第09章 疏水层析
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
下面是疏水层析的标准操作规程，供参考：一、实验前的准备工作1. 根据实验目的，选择合适的疏水相和适宜的反相色谱柱，并进行校准。
2. 配制高纯度的溶剂，保证溶剂的质量，并按照方法要求调节溶剂的pH值。
3. 确保色谱仪及其相关设备准备就绪，包括流速泵、样品自动进样器、检测器等。
二、样品的处理1. 准备样品溶液，并通过过滤或离心将悬浮物去除，以保证样品的纯度。
2. 根据样品特性选择合适的提取方法，如溶剂萃取、固相萃取等。
3. 根据实验要求，进行必要的前处理，如稀释、酸化、碱化等。
三、系统的初始设置1. 对色谱系统进行初始设置，包括流速、检测器的温度、波长等。
2. 开始预洗柱，选择合适的洗柱溶剂，将样品进样口与引入口连接，设置洗柱时间。
四、方法的优化和验证1. 选择合适的进样量和洗柱时间，确定最佳的色谱条件。
2. 根据样品的复杂程度，适当调整固定相的选择和柱温。
3. 针对不同样品进行方法验证，包括线性度、准确度、精密度等指标的验证。
五、正式实验过程1. 将样品进样器与色谱仪连接，并设置好进样量和进样速度。
2. 开始注入样品，根据方法要求选择适当的流速，并同时进行监测。
3. 在实验过程中，密切注意流速、柱温和检测器的响应。
六、数据处理和结果分析1. 对实验结果进行数据处理，包括峰面积的计算、峰高的测量等。
2. 根据标准曲线或参考物质进行定量分析，计算样品中目标物质的含量。
3. 分析结果的统计学处理，包括平均值、相对标准偏差等指标的计算。
七、实验结束后的工作1. 关闭色谱仪及相关设备，清洁色谱柱和进样器，并存储在适当的环境中。
2. 处理实验废液和废物，保证环境安全和实验室的整洁。
3. 归档实验数据和结果，记录实验过程中的问题和改进方向。
疏水层析标准操作规程需要根据具体实验目的和方法要求进行调整，上述只是一个基本的操作指南，希望对您有所帮助。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是指在一定容器中，注入一种聚合物（称为疏水层），使存在于容器中的大分子物质或小分子物质（即分子群）在这种聚合物中分离，利用多种技术获得分析结果。
这种实验具有快速、精确度高、能优化性能等优点，是许多研究领域中用于分子析的有效工具。
它的原理是：当疏水层溶液通道中注入溶液时，溶液中的成分根据大小、重量等不同的性质在聚合物中以不同的比例运行，并分别形成两个物质带来的极性差异，从而使它们在聚合物中分离，从而实现分子分析检测。
疏水相互作用层析
疏水相互作用层析
液体分子中存在着由疏水相互作用层（hydrophobic interactions）引起的吸引力或者排斥力，即在表面上构成一个光滑的膜状结构，从而使相邻的分子能够彼此吸引。
疏水相互作用可分为氢键形成的疏水相互作用（hydrogen bonding）和电位效应（ion-pairing）。
氢键形成的疏水相互作用主要是由液体分子中的氢原子及其离子之间，形成氢键来构成的，这个相互作用层相对稳定，能够加强其他分子的相互结合作用，使其保持在稳定的状态中。
电位效应（ion-pairing）主要是由中性分子中离子（并非完全离子化）之间形成，它们之间不受静电力的影响，构成一个轻微的膜状结构，从而使分子之间产生互相吸引和排斥的作用力。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
生物大分子分离纯化技术
二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
生物大分子分离纯化技术
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
生物大分子分离纯化技术
4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
生物大分子分离纯化技术
5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
生物大分子分离纯化技术
三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
生物大分子分离纯化技术
四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是一种常用的色谱分析技术，其原理基于样品分离时固定相与移动相之间的亲疏水性差异。
疏水层析中，固定相通常是一种非极性材料，如疏水性树脂或疏水性硅胶。
移动相则是一种有机溶剂，如甲醇或乙腈，其疏水性介于固定相和要分离的样品之间。
在疏水层析柱中，样品溶液由于亲疏水性差异而与固定相发生不同程度的相互作用。
亲疏水性强的物质会与固定相发生较强的相互作用，停留时间相对较长，而亲疏水性弱的物质则会较快地通过固定相，停留时间较短。
疏水层析的分离原理可解释为两种相互竞争的作用力。
一方面，固定相表面具有较大的亲疏水性，使得亲疏水性强的物质更容易与其发生相互作用，并在固定相上停留。
另一方面，移动相中的有机溶剂对固定相表面也有一定的亲疏水性，这种亲疏水性决定了溶剂与固定相之间的相互作用力。
当亲疏水性强的物质进入移动相后，相互作用力较弱，从而更容易通过固定相。
在实际应用中，疏水层析常用于分离极性较强的化合物，如多肽、核苷酸、脂肪酸等。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
总而言之，疏水层析利用样品与固定相之间亲疏水性差异实现分离。
疏水性强的物质在固定相上停留时间较长，而疏水性弱的物质则更容易通过固定相。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
疏水作用层析
疏水作用层析1. 疏水层析的原理：疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
由于蛋白质是一类有序三维结构的活性大分子，但其空间排列很容易受到外界环境的影响，极易从有序的结构变成无序结构。
当立体结构发生变化时，常常失去原有的活性，即蛋白质的失活。
使用适度疏水性的分离介质，在含盐的水溶液体系中，借助于分离介质与蛋白质分子之间的疏水作用达到吸附活性蛋白分子的目的，这种层析技术称为疏水作用层析。
蛋白质的一级结构中有很多非极性氨基酸，这些氨基酸在三级结构上由于疏水相互作用会被尽量包在分子内部，但是仍不可避免地有一些非极性侧链暴露在表面，这些非极性的表面是它和疏水层析介质作用的结合部位。
因为蛋白质分子的疏水性不同，它们和疏水层析介质的作用力强弱也不同，所以非极性表面的大小和含量决定了蛋白质分子的疏水性强弱。
疏水层析就是利用各种蛋白质分子和疏水功能基团之间作用力的差异对蛋白质进行分离、纯化的一种技术。
蛋白质可以看成是一种有亲水性外壳包裹着疏水性核心的四级结构的复杂体系。
蛋白质表面存在一些非极性的疏水基团，这些基团多为非极性的氨基酸残基。
由于各种基团疏水性的差别、疏水基团暴露数量的不同、疏水区与亲水区在数量、大小和分布的不同等因素，使各种蛋白质之间存在较大的差异，同时，对于同一种蛋白质在不同的溶液中，使疏水基团暴露的程度也呈现出一定的差异。
由于这种差异，致使各种蛋白质分子与同一种分离介质疏水基团的相互作用不同，吸附能力不同，可以达到分离的目的。
如果在水溶液中加入中性盐，使溶液处于高盐浓度时，可以破坏蛋白质分子表面水分子的有序排列，使大分子与分离介质的功能基团之间产生疏水作用。
同时，由于高盐的存在，使蛋白质分子的疏水基团暴露增多，增加了大分子的疏水性，增强了蛋白质分子与分离介质功能基团之间的疏水作用，相互结合力增强。
丁基疏水层析
丁基疏水层析
丁基疏水层析是一种层析技术，常用于化学分离和纯化的过程中。
它基于化合物在不同疏水性条件下的亲/疏水性差异，通
过溶剂的选择和控制来实现分离。
丁基疏水层析的原理是基于多相液体的分配平衡。
样品在两种液体相（一般是水和有机溶剂）之间分配，并根据其相对亲/
疏水性来决定在哪个相中停留。
疏水性较弱的化合物更容易溶解在有机溶剂中，而亲水性较强的化合物则更容易溶解在水相中。
在丁基疏水层析中，通常使用一个丁基（C4）疏水基团作为
固定相。
这个疏水基团可以与样品中的疏水性化合物相互作用，从而实现分离。
在分离过程中，样品先通过预处理步骤将目标化合物固定在丁基固相上，然后使用适当的洗脱剂洗脱出目标化合物。
洗脱剂一般为疏水性较弱的有机溶剂，可以根据目标化合物的亲/疏水性来选择。
丁基疏水层析具有简单、快速和高效的特点，广泛应用于化学、生物和制药领域的分离和纯化过程中。
它可以用于分离和纯化天然产物、蛋白质、多肽、核酸和其他有机物等。
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Non-bound proteins
Elution
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Abs Conc. salt Target elutes
Elution
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Abs Conc. salt More strongly bound proteins
patch)；
令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴
露出掩藏于分子内的疏水性残基；
高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓
度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏
水性固定相作用。
一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物 质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏 水的固定相结合在一起。 然后通过降低流动相的离子强度，即可将 结合于固定相的物质，按其结合能力大小， 依次进行解吸附。
9.5、疏水层析的应用
1、多种生物大分子的分离纯化。
2、去除DNA。
在用基因工程生产的各种药物中,世界卫生组织 (WHO) 规定药物中DNA 的残留量应低于100pg/ml。 利用HIC纯化技术则可以有效地除去残留的DNA ,因 为在DNA的结构中几乎不存在疏水区域,因此难以和 疏水色谱填料结合而被除去。
加样
在进行任何疏水相互作用层析前， 需确定样品的“盐稳定范围”。比如， 加入逐步增加的盐至粗提物中，用来确 定蛋白沉淀发生的浓度。确认样品在上 样到柱子时低于该盐浓度，以避免沉淀。
样品制备：建立盐溶解性范围后，从最高的能够 保持生物学活力而不发生沉淀问题的盐浓度开始。
调节样品到起始缓冲液的盐浓度来促进疏水相互 作用。使用高浓度的储液调节盐浓度，以避免由 于加入固体盐时局部盐浓度过高而造成沉淀。直 接调节样品的pH。由于疏水相互作用对pH不是 非常敏感，不需要完全的缓冲液交换。
四、层析步骤
平衡 ↓ 上样 ↓ 平衡除杂 ↓ 洗脱
Equilibration
1. Equilibration
2. Sample application 3. Washing 4. Elution Water molecules
Gel matrix
Hydrophobic ligand
Equilibrate the column and adjust the sample to binding conditions
A)
B)
高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。 疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。 在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理
靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic
其分子中的疏水性残基数是从
外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包
埋在球形蛋白内部，有些则暴
露在外，在蛋白质表面形成疏
疏水和亲水部件表面的溶菌酶。 最疏水部分是深红色,浅红色的更少的 疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的, 更少的亲水部分是浅蓝色。
水区域，这部分暴露在外疏水
性基团称为疏水补丁。
9.2、疏水层析原理
生物活性分子的分离与表征
第二部分 分离技术
第3章、沉淀法 第4章、吸附层析 第5章、纸层析 第6章、凝胶过滤层析 第7章、离子交换层析 第8章、亲和层析
第9章、疏水层析
第9章
疏水层析
Hydrophobic Interaction Chromatography
9.1、概述 9.2、疏水层析原理 9.3、疏水层析介质 9.4、疏水层析实验技术 9.5、疏水层析的应用 9.6、反相层析
由于沉淀引起的产量丢失。
图23 起始溶液中的盐浓度影响选择性和分辨率。
三、缓冲液
对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致
关重要。最经常使用磷酸缓冲液。
pH 的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。
然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5
对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。
pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或
也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用
高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐 溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后 被洗下来。（相同盐浓度下，疏水作用弱的物
质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下 来）
对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加
适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。
高浓度下，蛋白稳定性的问题可能会阻碍 它的应用。
图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱： 细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、α-糜蛋白酶原。
如果目的分子洗脱得太晚或根本不洗脱，
或者不能更换到不同的填料，尝试使用50% 的盐浓度结合。
有些蛋白在高盐浓度下开始沉淀。起始缓 冲液中的盐浓度需要降低以避免在运行中 的沉淀。重复的以小量上样也能帮助避免
在实践中，钠、或铵的硫酸盐有效的促 进在疏水相互作用层析中配基-蛋白相互作用， 在蛋白质结构上有稳定作用。 因此，最常用的盐：Na2SO4、NaCl和 (NH4)2SO4 。
在给定的浓度下，和其它的盐相比，硫酸
铵能够给出最好的分辨率，但在pH高于8.0 的情况下不推荐使用。
硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在
层析介质最终的选择性、结合能力起到重要
的作用。
配基的种类和目的蛋白 的性质在确定疏水相互作用 层析的选择性方面是高度显 著的参数。最合适的配基必 须通过用目的蛋白进行筛选 试验来确定。 图21 在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗 体相互作用不同。
总的来说， 疏水相互作用填料可以根 据它们和样品组分的相互作用分为两类。 直链烷基（丁基，辛基，醚基，异丙基） 显示一个纯的疏水性质，而芳香基配基 （苯基）显示混合型性质，包括芳香性和 疏水性相互作用。 在进行常压疏水层析时，大多数是选 用苯基(或辛基)-Sepharose CL-4B吸附剂 作固定相。
克/毫升。
保证样品，柱子，起始和洗脱缓冲液都在同样 的温度。
大多数条件下，增高温度会增强疏水相互作用，所以 在更低的温度工作（通常低于10度）能够使由于疏水 相互作用而导致的样品组分间的聚集最小化。降低温 度可以作为通过加入去垢剂来提高可溶性的替代方案。
洗脱
（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）。 （2）通过往流动相中添加有机溶剂，如：乙二醇、丙 醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂 中稳定性良好的物质）。 （3）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能与介质 发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换 下来 （分离膜蛋白）。
疏水效应
疏水作用(hydrophobic interaction):
非极性分子进入水中，有
聚集在一起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包
埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的
热动力学折衷的结果。
就球形蛋白质的结构而言，
在上样前用简单的步骤净化所有的样品，这样可
以避免堵柱子的风险，减少强力清洗步骤的需要， 避免柱子性能的破坏和柱压的增加。
黏度随着温度而变化，在高盐浓度下会增加。
样品的可溶性或黏度可能会影响柱子的上样量。 高样品黏度导致畸变的流速样式，最终导致变 宽的、破坏的峰和压力问题。
稀释粘稠的样品。如果不能稀释，用更低些的 盐浓度或具有更大颗粒大小的填料可能会帮助 克服黏度问题。样品浓度通常应该不超过50毫
9.1、概述
疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析，
是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与
流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合 而进行分离的层析技术。 从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解 度非常小，与水混合时会形成互不相溶的两相， 即非极性分子有离开水相进入非极性相的趋势， 即所谓的疏水性(Hydrophobicity)。 非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效 应(Hydrophobic effect) 。
二、盐的选择
在疏水相互作用层析中，结合过程比洗脱
过程更具有选择性。所以，优化起始缓冲 液的条件很重要。正确选择的盐种类和浓 度是影响载量和最终选择性的最重要参数。 往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐， 有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。 随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上 的蛋白质量也相应提高 。
偶联至基质的常见配基类型
（A）丁基
（B）辛基 （C）苯基 （D）新戊基
对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力 太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具 中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等) 不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。
常用商品化疏水层析介质
1. Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14， 工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50μmol 正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配 体的生物分子。 2. Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作 的最大速度是600cm/h,配基结合量为每 ml50μmol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋 白的分离和纯化。
低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。
添加剂可以用来改善选择性和分辨率。
例如，样品和疏水相互作用层析填料结合太紧
时。然而，如果在高浓度使用，就有使目的蛋