第八章 重组蛋白的分离与纯化-修改

about 30 kDa; including Trx, PLA2-9 6 × His tag, EK site and other linker
fusion protein
IMAC
Purification of Trx-PLA2-9 fusion protein
Purified protein
Functional expression and characterization of a recombinant phospholipase A2 from sea snake Lapemis hardwickii as a soluble protein in E. coli. Toxicon 41 (2003) 713–721
为人们克隆与表达外源基因的首选。
但在外源基因的表达过程中，常常会遇到表达效率不高和 产率较低等困难。以往的研究表明，影响外源基因表达效率 的因素主要有密码子的选用、目的基因的量、载体的选择、
宿主菌的培养控制等。
大肠杆菌基因表达载体
1 启动子的强度
诱导型启动子： 原核生物启动子 组成型启动子：
启动子的分离
Purification of the soluble fusion protein and mature rPLA2-9. (A) Affinity chromatography of the bacterial cell lysates in a Ni2+-chelating sepharose column. (Flow rate 5 ml/min): 1, flow-through peak; 2, eluted peak of 50 mM Tris (pH 7.0), 500 mM NaCl, 150 mMimidazole; 3, eluted peak of 50 mM Tris (pH 7.0), 500 mM NaCl, 400 mM imidazole. (B) DEAE-sepharose chromatography of the fusionprotein resulted from affinity chromatography. (Flow rate 4 ml/min): 4, flow-through peak with 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl; 5, eluted peak of 50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl. (C) DEAE-sepharose chromatography of the fusion protein after EK cleavage. (Flow rate 3 ml/min): 6, flow-through peak (purified rPLA2-9); 7, eluted peak of 50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl. The three selected fractions were indicated by arrows.
1. T7· Tag抗体琼脂。
2. B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4， 2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。 4. 洗脱缓冲液： 0.1M柠檬酸，pH2.2。 5. 中和缓冲液：2M Tris,pH10.4. 6. PEG 20000.
a)融合蛋白表达：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真 核序列。优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定； 易高效表达；但只能做抗原，一般不做人体注射用药 ?? b)非融合蛋白表达：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易 引起免疫反应 c)分泌蛋白表达：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下 游
外源基因在大肠杆菌表达的形式 •包涵体蛋白
第八章 重组蛋白的分离与纯化
一 大肠杆菌表达系统
1. 大肠杆菌 (Escherichia coli) 表达蛋白产物
1.1 大肠杆菌表达系统的特征
优势 • 技术成熟，基因克隆表达载体众多，受体细胞类型丰富
•
• • •
繁殖迅速，培养代谢易于控制
易于进行遗传操作和高效表达 操作安全，致病能力低 成本相对低得多
6 蛋白质的翻译系统
在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖
体结合位点（SD序列）、起始密码子于SD序列之间的距离和
碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5′端非翻译序列 和蛋白编码区的5′端序列等。 核糖体结合位点（SD序列） 蛋白质的翻译系统 翻译起始密码子 翻译终止密码子
b 重组表达方式
（三）注意事项
蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
PCR技术体 外扩增
IMAC
构建出
pET28a的 重组质粒
转入
E.coliBL 21(DE3)
目标蛋白有 6个His Tag
纯蛋白
融合His Tag重组蛋白的基因克隆、表达及亲和纯化[D],付丽棠,天津：天津大学
• 重组质粒有较高拷贝数且表达量高。 • 适用范围广。 • 稳定性高。 • 表达产物容易纯化。
带纯化标签的表达载体
• 6个组氨酸(His)的核苷酸置于待表达基因的N
端，个别情况下置于待表达基因的C端
• 可以通过金属螯合亲和层析一步分离纯化
5 宿主菌的培养控制
• 质粒稳定性与拷贝数的控制
• 重组大肠杆菌培养方式
低速离心沉淀
提取包涵体 变性的蛋白质 离子交换层析 凝胶过滤
进行离子交换（2）
进行其它层析方法（3） 纯化蛋白质 干燥浓缩 无菌过滤 纯化的蛋白质 进行其它层析方法（3）
1.4 可溶性产物的纯化(融合T7· Tag的表达蛋白)
（一）试剂准备 采用T7· Tag Affinity Purification Kit
（二）操作步骤
1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌
体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。 2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，
取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7· Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。 4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。 5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。 6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收 集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。 7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr,中间换液数次。 8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
Functional expression and characterization of a recombinant phospholipase A2 from sea snake Lapemis hardwickii as a soluble protein in E. coli. Toxicon 41 (2003) 713–721
②表达效率高；
③较易于分离纯化。
宿主菌
枯草芽孢杆菌 常用的宿主菌
短小芽孢杆菌
地衣芽孢杆菌
1.3 分离纯化的线路和要点
大肠杆菌细胞 破碎细胞，机械法：高压细胞破碎仪，酶法：溶菌酶 可溶性蛋白分离 离心 （10000 ×g离心 30min） 不可溶性蛋白分离
低速离心上清 澄清裂出水物
进行离子交换（1） 交换缓冲液
糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白 等。 包括DNA、RNA和脂多糖等。
包涵体形成的本质——是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括 三个方面：
①折叠状态的蛋白质的聚集作用；
②非折叠状态的蛋白质的聚集作用；
③蛋白质折叠中间体的作用。
•融合蛋白
融合蛋白——将外源蛋白基因与受体菌自身 Nhomakorabea白基因重组在
一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白 称为融合蛋白。 *融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点： ①稳定性好；
大肠杆菌表达系统构建的方法是将控制某一目的功能
蛋白的基因表达序列(CDS)重组到表达载体，而后转化到
细菌细胞株中，使重组基因借助细菌细胞内蛋白表达系统
而进行表达，而后分离纯化所表达的蛋白。
一个成功的表达系统构建和筛选，首先要求对所选择
表达载体的特征特性有清楚的了解。
大肠杆菌由于遗传背景简单，可进行大规模发酵培养，表 达周期短，操作简单及已有大量可供选择利用的载体，而成
包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆 菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结 构称为包涵体。 包涵体存在部位：细胞质、细胞周质
外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的
蛋白质 包涵体 的组成 非蛋白质
氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋
白一般没有生物学活性。
受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核
SDS-PAGE (15% gel) analysis of the expression and purification of rPLA2-9. (A) Purification of PLA2-9 fusion protein by affinity chromatography. 1, total proteins of transformed BL21 (DE3) cells without IPTG induction; 2, marker; 3, crude cell extract after IPTG induction; 4, proteins from flow-through peak; 5, proteins from eluted peak of 50 mMTris–HCl (pH 7.0), 500 mM NaCl, 150 mMimidazole; 6,proteins from eluted peak of 50 mM Tris–HCl (pH 7.0), 500 mM NaCl, 400 mM imidazole. B, Purification and characterization of mature rPLA2-9. 1, fusion protein from eluted peak of 50 mM Tris– HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl on DEAE-sepharose chromatography; 2, PLA2-9 fusion protein after EK cleavage; 3, purified rPLA2-9; 4, western blot of cell lysates after IPTG induction; 5, western blot of purified rPLA2-9. Functional expression and characterization of a recombinant phospholipase A2 from sea snake Lapemis hardwickii as a soluble protein in E. coli. Toxicon 41 (2003) 713–721