狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC_5细胞中的感染特性_张芮铭.caj
狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC_5细胞中的感染特性_张芮铭.caj
2. 1 感染细胞的观察 显微镜下观察可见，MOI 为 0. 05 时，病毒收获前细胞部分回缩，排列较整齐，折 光度较好；MOI 为 0. 06 和 0. 07 时，病毒收获前细胞 出现聚集现象，液体中基本无死细胞；当 MOI 大于 0. 08 时，病毒收获前细胞脱落较严重。见图 1。
2. 2 病毒收获液的滴度 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒收获液的滴度较高，见图 2。 2. 3 病毒灭活液的效价 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒灭活液的效价较高，MOI 在 0. 05 ～ 0. 10 之间，病毒收获液的效价均符合 WHO 提出的疫苗 最低效价 2. 5 IU ／ 剂的要求，见图 3。
Beijing Minhai Biotechnology Co.，Ltd，Beijing 102600，China Corresponding author: GAO Zheng-lun，E-mail: gzlun@;
ZHANG Rui-ming，E-mail: reneezhang1031@ Abstract： Objective To observe the infectious characteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells. Methods MRC-5 cells were inoculated with PM strain at MOIs of 0. 05，0. 06，0. 07，0. 08，0. 09 and 0. 10 respec－ tively，and observed by microscopy. The harvested virus liquid was determined for titer by indirect IFA. The inactivated virus liquid was determined for potency by test in NIH mice. Results The cells inoculated with PM strain at MOIs of 0. 06 ~ 0. 07 showed aggregation before harvest of virus，and few dead cells were observed in liquid. The harvested virus liquid showed high titer，while the inactivated virus liquid showed high potency. Conclusion The infectious char－ acteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells was observed，which provided an experimental basis for optimization of production procedure of the rabies vaccine. Key words： Rabies virus PM strain; MRC-5 cells; Infectious characteristics; Titer; Potency
狂犬病病毒 - 医学微生物学课件-文档资料
致病性
易感动物： 家畜和野生动物， 蝙蝠可能是重要的 储存宿主
Department of Microbiology, Harbin Medical University
动物间狂犬病是由于 患病动物咬伤健康动 物而传播 人被患病动物咬伤致 病。人被咬伤发病率 为30%-60%。一旦发病 ，死亡率高达100%
Department of Microbiology, Harbin Medical University
人咬伤后，应做：
处理伤口
特异性防治：抗狂犬病病毒免疫球蛋白
接种狂犬病病毒疫苗
Department of Microbiology, Harbin Medical University
Department of Microbiology, Harbin Medical University
流行情况
1946-2019期间UK只有19个病例，所有病例 都是在其洲共有198例报道，主要 的发病地区是俄罗斯和罗马尼亚 WHO统计全球每年有25,000例
在感染动物的中枢
神经系统中增殖，
形成内基小体（
Negri body），有诊
断意义
Department of Microbiology, Harbin Medical University
根据表面糖蛋白G可分为4个血清型
抵抗力不强，60C 30min或100C 2min可灭 活。 在脑组织中室温或4C可持续1－2周。
Department of Microbiology, Harbin Medical University
Department of Microbiology, Harbin Medical University
狂犬病病毒医学微生物学课件
05
狂犬病病毒的研究进展与展望
狂犬病病毒的基因组学研究
基因组结构
狂犬病病毒的基因组为单股负链 RNA，长度约为11kb，包含3个 主要基因片段，分别编码病毒的
核蛋白、磷蛋白和糖蛋白。
基因组变异
狂犬病病毒的基因组在复制过程 中容易发生变异，导致病毒的抗
原变异和逃逸免疫应答。
基因组功能
狂犬病病毒的基因组在病毒复制 、转录、翻译等生命活动中起着 关键作用，对病毒的致病性和传
狂犬病病毒医学微生物学课 件
汇报人： 2023-12-30
目录
• 狂犬病病毒概述 • 狂犬病病毒的致病机理 • 狂犬病病毒的检测与诊断 • 狂犬病病毒的预防与控制 • 狂犬病病毒的研究进展与展望
01
狂犬病病毒概述
狂犬病病毒的发现与命名
发现
狂犬病病毒是在1885年由巴斯德 在法国首次发现的。
命名
狂犬病病毒能够抑制免疫细胞的活性，降低免疫细胞的增殖和分化能力，导致免疫 系统无法有效清除病毒。
狂犬病病毒对免疫系统的破坏还可能导致其他感染和疾病的发生，如肺炎、心脏疾 病等。
狂犬病病毒肉、心脏、肺等 。
在这些器官和组织中，狂犬病 病毒的复制和表达会导致细胞 损伤和功能异常。
播性具有重要影响。
新型狂犬疫苗的研究与开发
减毒活疫苗
通过在细胞培养中连续传代，降低病毒的毒力，保留免疫 原性，如人二倍体细胞疫苗和Vero细胞疫苗。
基因工程疫苗
利用基因工程技术，将狂犬病病毒的糖蛋白基因插入到载 体病毒基因中，表达出具有免疫原性的糖蛋白，制备成疫 苗。
核酸疫苗
将狂犬病病毒的抗原基因片段插入到载体中，直接注射到 人体内，诱导机体产生免疫应答。
微管对狂犬病病毒胞内感染的影响
微管对狂犬病病毒胞内感染的影响高洁;赵铭昕;刘恩华;赵维荣;段铭;关振宏;张茂林;郭艺迪【摘要】狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)依赖宿主细胞完成其感染周期,且在胞浆内复制.微管作为一种细胞骨架,是介导胞内物质运输的重要通道.为探究狂犬病病毒胞内感染是否依赖于细胞骨架——微管,利用小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a),接种实验室标准攻击毒株CVS-11,通过诺考达唑(Nocodazole)抑制剂破坏微管形成,采用实时荧光定量PCR方法、Western Blot方法、免疫荧光方法检测微管对于RABV 感染量的影响,并采用TCID50法测定微管对RABV病毒滴度的影响.结果表明,Nocodazole通过抑制微管的形成,使RABV N基因水平降低25％、N蛋白水平降低50％,免疫荧光检测到病毒感染率降低70％,上清液中病毒滴度由106.5TCID50/mL降低至104.5TCID50/mL,说明狂犬病病毒胞内感染依赖于细胞骨架-微管的参与.该结果为进一步研究狂犬病病毒胞内运输及其复制机制的研究提供了理论依据.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2019(058)010【总页数】5页(P121-125)【关键词】狂犬病病毒;微管;诺考达唑;胞内感染【作者】高洁;赵铭昕;刘恩华;赵维荣;段铭;关振宏;张茂林;郭艺迪【作者单位】吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春130062;吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春130062;吉林大学动物医学学院,长春 130062;吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062;吉林大学动物医学学院,长春 130062;吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062;吉林大学动物医学学院,长春 130062;吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062;吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062;吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062;吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062【正文语种】中文【中图分类】S851狂犬病是由狂犬病毒属弹状病毒科的狂犬病病毒（RABV）引起神经系统障碍的一种高度致死性人兽共患传染病。
我国分离的10株狂犬病病毒P和M蛋白基因序列分析
我国分离的10株狂犬病病毒P和M蛋白基因序列分析解庭波;黄思佳;明平刚;吴杰;徐葛林;严家新【摘要】In order to investigate the genetic characteristics of phosphoprotein (P) and matrix protein (M) genes of 10 representative rabies virus (RV) isolated in China, the P and M genes were amplified by RT-PCR, and then sequenced. The nucleotide and amino acid sequences and their functional positions were analysed by bioinformatics software. The phylogenetic trees were constructed based on the P and M genes. The 10 Chinese RV P and M gene nucleotide homology were 85. 9%-99.4% and 89. 5%-99. 5% , and the deduced amino acid identity were 92. 3% -100% and 96. 0% -99. 5% respectively. The ten isolates showed much higher homology with the street strain HN10 and CTN vaccine strain in China than with other vaccine strains and challenge virus standard (CVS) abroad on both nucleotide level and amino acid level. Phylogenetic analysis revealed that these 10 isolates were more closely related to the strain from Hunan Province and vaccine strain CTN than to other strains used in the study. Compared with other genotype 1 rabies viruses, multiple amino acid residues were substituted in P and M gene of the 10 isolates but rarely mutated in the functional regions. These 10 strains of rabies virus isolated in our study belong to genotype 1 and show close relationship to the street strain and vaccine strain CTN in China.%目的探讨我国狂犬病病毒P、M蛋白基因序列的结构特点及变异情况.方法用RT-PCR方法从分离的10 株具有代表性的狂犬病病毒中获得目的基因片段,测定核苷酸序列后,利用生物信息学软件分析核苷酸、氨基酸序列及其相关的功能位点并构建P、M蛋白基因的系统发育树.结果 10 株病毒P和M基因核苷酸序列同源性分别为85.9%～99.4%和89.5%～99.5%,推导出的氨基酸同源性分别为92.3%～100%和96.0%～99.5%.在核苷酸及氨基酸水平上,10 株病毒与我国分离的街毒株HN10及CTN疫苗株的P、M基因同源性均明显高于国外其它疫苗株、标准攻击毒CVS株相应的同源性.系统发育分析表明,10 株病毒与我国湖南街毒株、CTN疫苗株进化关系最近,而与研究中选取的其他毒株进化关系较远.氨基酸对位分析表明,与其它基因1型毒株相比,本研究中10 株狂犬病病毒的P、M基因出现多处变异,但很少在功能区发生变异.结论分离的10 株病毒属基因l型狂犬病病毒,与我国分离的街毒株及CTN疫苗株关系较近.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2012(028)003【总页数】5页(P226-229,236)【关键词】狂犬病病毒;遗传特征;P基因;M基因【作者】解庭波;黄思佳;明平刚;吴杰;徐葛林;严家新【作者单位】武汉生物制品研究所狂犬病检测中心,武汉,430060;武汉生物制品研究所狂犬病检测中心,武汉,430060;武汉生物制品研究所狂犬病检测中心,武汉,430060;武汉生物制品研究所狂犬病检测中心,武汉,430060;武汉生物制品研究所狂犬病检测中心,武汉,430060;武汉生物制品研究所狂犬病检测中心,武汉,430060【正文语种】中文【中图分类】R373.9狂犬病病毒（Rabies virus，RV）属弹状病毒科狂犬病毒属，为单股负链RNA病毒，病毒基因组长约12 kb，分为7个功能区，从3′至5′方向依次为3′非编码区（3′leader）－N－P－M－G－L－5′非翻译区（5′trailer），分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和转录酶大蛋白（L）。
狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析
狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析张银;金硕;栗朵朵;Abraha Bahlbi Kiflu;韩菲;武梦思;凌小清;梁晶晶;李晓宁;罗廷荣【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2022(53)9【摘要】【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。
【方法】以RABV 广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。
【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。
在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。
在昆明小鼠攻毒试验中,重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M)攻毒后第4 d昆明小鼠开始出现精神不振、行动迟缓等症状,其致病性无明显差异;昆明小鼠体质量均呈一过性减轻,之后恢复正常并呈上升趋势;攻毒15 d内均未见昆明小鼠死亡,即重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRCHL(GX01P-M)的致病性较弱。
【结论】强毒株GX01的P基因与M基因联合替换可提高病毒传播能力,且二者具有协同性,但对弱毒株rRC-HL的毒力无影响。
狂犬病毒生物学特征研究进展
狂犬病毒生物学特征研究进展
狂犬病毒是一种单链RNA病毒，属于锥形病毒科。
其基因组长度为11kb，编码5个结构蛋白和1个非结构蛋白。
狂犬病毒的结构蛋白包括核衣壳蛋白N、磷酸酯酶P、重复蛋白M、膜蛋白G和核酸酶蛋白L，这些蛋白在病毒的复制和传播过程中起到关键作用。
狂犬病毒主要通过唾液传播，感染后进入全身，通过神经元迁移到中枢神经系统，导致狂犬病。
在感染动物或人的过程中，病毒在口腔的唾液中复制，然后通过咬人或动物等方式传播。
病毒在感染后病情恶化迅速，一旦症状出现就很难治疗，死亡率高达100%。
最近的研究表明，狂犬病毒具有高度的遗传多样性，其基因型的变异能够导致病毒的致病性和传染力的不同。
这提示了狂犬病毒的流行和传播可能与其基因型有关，因此一个长期的狂犬病毒基因型监测和分析系统非常必要。
除此之外，研究人员还在探索狂犬病毒的抗原性、免疫机制和疫苗开发等方面。
尽管已经存在有效的疫苗对抗狂犬病毒，但在一些发展中国家和地区，由于病毒基因型的差异和疫苗针对性的不同，人类狂犬病的流行仍然存在挑战。
因此，今后的狂犬病毒生物学研究需要促进更多有效的疫苗开发和更高效的预防措施。
狂犬病病毒HEP-Flury株N基因的修饰及原核表达
狂犬病病毒HEP-Flury株N基因的修饰及原核表达张良;黄永亮;官培英;王怡飞;徐晓娟;吴晓薇;郭霄峰【摘要】Using bioinformatics analysis, a rich antigenic determinant area in HEP-Flury nucleoprotein sequence was selected, and the codons were modified to cater the codon usage bias in Escherichia coli, and the restriction enzyme sequences were inserted in upstream and downstream. The modified gene was synthesized and cloned into prokaryotic expression vector pET-32a( + ). The recombinant plasimd was designated pET-32-NP. pET-32-NP wasl75 transformed to E. Coli BL21 ( DE3)pLysS, and the recombinant protein was expressed after IPTG induction. SDS-PAGE analysis showed that the expressed protein had a relative molecular mass of 34 000. Western-blotting results also revealed that the expressed protein could be recognized specifically by mouse anti-His monoclonal antibody and mouse anti-RV polyclonal antibody.%为了高效表达狂犬病病毒HEP-Flury的核蛋白,选取抗原决定簇富集区,利用生物信息学技术分析了狂犬病病毒HEP-Flury N蛋白的核苷酸序列.根据大肠埃希菌Escherichia coli对密码子的偏嗜性,首先对所选取的核苷酸序列进行修饰、引入酶切位点,然后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-NP.将其转化表达宿主菌Escherichia coli BL21( DE3) pLysS,以IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量34 000处有1条特异的蛋白带,与预期大小一致.Western-blotting检测结果显示,该蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及犬抗RV多克隆抗体特异识别,表明所表达的N蛋白具有良好的免疫原性.【期刊名称】《华南农业大学学报》【年(卷),期】2012(033)001【总页数】4页(P102-105)【关键词】狂犬病病毒;核蛋白;原核表达【作者】张良;黄永亮;官培英;王怡飞;徐晓娟;吴晓薇;郭霄峰【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65狂犬病病毒(Rabies virus，RV)是一种能引起人和动物高度致死的嗜神经病毒，属弹状病毒科狂犬病毒属，基因组从3'端至5'端依次排列核蛋白(N蛋白)、磷酸化蛋白(P蛋白)、基质蛋白(M蛋白 )、糖蛋白(G蛋白)和转录酶蛋白(L蛋白)5种结构蛋白［1］.其中N蛋白为狂犬病病毒最保守的结构蛋白，共450个氨基酸，占病毒总蛋白的36%;是狂犬病病毒粒子的一种主要内部蛋白，在狂犬病病毒复制过程中与基因组RNA紧密结合形成核糖核蛋白(RNP)，保护病毒基因组RNA免受宿主细胞核酸酶的破坏［2］.RNP还与 P蛋白、L蛋白相互作用，形成转录与复制必需的螺旋对称结构［3］.同时，狂犬病病毒N蛋白不仅具有所有狂犬病病毒共有的群特异性抗原决定簇，而且具有狂犬病病毒和狂犬病相关病毒共有的属抗原决定簇［4］，N蛋白还是主要保护性抗原之一，能刺激机体产生细胞免疫［5］.单独用N蛋白免疫小鼠和狗，能诱导这些动物产生保护性免疫应答，并能抵抗狂犬病病毒致死剂量的攻击［6］.用N蛋白基因构建的重组病毒也能抵抗狂犬病病毒致死剂量的攻击［7-8］.本研究以狂犬病病毒HEP-Flury株N基因序列为材料，通过生物信息学分析、序列合成与定向克隆方法构建重组表达质粒pET-32-NP并优化表达条件，在体外利用大肠埃希菌表达出带有6×His标签的重组狂犬病病毒N 蛋白并经纯化，为狂犬病诊断方法的建立奠定基础.1 材料与方法1.1 毒株、载体及主要试剂狂犬病毒HEP-Flury株、原核表达载体pET-32a(+)、犬抗RV多克隆抗体、基因工程菌为华南农业大学兽医学院微生物学教研室保存.凝胶回收试剂盒、鼠抗His 单克隆抗体、HRP标记羊抗犬IgG、HRP标记羊抗鼠IgG、DL2000及DL15000 DNA Marker为天根生化科技(北京)有限公司产品，KpnⅠ、HindⅢPrestained Protein Ladder为Fermentas公司产品，His-Trap FF crude为GE公司产品.1.2 引物根据GenBank所收录的HEP-Flury基因序列，分析设计了1对引物，上、下游分别引入KpnⅠ与HindⅢ酶切位点，命名为:1.3 pET-32-NP重组质粒的构建以HEP-Flury株N基因序列为参考，通过生物信息学分析，选取抗原决定簇富集区并根据大肠埃希菌密码子偏嗜性作密码子修改，然后引入酶切位点并送上海捷瑞生物技术有限公司合成及定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)，构建重组表达质粒pET-32-NP.用 RV-N1、RV-N2引物对 pET-32-NP进行PCR检测及KpnⅠ与HindⅢ双酶切鉴定.1.4 重组核蛋白的诱导表达与鉴定将重组质粒 pET-32-NP转化至 E.coli BL21(DE3)pLysS，挑取单个菌落扩增后采用不同的IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导前D600 nm值、培养基抗生素浓度进行诱导表达.优化诱导条件并检测不同表达条件下的表达量，确定最佳诱导条件，同时设立含pET-32a(+)空载体及未诱导的重组质粒转化菌作为对照.重组蛋白按试剂使用说明采用鼠抗His单克隆抗体、犬抗RV多克隆抗体和HRP标记羊抗鼠IgG或HRP标记羊抗犬IgG进行Western-blotting鉴定;SDS-PAGE后切胶，送暨南大学再生医学实验室作蛋白质谱鉴定.1.5 重组核蛋白的分离与纯化取菌液以1∶100的体积比进行大量表达，收获菌体后用含8 mol/L尿素的磷酸盐缓冲液悬浮菌体沉淀并超声破碎，4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液过HisTrap FF crude柱.蛋白与柱内Ni2+充分结合后，用含20 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗涤杂蛋白，用含100 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集的蛋白作SDS-PAGE鉴定，并用紫外分光光度计测定纯化蛋白的浓度.2 结果2.1 pET-32-NP重组质粒的构建用RV-N1、RV-N2引物对pET-32-NP进行PCR检测.结果显示，在250～500 bp间有一明亮条带.经计算，目的条带与预期片段大小相符，为330 bp.阴性对照无条带出现.对PCR阳性的克隆质粒进行双酶切，亦在250～500 bp间得到大小相符的条带.结果见图1.图1 PCR扩增鉴定及双酶切鉴定结果Fig.1 Result of PCR and enzymatic digestion2.2 重组核蛋白的诱导表达与鉴定对诱导表达产物进行SDS-PAGE电泳、染色、脱色后发现在相对分子质量约34000处出现1条新的蛋白带，其大小与带有6×His标签的重组融合RVN蛋白一致.而阴性对照中相应位置没有类似粗细的条带.经多次优化诱导条件发现，不同的IPTG浓度、诱导时间、诱导前D600 nm值等条件下表达量未能出现明显的变化，而不同的诱导温度下表达量则有较大的不同.结果显示，28℃诱导表达量较高，且没有出现明显的降解现象，结果见图2.采用MS/MS法对纯化后蛋白进行质谱鉴定，经肽指纹图谱鉴定及部分强信号肽段测序(图3)，显示纯化后的蛋白即为狂犬病病毒N蛋白.图2 核蛋白的诱导表达产物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressing N protein图3 肽段测序结果与N蛋白氨基酸序列的比较Fig.3 Comparison of peptide sequencing and N protein amino acid sequenceWestern-blotting结果显示，重组狂犬病N蛋白能够被鼠抗His单克隆抗体及犬抗RV多克隆抗体特异性识别(图4).图4 Western-blotting分析Fig.4 Western-blotting analysis2.3 重组核蛋白的分离与纯化将分离纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳后发现，所得条带清晰明亮，无杂带，经紫外分光光度计测定，质量浓度为1.0 mg/mL.3 讨论狂犬病病毒N蛋白的作用不仅仅在于它和基因组RNA紧密结合，保护基因组RNA免受宿主细胞核酸酶的切割，而且它在病毒RNA从转录向复制切换方面起重要作用.N蛋白虽然调控基因组的转录和复制，但其具体机制和过程仍不完全清楚.本研究利用分子生物学方法成功构建了基于原核表达载体pET-32的重组质粒pET-32-NP，优化表达条件后得到了带有6×His标签的融合核蛋白，为进一步探索N蛋白对病毒复制的调控机制奠定了基础.原核表达常使用的优化条件中，诱导温度对表达量有着极其重要的影响.虽然大肠埃希菌在10～43℃范围内都能够生长并合成蛋白，但研究发现，在37℃条件下细菌生长活跃，合成的蛋白量高，同时由于蛋白酶活性太高，容易造成蛋白质的降解，因此该温度并不利于外源蛋白的大量表达［8］.本次研究的结果同样证实了这一现象，重组的核蛋白在37、16℃均不能很好地表达，而在28℃下表达量显著提升，且没有出现明显降解.真核生物的结构蛋白要进行原核表达，需要考虑其基因中存在较多原核生物难于识别的密码子，如真核生物中编码精氨酸(Arg)的常见密码子agg、aga，编码亮氨酸(Leu)的常见密码子cta等在大肠埃希菌中就缺乏相应的tRNA.有研究显示，这些稀有密码子大量或连续性的出现会严重影响蛋白的表达［9］.江飙等［10］和郑佳琳等［11］分别对狂犬病病毒的M和G基因进行了偏嗜性修饰并在大肠埃希菌中获得高效表达.我们之前也曾对未经修饰的狂犬病病毒N基因进行原核表达，但表达量不高［12］.为了提高狂犬病病毒N基因的表达水平，我们对狂犬病病毒HEP-Flury N基因进行了生物信息学分析.结果发现，狂犬病病毒N蛋白中仅编码精氨酸的稀有密码子就有24组，亮氨酸的稀有密码子有34组，并且在编码第270与271、357与358、422与423位氨基酸处出现3组精氨酸稀有密码子连续成簇的现象，在编码第143、144、145位氨基酸处出现1组亮氨酸稀有密码子连续成簇的现象.因此，本研究选取N蛋白抗原富集区并根据大肠埃希菌对密码子的偏嗜性进行修改，大大提高了表达量.参考文献:［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京:科学出版社，1997:777-955. ［2］LARSON J K，WUNNER W H，OTVOS L，Jr，et al.Identification of an immunodomin 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2. 1 感染细胞的观察 显微镜下观察可见，MOI 为 0. 05 时，病毒收获前细胞部分回缩，排列较整齐，折 光度较好；MOI 为 0. 06 和 0. 07 时，病毒收获前细胞 出现聚集现象，液体中基本无死细胞；当 MOI 大于 0. 08 时，病毒收获前细胞脱落较严重。见图 1。
2. 2 病毒收获液的滴度 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒收获液的滴度较高，见图 2。 2. 3 病毒灭活液的效价 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒灭活液的效价较高，MOI 在 0. 05 ～ 0. 10 之间，病毒收获液的效价均符合 WHO 提出的疫苗 最低效价 2. 5 IU ／ 剂的要求，见图 3。
1 材料与方法
1. 1 病毒及细胞 狂犬病病毒 Pitman Moore（PM） 株 PM1503-3M（65 代，为生产用毒种，工作浓度 ≥ 6. 5 Lg LD50 ／ ml）、CVS 株和 MRC-5 细胞（26 代）均 来自法国赛诺菲巴斯德；BHK-21 细胞由中国食品药 品检定研究院提供。
张芮铭，高正伦，方群，左静，刘海文，郑学学，刘翠，郑森元
北京民海生物科技有限公司，北京 102600
摘要： 目的 观察狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性。方法 分别将 0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0. 09、0. 10 MOI 的 PM 株狂犬病病毒接种至 MRC-5 细胞中，显微镜观察感染细胞的状态；间接免疫荧光法检测病毒 收获液的滴度；小鼠 NIH 法测定病毒灭活液的效价。结果 MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒收获前细胞出现聚集现象， 液体中基本无死细胞；病毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价较高。结论 观察了狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性，为疫苗生产工艺的优化提供了实验依据。 关键词： 狂犬病病毒 PM 株；MRC-5 细胞；感染特性；滴度；效价
通讯作者：高正伦，E-mail：gzlun@； 张芮铭，E-mail：reneezhang1031@
本实验旨在观察狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性，通过比较不同 MOI 下病 毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价，为疫苗生产 工艺的优化提供实验依据。
［6］ Agrawal A, Gupta A, Chandra M, et al. Role of Helicobacter pylori infection in the pathogenesis of minimal hepatic encephalopathy and effect of its eradication ［J］. Indian J Gastroenterol, 2011, 30（1）: 29-32.
0. 04 0. 05 0. 06 0. 07 0. 08 0. 09 0. 10 0. 11 0. 12
MOI
图 2 不同 MOI 病毒收获液的滴度
Fig 2. Titers of harvested virus liquid inoculated at various
MOIs
（下转第 1263 页）
Beijing Minhai Biotechnology Co.，Ltd，Beijing 102600，China Corresponding author: GAO Zheng-lun，E-mail: gzlun@;
ZHANG Rui-ming，E-mail: reneezhang1031@ Abstract： Objective To observe the infectious characteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells. Methods MRC-5 cells were inoculated with PM strain at MOIs of 0. 05，0. 06，0. 07，0. 08，0. 09 and 0. 10 respec－ tively，and observed by microscopy. The harvested virus liquid was determined for titer by indirect IFA. The inactivated virus liquid was determined for potency by test in NIH mice. Results The cells inoculated with PM strain at MOIs of 0. 06 ~ 0. 07 showed aggregation before harvest of virus，and few dead cells were observed in liquid. The harvested virus liquid showed high titer，while the inactivated virus liquid showed high potency. Conclusion The infectious char－ acteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells was observed，which provided an experimental basis for optimization of production procedure of the rabies vaccine. Key words： Rabies virus PM strain; MRC-5 cells; Infectious characteristics; Titer; Potency
DOI:10.13200志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
· 基础研究 ·
狂犬病病毒 ＰＭ 株在人二倍体 ＭＲＣ-５ 细胞中的感染特性
人用禽胚狂犬病疫苗和细胞培养狂犬病疫苗经 过四十多年的发展，在狂犬病暴露前和暴露后免疫的 安全性、有效性已被证实［1］，目前接种狂犬病疫苗是 防治人患狂犬病唯一有效的方法，我国每年有 1 000 万 ～ 1 200 万人接受狂犬病暴露后的疫苗接种［2］。
影响狂犬病疫苗接种后效果的因素很多，其中 最主要的就是疫苗效价。影响疫苗效价的因素包括 生产时宿主细胞状态、病毒感染复数（MOI）、病毒接 种时间和培养时间等，而 MOI 是影响病毒产量的重 要因素之一。
中国生物制品学杂志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
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1. 2 主要试剂 BME 培养基和 PBS 购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清（澳洲血源 SH30084-03）购自 美国 Hyclone 公司；人血白蛋白（用于配制病毒培养 液）购自西班牙 Grifols 公司；胰酶（2. 5%）购自美国 GIBCO 公司；异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒 糖蛋白单克隆抗体由法国赛诺菲巴斯德惠赠；β-丙 内酯购自 Ferak 德国 Berlin 公司。 1. 3 实验动物 SPF 级昆明小鼠，雌性，体重 11 ~ 15 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合 格证号：0300129。 1. 4 细胞培养 复苏 26 代 MRC-5 细胞，接种于 F75 cm2 塑料培养瓶中培养。待细胞长成单层后，用 PBS 洗涤，2. 5%胰酶消化，按 1 ∶ 4 比例传代，传至 第 37 代备用。 1. 5 病毒培养 将 37 代 MRC-5 细胞消化后制成浓 度为 5. 0 × 106 个 ／ ml 的悬液，分别接种 0. 05、0. 06、 0. 07、0. 08、0. 09、0. 10 MOI 的 PM 株狂犬病病毒，置 35 ℃温室培养，用 BME 配制的病毒冲洗液连续冲洗 2 次后，继续置 35 ℃温室培养 3 ～ 5 d，显微镜下观 察，当 80%以上细胞被感染，并出现细胞圆缩时，收 获病毒。 1. 6 病毒收获液滴度的检测 采用间接免疫荧光法。 将收获的病毒液系列稀释，在 96 孔微量培养板中与 BHK-21 细胞于 36 ℃，5% CO2 培养箱共培养 48 h 后， 通过异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒糖蛋白单 克隆抗体检测各孔中是否存在病毒，荧光显微镜观察， 计算病毒对细胞的半数感染剂量（lg CCID50 ／ ml）。 1. 7 病毒液的灭活及效价检测 采用小鼠 NIH 法。 收获的病毒液澄清后，经 3 μm 滤膜过滤，使用Millipore 300 kd 超滤膜包，按照既定比例进行超滤浓缩， 用1 ∶ 4 000 的 β-丙内酯灭活，取样进行 1 ∶ 25、1 ∶ 125、 1 ∶ 625、1 ∶ 3 125 稀释，于第 0 天和第 7 天分别经腹腔 免疫昆明小鼠，每只 0. 5 ml；于第 2 次免疫后 1 周， 即第 14 天经脑腔攻击 30 LD50 的狂犬病病毒 CVS 株 悬液，每只 0. 03 ml。攻击后观察 14 d，记录小鼠存 活数，并计算病毒灭活液的效价。
图 1 感染不同 MOI 病毒的 MRC-5 细胞收获前的状态观 察（× 400）
Fig 1. MRC-5 cells inoculated with PM strain at various MOIs（× 400 ）
病毒滴度（lg CCID50 ／ ml）
7. 8 7. 6 7. 4 7. 2 7. 0 6. 8 6. 6 6. 4 6. 2 6. 0
中图分类号： R373. 9 文献标识码： A 文章编号： 1004-5503（2013）09-1258-03
Infectious characteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells