第8章 疏水层析
第八节 疏水层析法
盐析作用增强
洗脱作用增强
排在最左边的离子或盐，盐析作用最强， 洗脱能力最弱；排在最右边的离子或盐， 洗脱能力最强，盐析作用最弱。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分 离 后 蛋 白 质 的 活 性 都 很 重 要 。 (NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl和磷酸盐是疏水层 析分离常用的几种盐。
例如某些蛋白质在水溶液中溶解度很大，分子 的极性较大；在高盐溶液中疏水性明显增大， 溶解度降低，出现盐析现象；在低盐溶液中疏 水性减小，溶解度增大。 因此疏水层析可以通过改变盐溶液的离子强度、 控制蛋白质分子的极性或非极性，使样品中极 性相近的蛋白质组分形成具有一定差异的疏水 分子，然后利用它们之间的疏水特性进行层析 分离。
在分离过程中，溶液中的疏水分子经过疏水层析
介质时，介质上的疏水配基即与它们发生亲和吸
附作用，疏水分子被吸附在介质的配基上面，这
种吸附力的强弱与疏水分子的疏水性大小相关，
疏水性大（极性小）的组分吸附力强，疏水性小 （极性大）的组分吸附力弱，通过改变洗脱液的 盐-水比例，改变其极性，使吸附在固定相上的 不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下
多缓冲离子交换剂可利用普通的凝胶过滤介质偶 联特殊的离子交换基制备，如Amersham Biosciences公司生产的Polybuffer exchanger PBE系列（PBE118和94）即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte匹配 使用，后者与Polybuffer 96和Polybuffer 74匹 配使用。Amersham Biosciences生产的另一种 多缓冲离子交换剂为Mono P，其离子交换基为 具有不同pKa值的弱碱性氨基。Mono P可与上述 三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅l0um，用作高效 色谱聚焦柱的固定相。
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
下面是疏水层析的标准操作规程，供参考：一、实验前的准备工作1. 根据实验目的，选择合适的疏水相和适宜的反相色谱柱，并进行校准。
2. 配制高纯度的溶剂，保证溶剂的质量，并按照方法要求调节溶剂的pH值。
3. 确保色谱仪及其相关设备准备就绪，包括流速泵、样品自动进样器、检测器等。
二、样品的处理1. 准备样品溶液，并通过过滤或离心将悬浮物去除，以保证样品的纯度。
2. 根据样品特性选择合适的提取方法，如溶剂萃取、固相萃取等。
3. 根据实验要求，进行必要的前处理，如稀释、酸化、碱化等。
三、系统的初始设置1. 对色谱系统进行初始设置，包括流速、检测器的温度、波长等。
2. 开始预洗柱，选择合适的洗柱溶剂，将样品进样口与引入口连接，设置洗柱时间。
四、方法的优化和验证1. 选择合适的进样量和洗柱时间，确定最佳的色谱条件。
2. 根据样品的复杂程度，适当调整固定相的选择和柱温。
3. 针对不同样品进行方法验证，包括线性度、准确度、精密度等指标的验证。
五、正式实验过程1. 将样品进样器与色谱仪连接，并设置好进样量和进样速度。
2. 开始注入样品，根据方法要求选择适当的流速，并同时进行监测。
3. 在实验过程中，密切注意流速、柱温和检测器的响应。
六、数据处理和结果分析1. 对实验结果进行数据处理，包括峰面积的计算、峰高的测量等。
2. 根据标准曲线或参考物质进行定量分析，计算样品中目标物质的含量。
3. 分析结果的统计学处理，包括平均值、相对标准偏差等指标的计算。
七、实验结束后的工作1. 关闭色谱仪及相关设备，清洁色谱柱和进样器，并存储在适当的环境中。
2. 处理实验废液和废物，保证环境安全和实验室的整洁。
3. 归档实验数据和结果，记录实验过程中的问题和改进方向。
疏水层析标准操作规程需要根据具体实验目的和方法要求进行调整，上述只是一个基本的操作指南，希望对您有所帮助。
疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤
疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤原理在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。
当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。
这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。
苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。
疏水相互作用介质苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。
因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。
所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。
温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10~100mg∕ml)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。
材料与仪器蛋白质样品液苯基琼脂糖CL-4BNaCl硫酸铉磷酸钠盐层析柱步骤下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。
1.装填5ml苯基琼脂糖CL-4B进入柱内；2.10倍柱床体积层析缓冲液(20mmol∕L,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱；3.调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。
上样总蛋白量200-500mg；4.3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线；5.用分步梯度法洗脱。
每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱；6.再依次用5倍体积水、5倍体积1mol/LNaCl和5倍体积水洗柱，使其获得再生。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是指在一定容器中，注入一种聚合物（称为疏水层），使存在于容器中的大分子物质或小分子物质（即分子群）在这种聚合物中分离，利用多种技术获得分析结果。
这种实验具有快速、精确度高、能优化性能等优点，是许多研究领域中用于分子析的有效工具。
它的原理是：当疏水层溶液通道中注入溶液时，溶液中的成分根据大小、重量等不同的性质在聚合物中以不同的比例运行，并分别形成两个物质带来的极性差异，从而使它们在聚合物中分离，从而实现分子分析检测。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
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二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
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疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
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4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
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5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
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三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
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四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是一种常用的色谱分析技术，其原理基于样品分离时固定相与移动相之间的亲疏水性差异。
疏水层析中，固定相通常是一种非极性材料，如疏水性树脂或疏水性硅胶。
移动相则是一种有机溶剂，如甲醇或乙腈，其疏水性介于固定相和要分离的样品之间。
在疏水层析柱中，样品溶液由于亲疏水性差异而与固定相发生不同程度的相互作用。
亲疏水性强的物质会与固定相发生较强的相互作用，停留时间相对较长，而亲疏水性弱的物质则会较快地通过固定相，停留时间较短。
疏水层析的分离原理可解释为两种相互竞争的作用力。
一方面，固定相表面具有较大的亲疏水性，使得亲疏水性强的物质更容易与其发生相互作用，并在固定相上停留。
另一方面，移动相中的有机溶剂对固定相表面也有一定的亲疏水性，这种亲疏水性决定了溶剂与固定相之间的相互作用力。
当亲疏水性强的物质进入移动相后，相互作用力较弱，从而更容易通过固定相。
在实际应用中，疏水层析常用于分离极性较强的化合物，如多肽、核苷酸、脂肪酸等。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
总而言之，疏水层析利用样品与固定相之间亲疏水性差异实现分离。
疏水性强的物质在固定相上停留时间较长，而疏水性弱的物质则更容易通过固定相。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
疏水层析填料
2008-6 Volume 8疏水层析填料疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）色谱柱：8.2 x 150 mm柱体积：8 ml流动相：2.0 – 0.0MAmmonium Sulfatein 0.01M phosphate, pH 7.0流速：1.32 ml/min样品：5 mg/3 ml– 100 µl2008-6 Volume 8Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。
Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
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第八章 疏水层析
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.2 流动相 流动相Ph
• 行为复杂；
• 多数情况下pH升高会减弱疏水作用，反之则增加；
• 洗脱时可不断提高Ph。
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8.1.1.1 什么是疏水性、疏水作用？
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常小 ，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)，这些非极性的分子在水相环境中具有 避开水而相互聚集的倾向，称为疏水作用。
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8
盐类的存在对蛋白质的疏水作用起道非常重要的作用。 • 高盐时，盐离子夺取疏水分子周围的水分子，疏 水区域受到水分子的挤压力减弱，疏水区域的面 积增大，促进蛋白质疏水区域与介质间的疏水作 用（更有效地与介质上的疏水基团结合）；
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8.2.2 常见疏水作用介质的种类
烷nhui University of Technology and Science
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8.1.1基本概念
疏水层析(hydrophobic interaction chromatography,HIC),是
采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水
溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质的差异而
与固定相间疏水相互作用的强弱不同而实现的层析方
法。
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疏水作用层析过程 Pr表面的疏水残基；或Pr局部变性，暴露疏水残基 （高盐）；
高盐浓度下Pr疏水表面与固定相结合；
洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出；盐浓度低 ，疏水强的Pr后流出。
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极性侧链和疏水性的非极性侧链.水介质中球状蛋白质
的折叠总是倾向于把多肽链的疏水性侧链或疏水性基
团埋藏在分子的内部。这一现象被称之为生物分子的
疏水作用。疏水作用的本质是疏水基团或疏水侧链出
自避开水的需要而被迫相互靠近的缘故。
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第三节 疏水作用层析实验技术
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8.1.2.1 固定相 取代程度的高低决定着介质的结合容量和疏水强度
•取代度较低时，介质对蛋白质的结合容量小；取代 度提高，结合容量大；
•原因：配基的数量增加使得蛋白质在介质表面的结 合位点增多。
•达到表面饱和结合容量后，取代度的进一步上升会 使每个蛋白质发生作用的配基数量增加，结合力太牢 固，难以洗脱。
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8.2.1 基本结构
配基与连接
•C8以下的烷基、苯基；
•用于HIC 介质的疏水配基很多,如羟丙基、丙基 、苄基、异丙基、苯基、戊基、辛基。
•配基通过稳定的非离子键(如醚键)与基质结合， 见图P201。
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•表面可供衍生的基团少，pH稳定性较差（2~8 ）；
•聚合物包裹克服上述缺点，得以广发应用。
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8.1.1.3 生物分子与疏水作用层析介质间的相互作用 • 二者在水溶液中均被水分子挤迫而可以彼此聚集（“
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.1 固定相 疏水配基的种类
疏水配基的种类直接决定着目标分子在层析时的选择 性，是疏水作用介质选择时首先要考虑的问题；
•烷基：与溶质间显示出单纯的疏水作用，其链长决 定疏水性的强弱（随链长的增加而增加），同时影 响着介质的结合容量（随链长的增加而增加）；
• 降低盐浓度，减弱了蛋白质—介质疏水基团的疏 水作用，发生解吸。
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• 这些暴露在外的疏水基团与介质上的疏水性配基发生
疏水性作用，被固定相吸附.
• 高盐下吸附，逐渐降低洗脱液盐浓度时，疏水性不同
的组分被先后洗脱下来。
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8.1.1.2 生物分子（蛋白质）疏水作用
但是，对球状蛋白质分子来说，真正能被包裹在内部的
氨基酸侧链仅占总氨基酸侧链的20%左右，其余80%的
侧链部分或完全暴露在分子表面，其中的疏水残基对于
盐浓度
•增加疏水作用盐类 •高盐：起始阶段，蛋白质结
•促溶盐类 •常用盐类，Na2SO4、
NaCl和(NH4)2SO4
合量线形增加，达到特定盐 浓度后，指数增加，部分沉 淀，不利于选择性；
•既要大的结合量，又要避免
极高盐浓度导致的沉淀。
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.3 层析条件 温度
•影响复杂：疏水作用随温度的升高而增强；但温度升 高对蛋白质构象和溶解性产生影响；
•执行特定的层析任务时，维持一个恒定的温度。
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第二节 疏水作用层析介质
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水溶液中的水分子就有被迫避让的效应。这种效应的即
疏水作用，其强弱取决于疏水基团的数量（越多），疏
水区域的面积（越大），则疏水作用越强。
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吸附而彼此结合”），混合组分中不同的蛋白质分子 与介质间的疏水作用强弱不同。
• 改变蛋白质分子的疏水性，从而改变其余介质的结合 能力，混合组分中的各部分按其与介质结合能力的差 异而被先后洗脱下来。
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8.2.1 基本结构 作为骨架的基质+参与疏水作用的配基
基质 琼脂糖类凝胶
• 亲水性强，表面羟基密度大，衍生化后可产生取代程 度和结合容量较大的介质；
• 大孔结构可容纳体积很大的分子，适合蛋白质大分子 的分离。
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.3 层析条件 流速