ipt 基因定位表达对转基因烟草育性的影响
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
23
7
30. 4
1. 0 cm @ 1. 0 cm
20
11
55. 0
0. 5 cm @ 0. 5 cm
4
2
50. 0
2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
烟草叶片衰老相关基因
烟草叶片衰老相关基因作者：高晓明郭永峰来源：《中国烟草科学》2016年第04期摘要：烟草（Meotiana tabacum L.）是一种叶用经济作物，以成熟变黄的叶片为收获对象，其叶片成熟度和叶片变黄过程对烟叶产品的质量起到决定性的影响。
简述了植物叶片衰老相关基因的研究概况，归纳了近年来烟草中叶片衰老调控相关基因的研究进展，总结了部分外源基因对烟草叶片衰老的影响。
分析表明，研究烟草叶片衰老相关基因，对提高烟叶品质和烟草育种具有重要意义。
关键词：烟草：叶片衰老：调控基因中图分类号：$572文章编号：1007-5119（2016）04-0097-04 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.017衰老是植物生长发育的最后一个阶段，植物衰老是植株在细胞、组织、器官或整株水平上生长衰退的过程，它由基因调控并受内外因素的影响，最终导致整株植物的死亡。
叶片衰老是植物衰老的主要表现形式，在正常条件下，叶片衰老主要与叶片年龄有关，是叶片的自然衰老。
除此之外，叶片衰老也可以被一系列外部环境因素如光照不足、干旱、极端温度、病原体物侵染等诱导和调节。
叶片衰老还与植物激素水平有密切的关系，植物内源激素如细胞分裂素、赤霉素等具有延缓衰老的作用，而乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸等则具有促进衰老的作用。
叶片衰老过程中，叶绿体是第一个被分解的细胞器，因叶绿素降解导致的叶片黄化是叶片衰老的主要标志。
叶绿体被分解之后，叶片的光合效率下降，其降解产物形成丰富的氮源，此时叶片的主要功能不再是进行光合作用，而是将蛋白质、脂肪、核酸等生物大分子降解形成的氮素及其它营养元素输送至茎尖、果实、幼叶等新生器官，供进一步生长发育或储存。
1.植物叶片衰老相关基因研究概述叶片衰老是一种程序性细胞死亡（programmedcell death，PCD），是细胞在一定的生理条件下，为更好的适应生存环境而发生的一种由基因控制的细胞自主有序死亡的过程。
转基因植物的遗传特性与表达调控
（4）从头甲基化与沉默机制 A 植物对外源DNA的基因免疫诱导反应； B DNA-DNA配对诱导； C DNA-DNA互作诱导。
4. 克服转基因沉默的策略
(1) 转基因的选择： （2）启动子的选择； （3）利用组织和发育特异性作用的增强子 （4）利用MAR序列； （5）利用位置特异性重组系统； （6）选择单拷贝的转化体。
E 交叉相连的DNA链经旋转形成Holliday中间体； F Holliday中间体分枝迁移数个碱基后，另一条链再断裂并与对方的 断裂链重组，这时就完成重组，实现了交换。
（3）位点特异性重组在转基因整合遗传特性研究中的应用
A 控制转基因整合的拷贝数；
B 可导入多个基因进入植物基因组； C 使目标基因重排；
在44个转KM抗性基因的烟草中，通过转基因植株自交、转化与非转化杂 交、转化株杂交进行分析，发现35个无性系包含一个单位点插入KM抗性基 因，其余5个为两位点插入，且观察到双位点插入导致自交后代中出现隐形 致死突变。 多基因转化植株后代分离规律与其整合特性密切相关，多基因连锁形式整 合到一个位点，其符合单基因的孟德尔式分离规律；如分别整合到不同位点， 那么每个基因的分离符合孟德尔式规律，各个基因间不影响。
（2）转录水平的基因沉默 A 转基因及其启动子甲基化； B多拷贝重复基因序列引起的转录水平基因沉默； C 同源基因间的反式失活； D 转基因位置效应引起的转基因沉默； E 染色体包装对转基因沉默的影响； F 后成修饰作用导致转基因沉默。
（3）转录后水平的转基因沉默
A 生化开关模型；
B 异常RNA模型；
当两个loxP基因座方向相同，Cre介导的反应造成loxP基因座之间的 DNA被删除，loxP基因座方向相反，Cre介导使两端携带loxP的片段发 生倒位，如果loxP 不在同一DNA分子，如一个在质粒上，另一个在染 色体上，那么Cre酶可使质粒DNA整合到染色体loxP所在位置，实现定 点重组。
烟草抗病毒基因工程研究
烟草抗病毒基因工程研究烟草作为一种重要的经济作物，在全球范围内广泛种植。
然而，烟草病毒病是烟草生产中面临的重要问题，给烟农带来巨大经济损失。
传统抗病毒方法如化学防治和物理防治等存在诸多弊端，而烟草抗病毒基因工程作为一种新型的防控技术，具有高效、安全、环保等优势，近年来备受。
本文将介绍烟草抗病毒基因工程的基本概念、研究现状、研究方法及实验结果与分析，并展望未来发展趋势。
烟草抗病毒基因工程是通过基因克隆、表达和分析等技术，将外源抗病毒基因导入烟草，使其在体内表达出抗烟草病毒的蛋白质，从而提高烟草对病毒的抗性。
该技术可有效解决传统抗病毒方法存在的问题，为烟草生产带来新的防控策略。
自20世纪90年代以来，随着分子生物学技术的迅速发展，烟草抗病毒基因工程研究取得了一系列重要成果。
例如，植物抗病毒基因的克隆与功能分析、抗病毒基因的转化与表达、抗病毒基因工程品种的选育与应用等。
然而，在实际应用过程中，仍存在转化效率低、基因沉默现象严重等问题。
烟草抗病毒基因工程研究的主要方法包括基因克隆、表达、分析等。
基因克隆技术通过对植物抗病毒基因的筛选、克隆和鉴定，为抗病毒基因的表达提供基础。
在基因表达方面，采用农杆菌介导、基因枪轰击、微注射等转化方法，将抗病毒基因导入烟草细胞中，实现基因的高效表达。
同时，利用分子生物学技术如RT-PCR、Southern blot等，对转基因烟草进行分子水平上的检测与鉴定。
通过基因克隆、表达和分析等技术，研究人员已成功获得多个具有抗病毒活性的转基因烟草品种。
这些品种在田间试验中表现出良好的抗病毒效果，有效降低了病毒对烟草的侵染和危害。
研究人员还发现，导入的抗病毒基因在烟草中能够稳定遗传，为抗病毒烟草品种的大规模繁殖和推广奠定了基础。
然而，在实际应用过程中，仍存在转化效率低、基因沉默现象严重等问题。
为了解决这些问题，研究人员尝试通过优化转化条件、筛选高效转化方法、选用适当的启动子等方式，提高抗病毒基因的表达水平和转化效率。
烟草育种学试题及答案期末考试
烟草育种学试题及答案期末考试一、选择题（每题2分，共20分）1. 烟草育种的主要目标不包括以下哪项？A. 提高产量B. 改善品质C. 增加烟草的有害成分D. 增强抗逆性2. 下列哪项不是烟草育种中常用的育种方法？A. 杂交育种B. 诱变育种C. 基因工程育种D. 克隆育种3. 烟草的遗传多样性主要来源于：A. 人工选择B. 自然选择C. 基因突变D. 基因重组4. 烟草的花型属于：A. 单性花B. 两性花C. 无性花D. 异花传粉花5. 烟草的遗传改良主要通过以下哪种方式？A. 物理方法B. 化学方法C. 生物技术D. 环境调控二、填空题（每空2分，共20分）6. 烟草的育种周期一般为________年。
7. 烟草的花药培养技术属于________育种。
8. 烟草的抗病性育种中，常用的分子标记技术是________。
9. 烟草的抗旱性育种可以通过________基因的表达来提高。
10. 烟草的杂交优势利用中，常用的杂交方式是________。
三、简答题（每题10分，共30分）11. 简述烟草育种中常用的诱变育种技术及其原理。
12. 阐述烟草育种中分子标记辅助选择的优势。
13. 描述烟草育种中基因工程育种的一般流程。
四、论述题（每题15分，共30分）14. 论述烟草育种中遗传多样性的重要性及其在育种中的应用。
15. 讨论烟草育种中环境因素对育种效果的影响。
五、案例分析题（共30分）16. 某烟草育种公司希望通过育种改良烟草的抗病性，请你设计一个育种方案，并说明其可行性。
参考答案一、选择题1. C2. D3. D4. B5. C二、填空题6. 3-57. 组织培养8. RAPD或SSR9. 抗旱相关10. 人工控制三、简答题11. 诱变育种技术是通过物理或化学诱变剂处理烟草种子或幼苗，诱发基因突变，然后通过筛选和选择，获得具有优良性状的新品种。
原理是诱变剂能够改变烟草的DNA结构，导致基因突变。
12. 分子标记辅助选择可以快速、准确地定位控制特定性状的基因，提高育种效率，减少育种周期，同时可以避免环境因素对性状表现的影响。
根据 ERF 转录因子的结构特征可以将其分为四个亚类
根据ERF 转录因子的结构特征可以将其分为四个亚类。
第I 亚类：AP2/ERF结合域由59 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的中部，转录调控域位于蛋白N 端；第II 亚类：AP2/ERF 结合域由58 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的N 端，蛋白的C 末端存在一个EAR 基序；第III 亚类：AP2/ERF 结合域也由58 个氨基酸组成，其N 和C 两端各有一个酸性激活域，蛋白C 末端还有一个MAPK 作用位点。
第IV 类：AP2/ERF 结合域同样由58 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的N 端，转录调控域位于C 端，此外N 末端还具有一个保守的MCGGAI(I/L)元件[68]ERFs类转录因子可以受到多种胁迫的诱导表达,同时参与不同胁迫信号转导途径的交叉应答,所以它在非生物胁迫中有十分重要的调控作用番前的?STE/JF/基因可以提高番莉根系发育过程中的耐盐性,还可以在转基因植株中表现较高的相对含水量和较低的丙二酸含量及电解质外渗,同时可以积累游离脯氨酸和可溶性糖含量,此外还调节抗逆相关基因、P5CS、DREB3】、的激活表达(Lu et al.,2011)。
Gao等(Gao et al.,2008)将番燕基因转入水稻,经过干旱和高盐处理后,同对照相比转基因植株的抗旱以及耐盐能力增强,并积累了脯氨酸含量,降低了叶片的水分流失。
另外,基因不仅可以影响含有GCC-box或DRE/CRT顺式元件的Z//>5、Wcor413L OsPrx和等胁迫相关的功能基因表达,还影响Os-CDP欠7、OsCDPKlS和OsCDP欠/9等调节基因的表达。
ERF类基因WXPl和WXP2可以使叶蜡积累并提高拟南芥的抗旱性(Zhangetal.,2007)。
己有许多研宄表明胁迫相关基因可以受外源的诱导表达,也有-?些基因虽然ABA对其表达无影响,但是确可以受到干早和低温等的诱导,这就又涉及到ABA依赖和ABA非依赖的非生物胁迫的信号转导途径,Zhu等(Zhu ct al.,2010)通过EMSA试验证明RAP2.6可以与CE丨顺式元件结合,进而可以调控AtABI4等ABA相关基因的特异表达。
烟草突变体筛选与鉴定方法篇：3.烟草突变体的TILLING筛选与功能鉴定
特点。随着烟草全基 因组测序的完成 ，ＴＬ Ｉ Ｇ在烟草功能基 因组学中的重要价值也越发体现 出来 。 ＩＬ Ｎ
选 技术 如 毛细管 电泳（ ａｉａ ｅｔ ｐ ｏｅｉ， Ｅ）聚丙 烯酰 胺凝 胶 电泳（ ｏｙｃｙａ ｄ ｅｅｅｔ ｐ ｏｅｉ ｃｐｌｒ ｅ ｃ ｏｈ ｒｓｓＣ 、 ｌｙ ｌ ｒ ｐ ｌａｒｌｍｉｅｇｌｌ ｒ ｈｒｓ ， ｃｏ ｓ
Ｐ Ｇ 、琼脂糖 电泳 （ ｇｒｓ ｇｌｌ ｔ ｐ ｏ ｓ ， Ｇ 、高分辨熔解 曲线 （ ｉ ｒｓｌ ｉ ｅ ｉ ， Ｒ ） Ａ Ｅ） ａａ ｅ ｅｅ ｃ ｏｈ ｒ ｉ Ａ Ｅ） ｏ ｅ ｒ ｅｓ ｈ － ｏ ｔ ｎ ｌ ｇＨ Ｍ ｅ ｕｏ ｍ ｔ ｎ
链核酸分子 ；（ ）电泳检测 ，检测手段可通过产生真实 电泳图谱 的 ＬＣ Ｒ ３０遗传分析工作站进行 ，也 ４ ＩＯ ４０
可通过 自动 化程 度较 高 的毛细管 电泳 系统 进行 ；（ ５）采取 相 同 的方 法从 突变 池 中筛选 突变 个体 ；（ ）突变 ６
个体 Ｐ Ｒ产物的测序验证。 Ｃ
高水平 的突变剂量 ，多倍体的突变频率要显著高于二倍体 ，如二倍体植物拟南芥、水稻 、玉米的突变频率
分别为 １ ７ 、１ ０ ｂ ／ ５ ｂ 而多倍体植物普通小麦突变频率 １ ４ ｂ 普通烟草约为 １ ６ ｂ 因 ／ ０ ｂ ／ ０ 、１ ８ ， １ ｋ ５ ｋ ４ ｋ ／ ， ２ｋ ／ ， ６ｋ
此要使基因组中 ９％以上 的基 因都有突变信息 ，多倍体植物如普通小麦 ＴＬ Ｉ Ｇ检测群体很少超过 ５０ ５ ＩＬ Ｎ ００
铁蛋白基因表达对烟草耐低铁能力的影响
白。铁过 量会导致氧化胁 迫， ｅ 能 与 Ｈ Ｏ２ Ｆ ２ 反应产生 羟 自由基 。 其极高 的氧化活性 可导致细胞死 亡。 铁蛋 白 基 因是植物体 内依赖铁 进行表达 的基 因（ａ ｓ ｙ ｔ １ Ｖ ｎ ｕｔ ． ｅａ， １ ９ ）铁蛋 白能将 高毒性 的Ｆ （ ） ９７。 ｅ １转化为无 毒的Ｆ （ Ｉ １ ｅ Ｉ） Ｉ
ａ．１ ９ ） Ｉ ８ 。自１ ６ 年 Ｈ ｄ 等首次报道 大豆铁蛋 白以 ，９ ３ ９ ｙｅ
来， 已在许多植物 中发现了铁蛋 白的存在 ， 并且克隆到许 多编码铁蛋 白的 ｃ Ａ片段 ， ＤＮ 例如豌 ￣ （ｅ ｃ ｒ ｔ １ ＿ ｓ ｕｅｅ ． Ｌ ａ， １９） ９ １ 、玉米 （ ｅｉｅ １ ２ ０ ） Ｐ ｔ ｔ ． ０ １ 、紫花苜 蓿（ ｅ ｋｅ ｔ ａ， Ｄ ａ ｔ ａ．１ ９ ） Ｉ ９ ９ 和烟草（ｉｎ ， ０ ５ 的编 码铁蛋 白的ｃ Ｎ ， Ｊａ ｇ ２ ０ ） Ｄ Ａ。 Ｇｏｏ ２ ０ ） 由３ Ｓ启动子 驱动的大豆铁蛋 白基因 ｔ 等（０ ０将 ５
铁 蛋 白基 因表 达 对 烟草 耐低 铁 能 力的 影 响
姜廷波 唐鑫 华， ， 李凤娟 ， 丁宝建， 陈虹
东北林 业大学 林木 遗传育 种与 生物技 术教育 部重 点实验 室，哈尔滨 １ ０ ４ ００ ５
摘要 铁是植 物生长 发育 的必需 元素 。 由于 土壤 中的三 价铁离 子不能被 植物 直接 利用 ， 使一些 植物经 常表现 出缺铁 症状 。 为探讨 利用铁 蛋 白基 因提 高植 物耐低 铁胁 迫 的作用 ， 用农杆 菌介 导法将 大 豆铁蛋 白基 因Ｓ ｙ ｅ 利 ０ Ｆ 一和内源反 义铁蛋 白基 因 Ｎ Ｆ ｒ 的ｃ Ｎ ￣ Ｊ ｔｅ２ Ｄ Ａ ａ Ｊ 导人烟草基 因组， 采集转 基因烟草种子 。对 Ｔ转基 因烟草 的卡那霉素抗 性分析表 明， 合到烟草基 因组 的 １ 整 外 源基 因多 为单拷贝基 因， 也有少数 为多拷 贝基 因 。对具有 卡那霉素抗 性的转基 因植株进行 Ｐ Ｒ Ｃ 检测 和Ｎ ｒ ｅｎ ｏｔ ｒ杂交分 析表 ｈ 明， 外源基 因已整合到 烟草 基 因组 中， 并且得 到了正确表达 。将转基 因株系移栽 到铁离子浓度 不同 的培养 基 中生长２ 月后进 个 行 比较 表明 。 大豆铁 蛋 白基 因烟草株 系 的生 长量 明显 高于非转 基 因烟草株 系， 转 而转 内源反义铁 蛋 白基因烟草 株系 的生长量 则 明显低 于非转基 因烟草 株系 。转大 豆铁 蛋 白基 因和转 内源反义铁蛋 白基因烟草株 系的叶绿素含量 、 二醛（ Ａ 含量和过 丙 ＭＤ ） 氧化 物酶（ Ｏ ） 等生理性状 也发 生了 明显 变化 ， Ｐ Ｄ 活性 表现为转 大豆铁蛋 白基 因株系 的叶绿素含量 明显增 加， ＯＤ Ｐ 活性 明显增 强， Ａ ＭＤ 含量 明显 降低： 而转 内源反义铁蛋 白基因株系 的叶绿素含量 、Ｐ Ｄ Ｏ 活性和ＭＤ 含量等则表 现为与转大 豆铁蛋 白基 因 Ａ 株 系的相反 。铁蛋 白过 量表达提 高 了烟草 耐低铁 能力 ， 铁蛋 白抑 制表达则 降低 了烟 草耐低铁 能力 。 而
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・快讯ShortCommunication ・收稿日期:1999211210 接受日期:1999212229基金项目:中国科学院院长基金特别支持项目(96082000219);中国科学院重大项目子课题(KY951-A1-302-12-12);中国科学院生命科学与生物技术创新青年科学家小组支持项目。
Foundationitem:PresidentgrantprojectofTheChineseAcademyofSciences(96082000219);MajorprojectofThe ChineseAcademyofSciencesandYoungScientistsGroupofLifeScience;BiotechnologyinnovationofTheChineseAcademyofSciences.3通讯作者。
Authorforcorrespondence.E-mail:<mami@>.ipt 基因定位表达对转基因烟草育性的影响耿 飒 麻 密3 李国凤 叶和春(中国科学院植物研究所,北京100093)关键词: TA29-ipt 基因;育性;转基因烟草中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:057727496(2000)022*******EffectsonFertilityinTransgenicTobaccobyLocalizedExpressionof ipt GeneGENGSa,MAMi,LIGuo-Feng,YEHe-Chun(Institute of Botany ,The ChineseAcademy of Sciences,Beijing100093,China )Abstract: Theisopenteryltransferase (ipt )genefrom Agrobacterium tumefaciens (SmithetTownsend )ConnwasdrivenunderthetobaccoTA29promoterandintroducedintotobacco(Nicotiana tabacum L.)plantsby A.tumefaciens mediatedtransformation.PCRandSouthernblotanalysisconfirmedthatthe ipt genehasinte 2gratedintothegenomesoftobaccoplants.TheexpressionpatternofthischimericTA29-ipt geneinthetrans 2genicplantswasstudied,andtheendogenouscytokininlevelindifferentorganswasassayedbyELISA method.Theresultsshowedthatthecytokinincontentintheandroeciumoftransgenicplantsincreased3-4timesascomparedwiththecontrol,andsomechangesofthefertilityoftheTA29-ipt transgenicplantshavebeenobserved.Keywords: TA29-ipt gene;fertility;transgenictobacco 杂种优势是生物界的一种普遍现象。
作物杂种优势的利用是培育高产、抗逆、优质新品种的重要手段之一。
然而,常规育种技术获得配套三系的难度很大,由此限制了杂种优势利用的发展。
近年来应用转基因技术创造雄性不育植株已有不少报道[1-5]。
有研究表明,自然突变的雄性不育株其花药中IAA 含量较低而玉米素过量。
若从调控花药中植物激素的角度入手,通过编码细胞分裂素合成关键酶基因———ipt 基因[6,7]在花药绒毡层中的定位表达,打破花粉发育过程中植物体内环境的激素平衡,可能会阻碍花粉的发育,从而得到雄性败育的转基因植株。
这不仅对加速作物杂种优势利用起到一定的推动作用,而且为花发育的基因表达调控提供一个良好的研究系统。
本文报道TA29-ipt 基因的定位表达对转基因植物体内细胞分裂素含量的改变以及对育性和花器官发育的影响。
1 材料和方法烟草(Nicotiana tabacum L.)品种“W38”和“新华一号”无菌苗继代培养于MS 培养基中,取其叶片作为转化受体。
TA29-ipt 双元表达载体pBTAI 的构建过程如下:用Sst Ⅰ酶切含ipt 编码区的质粒pGHipt,以Klenow 大片段补平;再以Nco Ⅰ酶切,回收745bp 片段。
用Sal Ⅰ酶切含TA29启动子的质粒pYL606,同样补平后再以Nco t Ⅰ酶切,回收1.8kb 片段。
连接回收的两个片段得到中间载体pTAI 。
用Hin d Ⅲ和Eco R Ⅰ酶切质粒pTAI,回收约2.55kb 片段;用同样的酶切pBin19,连接回收的两个片段即得到双元表达载体pBTAI 。
采用冻融法将pBTAI 导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens (SmithetTownsend )Conn )LBA4404。
以叶盘法转化烟草“W38”和“新华一号”。
提取转化植株总DNA 进行PCR 扩增,并以pBTAI 质粒DNA 以及“W38”和“新华一号”的总DNA 作正负对照。
PCR 扩增反应按文献[8]进行。
引物根据ipt 基因编码区两端序列设计:5′端引物为5′-植 物 学 报 2000,42(2):217-220Acta Botanica SinicaCCATGGACCTGCATCTAATTTTCG-3′;3′端引物为5′-CCTAATACATTCCGAACGG-3′。
扩增引物由赛百盛公司合成,C-18脱盐纯化。
Southern 和Northern 杂交按Sambrook 等[9]和Ausubel 等[10]描述的方法进行。
RNA 的提取和RT-PCR 参考文献[11]进行。
试剂盒分别购自Promega 和Boehringer 公司。
花粉萌发试验的培养基为:硼酸3mol/L 、蔗糖10%、琼脂0.7%,pH 为5.8。
培养温度25℃,培养时间6h 。
然后在显微镜下检查并照相。
ELISA 试剂盒购自中国农业大学。
细胞分裂素的提取和测定均按试剂盒说明进行。
2 结果和讨论“W38”卡那霉素抗性芽25株,分别编号为WTiptA —WTiptY;随机挑选“新华一号”卡那霉素抗性芽5株,分别编号为XTiptA —XTiptE 。
以这些抗性植株的总DNA 为模板,ipt 编码区两端的序列进行PCR 扩增,结果均出现一条约700bp 的带(图略)。
Southern 杂交进一步表明,这些植株均有外源ipt 基因的整合(部分结果见图1)。
图1. 转基因植株的Southernblot 分析。
Fig.1. Southernblotanalysisoftransgenicplants.1,positivecontrol (2.55kbfragmentcontain ipt );2-4,XTiptA -CgenomicDNA;5-9,WTiptA-EgenomicDNAdigestedbyEco R Ⅰand Hin d Ⅲ;10,non-transformedtobaccogenomicDNA;11,DIG-labeledDNAmarker.将上述转基因植株移栽至室外,护理至开花。
花粉萌发试验表明,转TA29-ipt 基因烟草的花粉萌发率普遍降低,但差异较大;其中WTiptE 株系和XTiptA 株系花粉几乎丧失萌发力(图2)。
镜检发现WTiptE 和XTiptA 株系的花粉发育不正常,出现碎的颗粒(图3e );然而这些雄性败育的植株,通过人工授以野生型花粉,发现其可以正常结实,表明其雌性可育(图3b )。
观察发现,WTiptE 和XTiptA 株系生长状况良好,直到开花前期,其表型和对照没有任何区别。
但到开花时,其花的形态分别表现出异常。
XTiptA 雄蕊发育异常,表现为在花丝的顶部、花药的基部又长图2. 转基因植株花粉萌发率与对照植株的比较。
Fig.2. Comparisonofthepollengerminationrateofthetransgenic plantswiththatofcontrol.出一片或两片花瓣,每朵花中长出异常花瓣的花丝数量不等(图3a );而花药本身形态正常。
WTiptE 花瓣畸形,常见花瓣裂开,且有部分朝外长的小片花瓣(图3c ),这种畸形花瓣的花只有4个花丝,推测其朝外长的花瓣是另一个花丝的变异结果。
此外WTiptE 花药的成熟不同步,而成熟的花药则呈现为黑褐色,开裂的花药中花粉较少且几乎没有萌发力。
为了研究TA29-ipt 基因的表达模式,我们对ipt 基因在转录水平的表达和定位做了检测。
以转基因植株的雄蕊、雌蕊、花瓣和叶片为材料提取RNA,RT-PCR 分析结果表明,ipt 基因在TA29启动子的驱动下只在雄蕊中转录,而在叶片、花瓣和雌蕊中均无iptmRNA 的积累(图4);Northern 分析进一步证实了这一表达模式(图略)。
TA29是绒毡层特异表达的启动子,以这一启动子调控ipt 基因的表达可以避免使用组成型启动子可能带来的在完整植株上的变异,这对将来采用此方法培育农作物的不育系同时保持其优良的农艺性状有重要意义。
分别采集转TA29-ipt 烟草的花期前叶片、花期后叶片、花瓣、雄蕊和雌蕊,以ELISA 对转基因烟草中细胞分裂素含量进行了测定。
结果如表1所示,表明WTiptE 和XTiptA 的雄蕊中细胞分裂素的含量提高幅度较大,达3～4倍;雌蕊、花瓣和花期后叶片中的细胞分裂素含量亦比未转基因的对照高,这可能与激素合成后的运输有关;而花期前叶片中的细胞分裂素含量与对照没有明显差异。
利用组成型启动子调控与生长素或细胞分裂素合成相关基因在转基因植物中的表达以研究其在整个植株生长发育过程中的作用的报道已有不少[6,12,13],但采用花药绒毡层特异表达启动子TA29则可直接地研究激素合成相关基因对花药发育和花粉育性的影响。
杨洪全等[14]曾将TA29-iaa L 基因转入烟草,导致转基因植株花药内源IAA 含量下降,从而引起花粉胚胎发生率下降。
本文首次报道利用218 植 物 学 报 Acta Botanica Sinica 42卷图3. 转TA29-ipt 烟草花形态和花粉的变异。
Fig.3. VariationofpollenandfloraltypeinTA29-ipt transgenictobacco.a,variationofstameninplantXTiptA;b,normalseedingafterartificialpollinationinXTiptA;c,variationofpetalinplantWTiptE;d,nor 2malgerminationofpolleninnon-transgenictobacco;e,pollengerminationofplantWTiptA.表1 ELISA 测定转基因烟草各器官中细胞分裂素含量的变化(ng/gFW )Table1 ELISAofactivecytokininchangeindifferentorgansoftransgenictobacco(ng/gFW )LBFPLDAn Petal Androecium Pistil W3882.2±11.881.6±15.481.3±7.182.0±10.681.3±2.6Xinhua178.1±6.581.0±9.481.1±12.380.1±1.380.2±1.7WTiptE79.8±5.9190.6±1.1220.0±16.8297.5±19.3203.6±10.9XTiptA 81.1±13.2191.6±2.6194.6±10.5284.2±7.3198.1±20.1注:LBFP,leavesbeforefloweringphase;LDAn,leavesduringanthesis.图4. 转基因植株XTiptA 的RT-PCR 分析。