4株猪链球菌的病原生物学特性分析_杜华茂
猪链球菌病诊断和防治措施
10月，通常夏季多发，冬季一般不发病，潮湿低洼地区也容易 发生该病， 且牛群移动对该病有一定的促进作用， 但已发病地 区第二年往往不会形成大流行性。
作者简介：韦海泥(1991.10-),男，广西壮族自治区柳州市人，大学本科，助理兽医师，主要从事动物疫病防控工作。
1猪链球菌病原体介绍 猪链球菌是一种常见的革兰氏阳性菌，属于需氧或兼性厌
氧菌，根据链球菌荚膜多糖抗原特性的不同，链球菌主要可分 为35种血清型，导致生猪养殖中岀现链球菌疾病的主要血清 型种类为C型、D型、E型和I、R、S、Q型等，其中C型链 球菌主要会导致生猪岀现败血症、 关节炎症及肺炎等疾病症 状，D型链球菌感染主要会导致生猪岀现脑膜炎症、败血症及 关节炎症等， E 型链球菌感染主要会导致生猪岀现淋巴结脓肿 炎症等。其中E型链球菌感染最为常见，在现阶段生猪养殖中 流行最为广泛。而生猪养殖威胁最大、致病能力最强的是R群 中的猪链球菌域型。将猪链球菌在平板培养基上观察可以发 现，链球菌菌落呈现为灰白透明，表面光滑，边缘整齐的形 态，通常菌落直径在1~2滋m,大部分呈现为单个或双个存在， 呈现为卵圆形。在液体培养基上链球菌多呈现为长链性状，4~ 10个菌体连接成链，所组合的链越长则所具备的治病能力越 强。链球菌菌体没有鞭毛结构，不具备自由运动能力，同时也 不会岀现芽抱组织，但具备以脂多糖组成的荚膜结构，可以产 生溶血素叫 2猪链球菌疾病的诊断措施 2.1猪链球菌疾病的临床诊断
血清学诊断是现阶段生猪养殖中常用的自检措施，通过免 疫荧光技术、波板凝集试验、SPA协同凝集及荚膜反应等均可 获得良好的诊断结果。分子生物学的诊断措施主要是通过RTPCR检测仪进行病原菌检测。 3猪链球菌疾病的防治措施
猪链球菌病病原特性及流行病学研究
３ ． ４ 化 脓 性 淋 巴 结 炎 型
脑 膜 炎 、 关 节 炎 、 哺 乳 仔 猪 下 痢 和 孕 猪 流 产 等 ，败 血 症 型 及 脑 膜 脑 炎 型 多
见于 仔 猪 ．化 脓 性 淋 巴 结 炎 型 多 见 于
易 感 ．但 大 多 数 在 ３ ～ ｌ ２周 龄 的 仔 猪 暴
１ 病 原 特 性
高 温 高 湿 、 气 候 变 化 、圈 舍 卫 生 条 件
差 等 应 激 因子 使 动 物 的抵 抗 力 降低 时 ．
猪 链 球 菌 菌 落 小 ， 灰 白透 明 ， 稍 粘 ．菌 体 直 径 １ ～ ２ １ ， ｚ ｍ，多 单 个 或 双个 存 在 ．呈 卵 圆 形 ．在 液 体 培 养 基 中 才
病 的 临 床 症 状
表 现
３ ． １ 败 血 症 型
一
般 发 生 在 流 行 初 期 ，突 然 发 病 ，
体 温升至 ４ １ ～ ４ ２ ℃ ．在 数 小 时 至 １ ｄ内
死 亡 。急 性 病 例 ，常 见 精 神 沉 郁 ，体 温４ １ ℃左 右 ，呈 稽 留 热 ，减食 或 不 食 ，
不 形 成 芽 孢 ，多 数 无 鞭 毛 。 本 菌 为 革
多 血 清 型 中 ，２型 是 猪 的 最 主 要 病 原 ．
致 病 性 最 强 。从 表 征 健 康 的 猪 体 扁 桃
孔德利 蔡 前 杨奉 驰 兰 一 山东省济 宁市 泗水 县畜 牧兽医 局 ． ７ ０ ０ 一 氏阳性 ，需 氧 或 兼 性 厌 氧 菌 ， 或 Ｂ 体 内分 离 的 所有 猪 链 球 菌 中 ．２型多 达
不 同 年 龄 的 猪 都 可 感 染 发 病 ，新 生 仔
猪链球菌病的流行特点及综合防治措施
猪链球菌病的流行特点及综合防治措施猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种传染病，主要通过猪之间的直接接触或间接接触传播。
下面将介绍猪链球菌病的流行特点以及综合防治措施。
流行特点：1. 季节性流行：猪链球菌病在寒冷的冬季和潮湿的季节易发生流行。
这与低温和湿度有利于病原菌的生存和传播有关。
2. 并发症流行：猪链球菌病易与其他疫病同时发生并发症，如鼻炎、肺炎、脑膜炎等。
3. 传播途径多样：猪链球菌可通过直接接触、气溶胶传播、消化道传播、性传播等途径传播。
4. 群体感染：猪链球菌病在养殖场内易发生群体感染。
一旦有感染病猪进入养殖场，很容易通过接触、饮食等途径传播给其他健康猪。
综合防治措施：1. 加强饲养管理：加强猪场卫生管理，定期清洗和消毒猪舍、饮水系统和饲料器具，保持环境清洁卫生。
合理饲养、科学饲料配制，增强猪的免疫力和抵抗力。
2. 健康检疫：加强猪的健康检疫工作，对新引进的猪应进行检疫隔离观察，并定期进行体温监测和疫苗接种。
3. 临床治疗：一旦发现病猪，应立即进行临床治疗，使用适当的抗生素和药物进行治疗，注意用药剂量和疗程，防止细菌耐药。
4. 疫苗防控：可采取疫苗接种控制猪链球菌病的流行。
选择有效的疫苗，按照生产厂家的推荐使用疫苗制定疫苗接种计划，保持猪的免疫力。
5. 防止交叉感染：加强猪场的生物安全防控措施，减少人员、车辆和货物的外部污染。
严格实施人、车进出猪场的消毒制度，防止外来病原体的传入。
6. 健康养殖技术：加强养殖员的健康教育和培训，提高养殖员的卫生意识和防病意识，掌握健康养殖技术，减少病原菌传播的机会。
7. 加强监测和报告：疫情监测和报告是控制猪链球菌病流行的重要手段。
养殖场应加强疫情监测，及时发现和报告疫情，及时采取措施控制疫情的扩散和蔓延。
猪链球菌病的流行特点包括季节性流行、并发症流行、传播途径多样以及群体感染等。
为了防治猪链球菌病，我们应加强饲养管理、健康检疫、临床治疗、疫苗防控、防止交叉感染、健康养殖技术以及加强监测和报告等综合防治措施。
猪链球菌病的实验室鉴定及防治措施
猪链球菌病的实验室鉴定及防治措施猪链球菌病是由链球菌科猪链球菌引起的一种常见的猪类传染病。
猪链球菌病主要病变部位在皮肤和淋巴系统，病猪常表现为皮肤红肿、淋巴结肿大以及发热等症状。
猪链球菌病严重影响了猪的生产性能和养殖效益，因此对其进行准确的实验室鉴定和合理的防治措施非常重要。
实验室鉴定猪链球菌病的方法主要包括病原学鉴定、生物学特性鉴定和分子生物学鉴定。
病原学鉴定是通过采集病猪的临床标本，在适当增菌基质中培养猪链球菌，观察和分离纯种菌株。
通常可以采集病猪的皮肤切片、淋巴结组织和关节液等标本进行培养，常用的培养基有血琼脂、亚硝酸盐琼脂和巴氏液等。
培养到纯种菌株后，可以进行生物学特性的鉴定。
生物学特性鉴定主要包括菌体形态、生理生化特性以及药敏试验等。
通过菌体形态特征，如菌落形态、菌体形状、胞外多糖产生等，可以初步确认猪链球菌；而通过生理生化特性鉴定，如氧需求性、pH值耐受性、产气等，可以进一步确认该菌种。
分子生物学鉴定是目前较为先进的鉴定方法，通过PCR反应扩增猪链球菌特异性的基因或基因片段，如16S rRNA基因等，然后进行DNA序列测定和分析，最终确定该菌种。
分子生物学鉴定方法具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优势。
对于猪链球菌病的防治，主要采取以下措施：1. 强化卫生和消毒。
加强猪舍的清洁消毒工作，定期对猪舍进行内外环境消毒，包括对猪栏、饮水设备、饲料器具和兽医器械等进行清洁和消毒操作，减少猪链球菌的传播源。
2. 合理养殖管理。
根据疫情的流行特点，合理调整猪群的密度，避免猪只之间的交叉感染；同时加强对饲料、饮水和环境的管理，保证猪只的饲养条件良好，增强其免疫力。
3. 接种疫苗。
针对猪链球菌病，可以选择适当的疫苗进行接种，以增强猪只的防御能力。
疫苗接种应根据猪只的年龄、季节和病情等因素来确定接种时间和剂量。
4. 应对突发疫情。
一旦发生猪链球菌病的疫情，应及时采取隔离和治疗措施，对病死猪只进行尸检和埋葬处理，避免病菌的扩散和传播。
猪链球菌分子生物学检测研究进展
猪链球菌分子生物学检测研究进展
董维垚 / 天津渤海农牧产业联合研究院有限公司
猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种人畜共患的传 染病，会导致猪关节炎、心内膜炎以及肺炎等的发生， 同时还可以穿过胎盘屏障导致母猪流产，是我国养猪业 面临的重大传染病之一。对猪链球菌病进行快速诊断对 于该病的控制意义重大。目前对该病的检测方法主要是 通过建立在常规的分离培养以及生化鉴定的微生物学鉴 定方法，不仅费时费力，而且检测灵敏度不高。近年来， 随着分子生物学技术的不断发展，为猪链球菌的检测提 供了新的途径。因此，本文就目前国内外猪链球菌分子 生物学方面的检测方法进行具体的论测体系，实现了 对蛋白溶菌酶释放蛋白、溶血素基因以及胞外因子等猪 链球菌独立相关因子基因的同步检测。通过对背景明确 的试验菌株进行检测分析，具有一定的检测效果。
3. 实时荧光定量 PCR。实时荧光定量 PCR 不仅能 够快速准确地检测出病原体，还能够判断出疾病的亚临 床状态，从而判断出是现感染还是既往感染。孙洋等以 荚膜多糖基因为靶基因，建立了 2 型猪链球菌的荧光实 时定量 PCR 检测方法，这种方法不仅能够准确测定出感 染的强度，还避免了假阳性的检测结果，对猪链球菌的 检测方法起到了完善作用。
三、基因芯片技术
基因芯片是通过将核算探针固定在支持物上，荧光 标记的靶分子与探针结合后，通过检测荧光信号即可获 得样本的基因信息。近年来，基因芯片技术被广泛应用 于治病微生物检测中。郑峰等根据基因库中猪链球菌的 相关序列，针对不同菌株设计了不同的特异性探针并达 到了预期的检测效果。这对于猪链球菌的鉴定具有重要 价值。
清瘟解毒口服液收载于《农业部第 1506 号公告》， 紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公
猪链球菌病的诊断与防治
猪链球菌病的诊断与防治猪链球菌病是由猪链球菌感染引起的一种疾病，严重危害猪的健康和生产。
本文将从猪链球菌病的临床表现、病理变化、诊断方法和防治措施四个方面进行介绍。
一、猪链球菌病的临床表现猪链球菌病主要感染年龄在1-3月龄之间的生长发育迅速的猪，常见于肺炎、鼻炎、流行性腹泻等多种疾病。
病猪出现的临床症状包括咳嗽、喘息、呼吸困难、精神不振、食欲减退、体重下降、粪便异常等。
二、猪链球菌病的病理变化猪链球菌主要定植于鼻、喉、气管和肺。
感染后，病原菌通过分泌的毒素和酶破坏猪的颈部黏膜，使猪呼吸道受到感染。
猪链球菌感染后，肺部呈现出肺气肿、肺萎缩、肺泡炎等病理变化，病猪呼吸困难，可严重危及猪的生命。
目前，常用的猪链球菌病诊断方法主要包括病理学、细菌学和分子生物学三种方法。
1.病理学诊断方法：通过病理学检查和组织学检测等方法，观察病猪的组织病变变化，以确定猪链球菌病的诊断。
2.细菌学诊断方法：采用病原菌分离培养、荧光抗体染色等方法对病原菌进行检测，从而得出猪链球菌感染的诊断。
3.分子生物学诊断方法：采用PCR等技术，检测病猪组织中的猪链球菌DNA，从而诊断猪链球菌感染。
1.防治流行病学：针对猪链球菌的传播途径和流行病学特点，采用合理的管理和防护措施，控制猪群中的疫情。
2.病原学防治：对病猪进行隔离和治疗，切断疫源的传播途径，从而防止疫情扩散。
3.免疫学防治：采用猪链球菌灭活疫苗进行预防接种，增强猪的免疫力，防止疫情的发生。
总之，猪链球菌病的临床表现和病理变化特点明显，但是猪链球菌病的治疗和防治需要采取多种手段，结合温馨的饮食和环境保持良好的个人卫生，预防感染，从而保障猪的健康和生产。
猪链球菌病的病原 猪链球菌病的症状及防治措施 - 养猪技术
猪链球菌病的病原猪链球菌病的症状及防治措施-养猪技术猪链球菌病是由多种致病性猪链球菌感染引起的一种人畜共患病。
其中猪是主要传染源。
该病在人类中不常见，但普遍易感，主要表现为发热和严重的毒血症状。
早期诊断及时治疗后，多数患者可以治愈，但部分患者会留下后遗症。
猪链球菌病是养猪生产中常见的一种传染病,以败血症、脑膜炎、多发性关节炎等为主要临床特征。
猪链球菌病可由马链球菌兽疫亚种、猪链球菌、马链球菌马亚种等多种链球菌引起。
由于该病临床症状复杂,且危害严重,严重影响养猪业的健康发展。
下面具体来了解一下：猪链球菌病的病原猪链球菌病的症状及防治措施。
1、病原猪链球菌外形呈圆形或椭形，略成橄榄状，直径0.6～1．Oum，没有芽孢和鞭毛，呈长、短链状排列。
长链由20～30个菌体组成，短链由4～8个菌体组成。
链球菌革兰染色阳性，多数为需氧或兼性厌氧菌，少部分为厌氧菌。
猪链球菌按照荚膜多糖抗原的不同，日前可分35个血清型，其中致病性较强的血清型有1型、2型、7型、9型、1／2型和14型。
链球菌对外界抵抗力不强，对热敏感，60℃可致大部分链球菌灭活，煮沸可迅速将其杀死，低温条件下可存活1 50天以上，在干燥的环境下也可存活数天。
链球菌对一般消毒药均敏感。
对青霉素、红霉素、四环素等抗菌素以及磺胺类药物均敏感。
2、流行特点猪链球菌病呈地方性流行，且一年四季均可发生流行，以气候炎热且潮湿的7～10月发病率最高。
该病可引起猪、牛、羊、马、猫、犬等多种动物感染发病，以猪易感性最强，危害程度最大，不同年龄、品种、性别的猪都可感染发病，但发病率和死亡率会有不同，以妊娠母猪和仔猪症状较为严重。
该病为人畜共患病，主要以从事养殖、生猪肉加工以及销售等活动的人群为感染对象。
病猪和带菌猪是该病的主要传染源，以消化道、呼吸道及伤口感染为主要传播途径，健康猪可通过直接接触病猪及带毒猪被感染，也可通过接触被病原菌污染的饲料、饮水、土壤、器具等被感染，新生仔猪可在患病母猪分娩过程中被感染。
猪链球菌病的流行病学临床表现和防控措施
猪链球菌病的流行病学临床表现和防控措施猪链球菌病，又称猪环球菌病，是一种由猪链球菌引起的疾病。
猪链球菌是一种革兰氏阳性细菌，主要存在于猪的呼吸道、消化道和皮肤表面。
该病在全球范围内都有发生，尤其是在养猪密集的地区，对猪群健康和生产安全造成严重影响。
科学了解猪链球菌病的流行病学特点、临床表现和防控措施对于减少疾病的发生和传播具有重要意义。
流行病学特点：猪链球菌病的传播途径主要包括空气传播、接触传播、飞沫传播和消化道传播等。
在猪场内，猪链球菌的传播主要通过猪之间的直接接触和空气中的飞沫传播，尤其是在猪群密集的环境中更容易发生。
猪链球菌也可以通过猪的粪便和尿液排泄到环境中，污染饲料和饮水，引起猪链球菌病的传播。
临床表现：（一）急性型猪链球菌病：主要表现为高烧、呼吸困难、咳嗽、无力、食欲减退、粘液鼻分泌物增多等症状，严重的情况下可导致猪的死亡。
（二）慢性型猪链球菌病：主要表现为咳嗽、呼吸急促、发热、消瘦、肺气肿等症状，严重影响了猪的健康和生长状况，严重影响了生产效益。
（三）亚临床型猪链球菌病：症状较轻，但持续时间较长，存在潜在的传染性和潜在的危害。
防控措施：为了有效预防和控制猪链球菌病，需要采取一系列的防控措施：（一）加强环境卫生管理：定期对猪舍和饲料存放库房进行彻底清洁和消毒，并保持通风良好，减少细菌的传播。
（二）加强饲养管理：合理安排饲料和饮水，保证猪群的充足营养和充足的饮水，提高猪的免疫力，降低发病率。
（三）做好疫苗预防：根据猪链球菌的特点，采取全株疫苗和分离蛋白疫苗接种，对猪进行定期的疫苗预防，增强猪的免疫力。
（四）加强疫情监测：定期对猪群进行健康检查，及时发现猪链球菌病的患猪，并做好隔离和治疗，防止疫源的扩散。
（五）加强畜禽传染病防治体系建设：建立和完善畜禽传染病监测、预警和处置体系，加强疫情监测，及时控制传染源，防止猪链球菌病的传播和扩散。
猪链球菌病是一种严重危害猪群健康和生产效益的传染病，对于预防和控制猪链球菌病，需要采取一系列的防控措施，包括加强环境卫生管理、加强饲养管理、做好疫苗预防、加强疫情监测和加强畜禽传染病防治体系建设等。
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收稿日期:2008-10-24基金项目:中加联合项目(2008DFA31830);西南大学博士基金资助项目(20700905).作者简介:杜华茂(1970-),男,副教授,博士。
*通讯作者4株猪链球菌的病原生物学特性分析杜华茂1,2,丁玉春3,王丽丽2,崔志刚2,刘佩红4,叶长芸2,徐建国2* (1.西南大学生物技术学院,重庆400715;2.中国疾病预防控制中心传染病控制所,北京102200;3.重庆养猪科学研究院,重庆402460;4.上海市畜牧兽医站,上海201103)摘要:对4株新分离猪链球菌N J25、SH 29、SH 40和RC4726进行病原学特性分析,以评估其对公共卫生的威胁性。
利用中国疾病预防控制中心传染病所制定的猪链球菌2型鉴定方案,对4株新分离猪链球菌N J25、SH 29、SH40和RC4726进行毒力相关基因检测、细菌染色体酶切片段多态性分析(PFG E)、多位点序列分型(M L ST ),并用C57BL/6小鼠作致病性试验。
结果显示,N J25株为ST 7序列型,SH 29、SH 40为ST 1序列型,3株菌的基因型均为sly +mr p +ef+;RC4726的7个管家基因座位分别为ar oA (18)、cpn60(34)、dpr (24)、g ki(12)、mut S(1),recA (1)、thrA (4),是一个新的M L ST 型,基因型为sly +mrp -ef -。
PF GE 分析显示N J25、SH 29、SH 40与SC84有60%的相似性,RC4726与SC84的相似性仅为20%。
用108CFU 攻击C57BL /6小鼠,除RC4726外,NJ25、SH29、SH 40均能致小鼠发病、死亡。
结果表明,N J25、SH 29、SH 40可能是高致病性猪链球菌,RC4726是1株非致病性猪链球菌。
关键词:猪链球菌;M L ST ;P FG E;病原生物学中图分类号:S852 61 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2010)01-0024-05Pathogenic characteristics of four Streptococcus suis strainsDU H ua -mao 1,2,DING Yu -chun 3,WANG L-i li 2,CUI Zh-i gang 2,LIU Pe-i hong 4,YE Chang -yun 2,XUJian -guo2*(1.College of Biotechonology ,Southw est Univer sity ,Chongqing 400715,China;2.N ational I nstitute f or Communicable Disease Control and Pr ev ention,B eij ing 102200,China;3.Chongqing A cdemic of sw ine science,Chongqing 402460,China;4.Shanghai I nstitue gor Com -municable Disease Control and Pr ev ention,Shanghai 201103,China)Abstract :T o analyze t he patho genic cha racteristics of fo ur no vel S trep tococcus suis isolates,and evaluate their pot en -tial thr eat of sanitatio n.Screen the v irulence -related -g enes,pulsed -field g el elect ro phor esis (PF GE),multiple locus sequence t yping (M LST ),and experimental animal test.S.suis NJ25strain belo ng s to ST 7,SH 29and SH 40belong to ST 1,three str ains ar e sly +mr p +ef +g enoty pe.S.s uis R C4726stra in seems to be a no vel ST ,clo se to ST 87,sly +mr p -ef -.T he P FG E analysis demonstrated that NJ25,SH29and SH 40shar e 60%homolog y w ith S.s uis SC84st rain w hich iso lated fro m a patient in Sichuan,China,2005,but R C4726only 20%.W hen challeng ed C57BL /6mice wit h a dosage of 108CF U ,N J25,SH29,SH40and SC84all wer e lethal w it h diver se mor bidity and morta lit y,the mice inoculated with RC4726str ain did not fall ill.T he latest isolat ed S.s uis strains,N J25,SH 29and SH 40ar e hig hly vir -ulence,but RC4726not.Key words :Str ep tococcus s uis ;M L ST ;P FG E;pat ho genic biolog y *Cor r esp onding author猪链球菌在自然宿主的检出率高达50%,近几年来猪链球菌给世界各养猪国家的生猪业造成重大经济损失[1-2]。
人接触了病猪和病死猪(肉)后,通过皮肤伤口等途径感染。
人和猪感染发病的临床症状相似:脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和中毒性休克综合征,人的预后不良,多发生失聪,肾损伤和劳动力丧失[1]。
至今已有35个血清型的猪链球菌被鉴定,引起猪和人发病有2、1/2、9、7和8等血清型的猪链球菌,以2型猪链球菌为主[1,3],由于编码荚膜多糖的基因发生水平转移,因此猪链球菌血清型与致病性间的关系很不明确。
对猪链球菌的分子流行病学调查采用毒力相关基因检测、多位点序列分型(M ult-i locus sequence typing,MLST)和细菌染色体酶切片段脉冲场凝胶电泳分析(Pulsed field g el electro-phoresis,PFGE)相结合的综合手段进行,适用于口岸检疫、种猪场猪链球菌净化和例行猪链球菌检疫,可为从事生猪饲养、屠宰、加工、销售、检疫的人员发出不同层次的预警信号。
1 材料与方法1.1 细菌及培养 猪链球菌98015株为98年江苏流行菌株,SC84分离于感染猪链球菌的四川休克病人,JXS1为2005年从江西病死猪分离,P1/7,89-1591由Gottschalk惠赠,均由中国疾病预防控制中心传染病控制所保存。
NJ25,血清2型,从四川内江某猪场的后备种猪中分离(鼻腔试子)。
RC4726为血清8型,分离于重庆市某种猪场后备种猪(鼻腔试子),SH29、SH40为血清2型,分离于上海某猪场的病死猪。
所有细菌用TH B培养基,于37 , 5%CO2箱中培养。
1.2 毒力相关因子的检测1.2.1 mr p和ef基因的检测 用Northern blot 法检测菌株的mr p和ef基因。
细菌染色体的提取采用常规溶菌酶处理、SDS裂解、蛋白酶消化方法。
首先以SC84菌株的染色体DNA为模板,用2对引物分别扩增mrp基因片段和ef基因片段,引物序列为mrp-1:5 -GGTAT ACCT TGCTGGTACCGT-TC-3,mrp-2:5 -T GTCT CT ACAGCT GTAGCT-GG-3 ;ef-1:5 -ACAAA GGCGT AGGT TCAAT C-3 ,ef-2:5 -CGGCA TCAAGAATGT CT T TG-3 。
PCR反应条件为:94 预变性5min,94 60s, 56 1min,72 1min,25个循环反应后在72 延伸5min。
PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化(Qiag en),经核苷酸序列测定(大连宝生物工程公司)后按试剂盒说明书进行地高辛标记。
打点杂交中所有样品的上样量均为2 g,预杂交及杂交温度为68 ,抗地高辛的酶标抗体稀释度为1: 5000,所有操作过程按说明书进行。
1.2.2 猪溶素的检测 因为发现猪溶素存在因点突变而反失去溶血活性的能力,因此对该毒力相关因子的检测在蛋白质水平进行,在5%CO2培养条件下分析培养液产生溶血现象的时间及强度。
分别在猪链球菌生长到D600值为0.1、0.2、0.3直到0.8时取样,采样后立即8000r/m in离心15min,转移上清液到新的1.5mL管,并置冰上保存。
用微量法测定溶血效价,无细胞上清用预冷的PBS作2倍连续稀释,各稀释度分别取100 L与等体积红细胞溶液在96孔V型板上中混合,放于5%CO2,37 1 h后观察结果,设PBS和培养基对照。
溶血效价以50%溶血的最高稀释倍数而定。
1.3 PF GE分型 PFGE分型按文献[4]的方法进行。
1.4 MLST分型 按照文献[5]扩增aroA、gki、dpr、mutS、r ecA和thrA,按照文献[6]扩增cpn60。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后用(Qiagen)回收,送大连宝生物工程公司测序。
所测核苷酸序列经DN Astar SeqM an程序截齐后登陆http:// w w 进行M LST分型。
1.5 动物试验 将7周龄的SPF级C57BL/6系小鼠随机分组,每组5只,饲养在隔离器中,饲料和饮水经高压灭菌。
将细菌培养至D600=0.7,离心后菌体用预冷的PBS洗涤2次,PBS悬浮后调D600= 0.6,取0.1m L作平板活菌计数。
小鼠经腹腔注射1mL菌悬液。
观察小鼠的精神状态,行动,采食及死亡情况。
从死亡鼠的心血和脑分离细菌并鉴定。
2 结果2.1 毒力相关因子检测 由于M RP和EF的生物学作用还不明确,我们只是基因水平检测其有无。
P1/7和89-1591等2株已完成全基因序列测定,分别为mr p-ef+和mr p-ef-,SC84由中国CDC传染病所完成mrp、ef完整基因序列测定为mr p+ef+,作为对照。