reversed phase chromatography)分离 生命物质的依据是一致的，即: 视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力 疏水力差 疏水力 异性大小，将有效成分分离出来。
1．亲水性吸附剂 基质主要是： 交联琼脂糖(Sepharose CL-4B) 配体是： 苯基或辛基化合物 基质与配体通过耦合方法构成稳定的 苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂
2．非亲水性吸附剂 基质有： 硅胶、树脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等 配体为：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等。 二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。
(如上所述，加1mol／L(NH2)2SO4 或2mol／LNaCl，以使样品中的 有效成分变性，并能与固定相很好地相互吸附。)
把此样品溶液徐徐加入固定相(使有效成分与固定相之 间作用0.5-1h)后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐 浓度的平衡缓冲溶液洗脱， 与此同时，要用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液， 并对收集的每部分溶液进行检测。 固定相进行再生处理后可重复使用。
二、吸附剂
固定相 由基质 配体 基质和配体 基质 配体(疏水性基团)两部分构成。 配体对疏水性 疏水性物质具有一定的吸附力 吸附力。 疏水性 吸附力 基质则有亲水性和非亲水性之分。 亲水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成 的固定相，称亲水性吸附剂。 疏水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成 的固定相，称疏水性吸附剂。
第二节 操作与应用
一、层析柱的制备 1．层析柱规格 所使用层析柱之规格与普通层析的相似 2．固定相 在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)Sepharose Cl-4B吸附剂作固定相。 苯基-Sepharose Cl-4B适合于分离纯化与芳香族化合物 具有亲和力的物质。 辛基-SepharoseCl-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的 物质新鲜鸡胗(除去结缔组织)切成1cm3小块， 置组织捣碎机中，加2倍于固形物体积的缓冲液(50mmol／L TrisHCl，pH8.0，2mmol／L EDTA，1mmol／Lα-巯基乙醇)高速匀浆三 次(30s／次)， 离心(8000 r／min，4℃，0.5h)收集鸡胗钙调蛋白抽提液(沉淀重 复抽提一次)，合并抽提液， 加硫酸铵盐析(pH8.0，60％饱和度)，除去大量杂蛋白， 上清液采用等电点沉淀(用H2S04调pH=4.0)，离心收集含有效成分 的沉淀物， 加蒸馏水悬浮，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)调pH=7.5～8.0，令其 缓慢溶解， 经透析，离心得到溶液
上阴离子DEAE-Sephadex A50层析柱(pH8.0)（离子交换 层析）， 用 梯 度 缓 冲 液 ( 1 0 mmol／Ltris-HCl，pH8.0-0.2mol／L NaCl1mmol／L EDTA-1mmol／Lα- 巯 基 乙 醇 ， 盐 浓 度 变 化 范 围 为 0.2~0.7mol／L NaCl)洗脱，
通过分部收集和活性测定，合并有效成分溶液进行疏水 层析。 此层析用的固定相为苯基-Sepharose CL-4B，用其纯 化钙调蛋白的流程见图4-1。
CaCl2
疏水层析 (所用基质的性能与反相层析不同)： 与基质结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白 蛋白 质及其复合物仅产生温和的吸附作用，吸附物 容易被解析下来。 故，较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的 物质。 这不仅使有效成分的纯度得到提高，而且还保 持了其原来的结构和生物活性。
第一节 基本原理
一、疏水作用 就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性 残基数是从外向内逐步增加的。 一般球形蛋白和膜蛋白的结构均较稳定，在很 大程度上是取决于分子中的疏水性作用。
也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用 高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。 当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的 物质才会随后被洗下来。 （相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来
疏水作用强的物质随后被洗下来）
对于疏水性很强 疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适 疏水性很强 降低极性才能达到解吸附的目的。 量有机溶剂降低极性 降低极性
反相层析： 与基质结合的配体密度大 疏水性强 密度大，疏水性强 密度大 疏水性强，对蛋白 质类物质具有较大的吸附力； 欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂 机溶剂的流动 机溶剂 相(降低极性)洗脱，方可见效。 洗脱液的极性 极性降低，常常会引起大分子活性物 极性 质变性， 因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量 的肽类 辅基 肽类和辅基 肽类 辅基等物质。
3．装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于 乙醇溶液中，浸泡一段时间； 采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物； 并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中； 尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕， 即可加样。
二、加样与洗脱
加样前，在样品溶液中要补加适量的盐类。
亲水性强的蛋白质 蛋白质与疏水性固定相结合作用原理 固定相结合作用原理 蛋白质 固定相 一是:靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)； 二是:令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基； 三是:高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 高 下，暴露于分子表面的疏水性残基 疏水性残基 疏水性固定 疏水性残基才能与疏水性固定 疏水性 相作用(这与普通吸附层析和离子交换层析的操作是绝然不同
的)。
一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐 溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性 溶液 可逆性 变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起， 变性 然后通过降低 降低流动相的离子强度 离子强度，即可将结合于固定 降低 离子强度 相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附 进行解吸附。 进行解吸附