10生物电分析化学全解

a)吸附法
这是一种最为简单的方法，即通过物理吸附(基于离 子的、极性的、氢键、亲油性、-电子作用等作用力) 或化学吸附(基于化学反应的分子自组装膜， Selfassembly monolayer, SAM)将酶固定在基体上。 由于没有试剂参与固定过程及这些载体对酶良好的 亲和性，该方法最大的优点是生物活性高。然而由于 吸附是一个可逆的过程，该方法制备的生物传感器对 pH、温度、离子强度、底物浓度很敏感，这些因素可 能会导致酶的脱落。
diffusional mediator Immobilization mediator
与第一代传感器相比，媒介体生物传感器主要优势在于： (i)测量受氧影响小； (ii) 酶电极的工作电位由媒介体的氧化电位调节，即可以 在较低电位下检测以避免其它物质的干扰。 早先是一些水溶性的无机或有机化合物如铁氰化物和醌 用来作为电子媒介体。 近年来应用比较多的电子媒介体有二茂铁及其衍生物、 四硫富瓦烯类、TCNQ类、有机导电盐类、醌类、铁/亚 铁氰化物类等
电子转移机理
葡萄糖在电极上的安培响应
• Hydrodynamic voltammograms
Each 2 mM
• 线性范围: 0.1-30 mM，灵敏度为340 nA mM-1 • 检测限: 0.03 mM (S/N=3)。
c)第三代生物传感器
理想的第三代生物传感器是在电极表面实现酶 与电极的直接电子传递,即: Ered = Eox + ne-
聚合物包埋
溶胶-凝胶法：溶胶－凝胶(sol - gel) 法是将金 属醇盐或无机盐溶于水或有机溶剂,在低温下通过 水解、聚合等化学反应,形成内含纳米粒子的溶 胶,再转化为具有一定空间结构的凝胶。然后经过 适当热处理或减压干燥,制备出相应的粉末、薄 膜和固体材料的方法。此法的优点是反应过程易 控制,处理温度低,粒径分布窄,纯度高,纳米颗粒分 散均匀。但成本昂贵,周期长,产量小,热处理时易 团聚且污染环境,难以实现工业化生产。
FAD氧化还原中心的氧化还原反应过程，醌类酶的活 性基团是吡咯并喹啉醌 。
许多氧化还原酶的酶促反应都有一种辅助底物(Cosubstrate)的参与。这类物质包括O2、H2O2、ATP、 NAD+/NADH及NADP+/NADPH，起着电子受体的 作用。与酶对其主要底物的高选择性不同，酶促反 应对辅助底物的选择性很低，因而可以用具有良好 电化学性能的人工合成试剂(如电子媒介体和中继 体)代替辅助底物，从而获得期望的目的。正由于 这些特征，氧化还原酶被广泛用来制备安培型生物 传感器。
（3）膜现象控制着离子、分子及其 它物质从细胞外部向内部或逆向传输， 离子有方向性的运动造成了跨膜电位 差，调节着一系列的物质运输。
（4）生物体所需的信息过程几乎都 是通过电信号方式发生的，出现一系 列电生现象，包括视觉、动作、痛觉、 热刺激、饥饿和干渴感等等。
（5）用一定周期和幅度的适当电 脉冲在膜中生产膜孔，使物质更容 易跨膜转移，有可能实现细胞融合 和基因摄取。
Ep no change Ip υ
• CV of a PVI-PAA-Os/GOD film . • Potential scan rate: 5, 10, 20, 50,100, 200 mV s-1
复合膜对葡萄糖的电催化
• a) No glucose • b) 10 m mol L-1 glucose
生物电分析化学 ( Bioelectroanalytical Chemistry)
一、引言
今日的生物电分析化学已经涉及到不同领 域的生物学问题，主要是： （1）在生物体内进行的绝大部分化学反应 都是氧化还原反应，例如为生命所需（营 养、组织生长、再生）进行的新陈代谢。 （2）光合作用，包括吸收分子的电子激 发过程。膜上产生的电子和质子转移过程 和代谢化学反应。
4. 安培（电流）型生物传感器
安培生物传感器是研究和应用最多的电化学 生物传感器，也是最为成功的生物传感器。 同电位法相比，安培检测更加灵敏、准确和 快速。安培试验所用的仪器也相对简单,记录 的是i-t曲线。
三、 生物传感原理
生物传感器是将生物活性物质如：器官、 组织、细胞、酶、抗体等生物物质与换能器 (Transducer)、电子放大器(Electronic amplifier) 直接结合，将受体与被检测分子发生的特定 生物化学反应转换成可检测的输出信号。
c) 共价键合法
该方法是通过共价键将酶分子与电极表面结合而固定 的方法，虽然这种方法操作较为困难，但由于提供了比较 稳定的固定化酶，因而已得到了较为普遍的应用。 共价键合法的主要缺点是酶在共价键合时可能会改变 酶的结构，因而共价键合酶的催化活性及稳定性会受到一 定程度的影响。
d) 交联法
通过双(多)功能团试剂将酶分子之间、酶分子与凝胶/ 聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定化。这种方法可 以克服酶电极在溶液中从电极表面泄漏的缺点。最常用的 交联剂是戊二醛，它能在温和条件下与酶蛋白上的-NH2残 基反应。惰性蛋白(如：牛血清蛋白，BAS)常用来形成酶 膜，因它含有丰富的赖氨基残基，易于和戊二醛作用形成 非水溶性的聚合物膜，同时也为酶分子提供了合适的微环 境，从而提高了测定灵敏度。
2. 电容型生物传感器
Newman于1986年首次报道用电容传感器直 接测定抗原-抗体的相互作用以来，该技术得 到了科技工作者的关注。这类传感器研究主 要集中在免疫电容生物传感器、酶电容生物 传感器、DNA电容生物传感器、分子印迹电 容生物传感器等方面。
3. 电位型生物传感器
电位型传感器是基于异相之间的界面电位 的变化。电位型生物传感器主要有两类: 一类是将离子选择电极和固定酶结合在一 起，能实现对被检测分子的高灵敏、高选择 性分析。 另一类电位型生物传感器是固定了酶、抗 体等生物组份的场效应晶体管
b) 包埋法
这是一种应用很普遍的酶固定化技术，该技术包括碳 糊包埋、溶胶-凝胶包埋、电化学聚合膜包埋等。溶胶-凝 胶包埋是将酶包埋并固定在一个聚合物三维空间网络结构 或孔状结构中，小分子物质能容易地渗透进来。 该方法的缺点是膜的孔径控制不好经常发生酶的泄漏 或对底物的扩散速率的消极影响。 ●碳糊包埋法一般是将酶直接固定在修饰电极材料中； ●溶胶-凝胶包埋使用金属醇盐（如TEOS）sol-gel膜； ●电化学聚合膜包埋包括导电聚合物包埋和非导电性聚合 物膜包埋。非导电性聚合物膜包埋主要包括聚苯酚、聚硝 基酚、聚β - 氨基乙基苯酚、间笨二酚、苯二胺和聚吲哚 等。
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2. 生物传感器的发展
根据酶与电极间电子转移机理,大致可将 酶安培生物传感器分为三代：
a)第一代生物传感器
第一代生物传感器是基于检测酶促反应产 物 ( 如：过氧化氢、 NADH) 的生成或辅助 底物 ( 如氧分子 ) 的消耗来实现对底物的测 定 ( 图 1-6A) ，因而据此可分为氧检测型、 过氧化氢检测型、NADH检测型等三种。
例:介体葡萄糖传感器的制备
PVI-PAA-Os/GOD复合膜的最佳成 膜条件是: PVI-PAA-Os： 0.5 mg mL -1 GOD ：0.5 mg mL -1 阶跃电位：0.7 V (2s)和-0.5 V (2s) 阶跃次数：35次。
PVI-PAA-Os/GOD膜共沉积机理
生物复合膜的电化学特性
第一代生物传感器具有如下局限性：
i)响应信号与氧浓度关系较大，氧分压的变化会对酶电极 产生明显影响； ii)氧分子也是氧化酶的底物，当溶解氧的浓度不是很高时， 难以对高浓度底物进行测定，从而导致线性范围过于狭窄； iii)酶促反应产生的过氧化氢浓度高时会使酶活性降低很多； iv)过氧化氢的测定通常在较高电位(一般在600mV左右)下 进行，许多还原性电活性物质会被氧化而产生干扰信号； v) NADH的氧化需要很高的过电位及氧化产物会对电极表 面发生聚合而毒化生物传感器。这些缺点限制了第一代生 物传感器的进一步推广和应用，于是导致了第二代传感器 的发展。
根据换能器转换的信号又可分为电化学生 物传感器、光学生物传感器、压电晶体生物 传感器、半导体生物传感器、介体生物传感 器及热敏生物传感器。电化学生物传感器是 这几种中发展最为广泛的。
生物传感器的结构
生物传感器的敏感识别模式
生物传感器的电子传递
1. 酶的种类及其电子转移性质
酶是一种由生命体合成的特殊化学催化剂，作 为催化剂其最显著特征是在温和条件下的高效 和专一性。酶通常由两个部份组成：一是脱辅 基酶蛋白 (Apoenzyme)；另一部份是非朊基基团 (Prosthetic group)，这部份在酶的催化反应中起 主要作用，是酶的活性中心(Active center)。按 其催化反应的性质，酶可分为氧化还原酶 (Oxidoreductase)、移换酶(Transferase)、水解酶 (Hydrolase)、裂合酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、 合成酶(Lligase)等六大类。
b) 第二代生物传感器 在第二代酶安培生物传感器中，一个人工合成的电子受体， 即媒介体被用来代替天然受体来传递酶电极间的电子。电子媒 介体是一种低分子量的具有氧化还原电对的分子，媒介体首先 与酶的还原态反应，然后扩散到电极表面发生快速的电子转移。 其电极反应过程如下： S + Eox = P + Ered Ered + Mox = Eox + Mred Mred = Mox + ne其中Mox、Mred分别为媒介体的氧化态和还原态。
（6）生物电化学方法对各种疾病 的治疗，涉及生物传感器、燃料电 池、人工心脏、电刺激和电麻醉、 食品控制、环境保护等方面的应用。
生物传感器所涉及的学科领域
Schemes for insulin therapy (胰岛素治疗）
二、生物传感器的分类
伏安/安培 压电(石英晶 体微天平)
电化学生 物传感器
三代生物传感器敏感机理对比
五、电极上酶的固定化方法
酶是酶传感器中的分子识别物质，因此酶在电极表面 固定是制备生物传感器的一个非常关键步骤，酶电极的成 功与否往往在很大程度上取决于酶的固定。理想的酶固定 方法应该满足以下三条标准： i)能保留酶的高活性； ii)酶固定层具有很好的稳定性，如：在一定pH范围内 不变性，在溶液中没有泄漏； iii)酶电极能对底物发生快速和灵敏的响应。 经过多年的研究，发展了许多基于物理的、化学的或 物理化学方法相结合的酶固定方法。
大部分酶安培生物传感器是在氧化还原酶的基础上发展的， 这是因为氧化还原酶和底物在酶促反应过程中发生了电子 转移。氧化还原酶又可细分为脱氢酶(Dehydrogenase)、氧 化酶(Oxidase)、还原酶(Reductase)、过氧(化)物酶 (Peroxidase)、氧酶(Oxygenase)、羟化酶(Hydroxylase)、触 酶(Catalase)等几种。通常根据其非朊基基团(活性中心)又 可分为含黄素(Flavin)类活性中心酶和含醌(Quinone)类活 性中心酶两类。黄素(Flavin)类酶包含约80种酶（如：葡 萄糖氧化酶和黄嘌呤氧化酶），其活性中心分别为黄素腺 嘌呤二核苷酸(Flavine adenine dinucleotide, FAD)或黄素单 核苷酸 (Flavin mononucleotide, FMN)，其中绝大多数是 FAD型酶。
电导
电位型
阻抗/电容 型
1.电导型生物传感器
许多生物/化学反应通常都伴随离子种类和数 量的变化，从而会导致电导率发生相应的改 变。基于此原理可以制备电导型传感器。 电导的测量通常被认为缺乏选择性，但是通 过选择性的生物识别，如特异性的酶促反应， 可克服这个局限。电导型生物传感器为现有 的生物传感器提供了一种有意义的选择。
戊二醛和BAS固定酶电极
Glucose oxidase catalysed oxidation of glucose: identification of measurement parameters for glucose assay.