10生物电分析化学全解

（3）膜现象控制着离子、分子及其 它物质从细胞外部向内部或逆向传输， 离子有方向性的运动造成了跨膜电位 差，调节着一系列的物质运输。
（4）生物体所需的信息过程几乎都 是通过电信号方式发生的，出现一系 列电生现象，包括视觉、动作、痛觉、 热刺激、饥饿和干渴感等等。
（5）用一定周期和幅度的适当电 脉冲在膜中生产膜孔，使物质更容 易跨膜转移，有可能实现细胞融合 和基因摄取。
生物电分析化学 ( Bioelectroanalytical Chemistry)
一、引言
今日的生物电分析化学已经涉及到不同领 域的生物学问题，主要是： （1）在生物体内进行的绝大部分化学反应 都是氧化还原反应，例如为生命所需（营 养、组织生长、再生）进行的新陈代谢。 （2）光合作用，包括吸收分子的电子激 发过程。膜上产生的电子和质子转移过程 和代谢化学反应。
电导
电位型
阻抗/电容 型
1.电导型生物传感器
许多生物/化学反应通常都伴随离子种类和数 量的变化，从而会导致电导率发生相应的改 变。基于此原理可以制备电导型传感器。 电导的测量通常被认为缺乏选择性，但是通 过选择性的生物识别，如特异性的酶促反应， 可克服这个局限。电导型生物传感器为现有 的生物传感器提供了一种有意义的选择。
例:介体葡萄糖传感器的制备
PVI-PAA-Os/GOD复合膜的最佳成 膜条件是: PVI-PAA-Os： 0.5 mg mL -1 GOD ：0.5 mg mL -1 阶跃电位：0.7 V (2s)和-0.5 V (2s) 阶跃次数：35次。
PVI-PAA-Os/GOD膜共沉积机理
生物复合膜的电化学特性
2. 生物传感器的发展
根据酶与电极间电子转移机理,大致可将 酶安培生物传感器分为三代：
a)第一代生物传感器
第一代生物传感器是基于检测酶促反应产 物 ( 如：过氧化氢、 NADH) 的生成或辅助 底物 ( 如氧分子 ) 的消耗来实现对底物的测 定 ( 图 1-6A) ，因而据此可分为氧检测型、 过氧化氢检测型、NADH检测型等三种。
2. 电容型生物传感器
Newman于1986年首次报道用电容传感器直 接测定抗原-抗体的相互作用以来，该技术得 到了科技工作者的关注。这类传感器研究主 要集中在免疫电容生物传感器、酶电容生物 传感器、DNA电容生物传感器、分子印迹电 容生物传感器等方面。
3. 电位型生物传感器
电位型传感器是基于异相之间的界面电位 的变化。电位型生物传感器主要有两类: 一类是将离子选择电极和固定酶结合在一 起，能实现对被检测分子的高灵敏、高选择 性分析。 另一类电位型生物传感器是固定了酶、抗 体等生物组份的场效应晶体管
FAD氧化还原中心的氧化还原反应过程，醌类酶的活 性基团是吡咯并喹啉醌 。
许多氧化还原酶的酶促反应都有一种辅助底物(Cosubstrate)的参与。这类物质包括O2、H2O2、ATP、 NAD+/NADH及NADP+/NADPH，起着电子受体的 作用。与酶对其主要底物的高选择性不同，酶促反 应对辅助底物的选择性很低，因而可以用具有良好 电化学性能的人工合成试剂(如电子媒介体和中继 体)代替辅助底物，从而获得期望的目的。正由于 这些特征，氧化还原酶被广泛用来制备安培型生物 传感器。
第一代生物传感器具有如下局限性：
i)响应信号与氧浓度关系较大，氧分压的变化会对酶电极 产生明显影响； ii)氧分子也是氧化酶的底物，当溶解氧的浓度不是很高时， 难以对高浓度底物进行测定，从而导致线性范围过于狭窄； iii)酶促反应产生的过氧化氢浓度高时会使酶活性降低很多； iv)过氧化氢的测定通常在较高电位(一般在600mV左右)下 进行，许多还原性电活性物质会被氧化而产生干扰信号； v) NADH的氧化需要很高的过电位及氧化产物会对电极表 面发生聚合而毒化生物传感器。这些缺点限制了第一代生 物传感器的进一步推广和应用，于是导致了第二代传感器 的发展。
Ep no change Ip υ
• CV of a PVI-PAA-Os/GOD film . • Potential scan rate: 5, 10, 20, 50,100, 200 mV s-1
复合膜对葡萄糖的电催化
• a) No glucose • b) 10 m mol L-1 glucose
戊二醛和BAS固定酶电极
Glucose oxidase catalysed oxidation of glucose: identification of measurement parameters for glucose assay.
b) 包埋法
这是一种应用很普遍的酶固定化技术，该技术包括碳 糊包埋、溶胶-凝胶包埋、电化学聚合膜包埋等。溶胶-凝 胶包埋是将酶包埋并固定在一个聚合物三维空间网络结构 或孔状结构中，小分子物质能容易地渗透进来。 该方法的缺点是膜的孔径控制不好经常发生酶的泄漏 或对底物的扩散速率的消极影响。 ●碳糊包埋法一般是将酶直接固定在修饰电极材料中； ●溶胶-凝胶包埋使用金属醇盐（如TEOS）sol-gel膜； ●电化学聚合膜包埋包括导电聚合物包埋和非导电性聚合 物膜包埋。非导电性聚合物膜包埋主要包括聚苯酚、聚硝 基酚、聚β - 氨基乙基苯酚、间笨二酚、苯二胺和聚吲哚 等。
4. 安培（电流）型生物传感器
安培生物传感器是研究和应用最多的电化学 生物传感器，也是最为成功的生物传感器。 同电位法相比，安培检测更加灵敏、准确和 快速。安培试验所用的仪器也相对简单,记录 的是i-t曲线。
三、 生物传感原理
生物传感器是将生物活性物质如：器官、 组织、细胞、酶、抗体等生物物质与换能器 (Transducer)、电子放大器(Electronic amplifier) 直接结合，将受体与被检测分子发生的特定 生物化学反应转换成可检测的输出信号。
diffusional mediator Immobilization mediator
与第一代传感器相比，媒介体生物传感器主要优势在于： (i)测量受氧影响小； (ii) 酶电极的工作电位由媒介体的氧化电位调节，即可以 在较低电位下检测以避免其它物质的干扰。 早先是一些水溶性的无机或有机化合物如铁氰化物和醌 用来作为电子媒介体。 近年来应用比较多的电子媒介体有二茂铁及其衍生物、 四硫富瓦烯类、TCNQ类、有机导电盐类、醌类、铁/亚 铁氰化物类等
a)吸附法
这是一种最为简单的方法，即通过物理吸附(基于离 子的、极性的、氢键、亲油性、-电子作用等作用力) 或化学吸附(基于化学反应的分子自组装膜， Selfassembly monolayer, SAM)将酶固定在基体上。 由于没有试剂参与固定过程及这些载体对酶良好的 亲和性，该方法最大的优点是生物活性高。然而由于 吸附是一个可逆的过程，该方法制备的生物传感器对 pH、温度、离子强度、底物浓度很敏感，这些因素可 能会导致酶的脱落。
（6）生物电化学方法对各种疾病 的治疗，涉及生物传感器、燃料电 池、人工心脏、电刺激和电麻醉、 食品控制、环境保护等方面的应用。
生物传感器所涉及的学科领域
Schemes for insulin therapy (胰岛素治疗）
二、生物传感器的分类
伏安/安培 压电(石英晶 体微天平)
电化学生 物传感器
b) 第二代生物传感器 在第二代酶安培生物传感器中，一个人工合成的电子受体， 即媒介体被用来代替天然受体来传递酶电极间的电子。电子媒 介体是一种低分子量的具有氧化还原电对的分子，媒介体首先 与酶的还原态反应，然后扩散到电极表面发生快速的电子转移。 其电极反应过程如下： S + Eox = P + Ered Ered + Mox = Eox + Mred Mred = Mox + ne其中Mox、Mred分别为媒介体的氧化态和还原态。
三代生物传感器敏感机理对比
五、电极上酶的固定化方法
酶是酶传感器中的分子识别物质，因此酶在电极表面 固定是制备生物传感器的一个非常关键步骤，酶电极的成 功与否往往在很大程度上取决于酶的固定。理想的酶固定 方法应该满足以下三条标准： i)能保留酶的高活性； ii)酶固定层具有很好的稳定性，如：在一定pH范围内 不变性，在溶液中没有泄漏； iii)酶电极能对底物发生快速和灵敏的响应。 经过多年的研究，发展了许多基于物理的、化学的或 物理化学方法相结合的酶固定方法。
c) 共价键合法
该方法是通过共价键将酶分子与电极表面结合而固定 的方法，虽然这种方法操作较为困难，但由于提供了比较 稳定的固定化酶，因而已得到了较为普遍的应用。 共价键合法的主要缺点是酶在共价键合时可能会改变 酶的结构，因而共价键合酶的催化活性及稳定性会受到一 定程度的影响。
d) 交联法
通过双(多)功能团试剂将酶分子之间、酶分子与凝胶/ 聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定化。这种方法可 以克服酶电极在溶液中从电极表面泄漏的缺点。最常用的 交联剂是戊二醛，它能在温和条件下与酶蛋白上的-NH2残 基反应。惰性蛋白(如：牛血清蛋白，BAS)常用来形成酶 膜，因它含有丰富的赖氨基残基，易于和戊二醛作用形成 非水溶性的聚合物膜，同时也为酶分子提供了合适的微环 境，从而提高了测定灵敏度。
电子转移机理
葡萄糖在电极上的安培响应
• Hydrodynamic voltammograms
Each 2 mM
• 线性范围: 0.1-30 mM，灵敏度为340 nA mM-1 • 检测限: 0.03 mM (S/N=3)。
c)第三代生物传感器
理想的第三代生物传感器是在电极表面实现酶 与电极的直接电子传递,即: Ered = Eox + ne-
大部分酶安培生物传感器是在氧化还原酶的基础上发展的， 这是因为氧化还原酶和底物在酶促反应过程中发生了电子 转移。氧化还原酶又可细分为脱氢酶(Dehydrogenase)、氧 化酶(Oxidase)、还原酶(Reductase)、过氧(化)物酶 (Peroxidase)、氧酶(Oxygenase)、羟化酶(Hydroxylase)、触 酶(Catalase)等几种。通常根据其非朊基基团(活性中心)又 可分为含黄素(Flavin)类活性中心酶和含醌(Quinone)类活 性中心酶两类。黄素(Flavin)类酶包含约80种酶（如：葡 萄糖氧化酶和黄嘌呤氧化酶），其活性中心分别为黄素腺 嘌呤二核苷酸(Flavine adenine dinucleotide, FAD)或黄素单 核苷酸 (Flavin mononucleotide, FMN)，其中绝大多数是 FAD型酶。