食品志贺氏菌的检验方法
食源性致病菌检验标准操作程序
食源性致病菌检验标准操作程序福建省疾病预防控制中心二〇一二年十一月一、生物样本检验标准操作程序（一）粪便样本的保存、运送和检测表1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件培养基目标病原体温度细菌标本保存和运送1. Cary－Blair 所有食源性致病菌室温增菌液 1. 改良磷酸盐缓冲液小肠结肠炎耶尔森氏菌 4 ℃2. mEC增菌肉汤EHEC O157:H7/STEC 37 ℃3. Preston肉汤弯曲菌微需氧42 ℃4. SBG增菌液沙门氏菌37 ℃5. 3%氯化钠碱性蛋白胨水弧菌37 ℃选择性分离平板1. Mac平板EPEC、STEC、ETEC、EIEC、EAEC、志贺氏菌37 ℃2. XLD平板志贺氏菌37 ℃3. mCCD平板弯曲菌微需氧42 ℃4. 耶尔森氏菌选择性平板小肠结肠炎耶尔森氏菌25 ℃5. 科玛嘉O157:H7显色平板EHEC O157:H7 37 ℃6. 科玛嘉沙门氏菌显色平板沙门氏菌37 ℃7. 科玛嘉弧菌显色平板TCBS平板弧菌37 ℃病毒标本 1. 采便盒轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒-20 ℃以下（二）检验方法与流程3（三）沙门氏菌和志贺氏菌检测操作程序1 范围本程序规定了粪便标本中沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）的检验方法。
2 检验程序沙门氏菌和志贺氏菌检验程序见图1。
图1 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序3 操作步骤3.1 标本收集标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。
最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。
肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。
肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。
所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。
新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h 内送检。
3.2 分离培养3.2.1 直接分离培养新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在XLD 和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法Mic伪biological examination of food hygi叨ewe Examination of Salmonellae , Shigellae , and diarrhoea causative及cherich血coli妙means of thed泣agnostic typing phage set for enterobacteriaceae前言本标准对GB/T4789.31一1994袭食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌肠杆菌科噬菌体检验方法》进行修订。
本标准与GB/T4789.31一19料相比主要修改如下：―按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式和文字进行修改。
―规范原标准中的“设备和材料”。
本标准自实施之日起，GB/T4789.31一19944同时废止。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。
本标准起草单位：江西省卫生防疫站、中国疚病预防控制中心营养与食品安全所。
本标准主要起草人：何晓青、付萍、计融。
本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。
范围本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验．2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其墩新版本适用于本标准。
GB／T4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB/T4789.5一2003食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB/T4780.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3、设备和材料3.1恒温培养箱：36℃士1℃。
4789.5志贺菌检验
培养条件：41.5℃±1℃ 厌氧培养
原国标： 37℃需氧培养 ISO： 41.5℃厌氧培养 FDA： 42℃（除宋内其他志贺菌)和44℃（宋内）厌氧培养 NMKL： 42℃厌氧培养
食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验标准的修订
GB 4789.5
志贺氏菌
主要的肠道病原菌之一, 引起人类细菌性痢疾
尽管大量的分类学资料认为这类细菌应包括在大肠杆菌
（E.coli）内，但一些临床微生物学家往往仍当作一个独立的菌属
来对待。
伯杰手册(1984)中将其分为4个血清群(种)
A群痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae） B群福氏志贺氏菌（S.flexneri） C群鲍氏志贺氏菌（S.boydii） D群宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）。 这些菌群还可根据血清学再进一步分型。
实验结论
1.通过对五种不同染菌浓度0.1 cfu/g、0.5 cfu/g、 1 cfu/g 、5 cfu/g、 10 cfu/g的样品测定，用GN增菌 液需氧培养，宋内氏志贺菌的最低检出限为5 cfu/g； 福氏志贺氏菌的最低检出限为5 cfu/g；痢疾志贺氏菌 的最低检出限为10 cfu/g；鲍氏志贺氏菌的最低检出 限为10 cfu/g ；所以方法的检出限为5-20 cfu/25g。
现行GB/T 4789.5-2003标准不足 处
1. 采用的GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌 的生长速度大大超过志贺氏菌,所以检测效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制
食品微生物学检验 志贺氏菌检验作业指导书
食品微生物学检验志贺氏菌检验1、范围适用于食品中志贺氏菌的检验2、设备和材料2.1恒温培养箱：36℃±1℃2.2冰箱：2℃—5℃2.3厌氧培养装置：41.5℃±1℃2.4电子天平；2.5显微镜2.6均质器；2.7无菌吸管；2.8无菌均质杯；2.9无菌培养皿，直径90mm；2.10生化鉴定试剂盒；2.11比浊管及比浊管架；3、培养基和试剂3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素3.2麦康凯琼脂（MAC）3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）3.4志贺氏菌显色培养基3.5三糖铁琼脂3.6营养琼脂平面4、操作步骤4.1增菌以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片均质器以8000r/min~10000r/min均质，于41.5℃±1℃厌氧培养16h~20h。
4.2分离取增菌后的志贺氏菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h~24h，观察各个平板上生长的菌落形态，若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h进行观察。
志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1.表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征4.3 初步生化试验(1)自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI.半固体和营养琼脂斜面各一管。
置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。
(2)凡是三糖铁琼脂中斜面产碱，底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）.不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），不产硫化氢，半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的琼脂斜面上长的菌落，进行生化试验和血清学分型。
5、生化试验(1)生化试验（生化鉴定试剂盒）a.菌悬液的制备取一支盛有2ml无菌水的试管；用接种针挑取可疑菌落至无菌水中；仔细研磨，与标准浊度管比较，制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液。
食品微生物检验及2010国标(精)
• 每日检查 是否胖听、泄露开罐留样pH测定感 官检查涂片染色接种
GB4789.3-2010 大肠菌群测定
• 定义：Coliforms，一群在36℃培养48h可发酵 乳糖、产酸产气的需氧和 兼性厌氧革兰氏染色阴性 无芽孢杆菌。该菌主要来 源自人畜粪便，作为粪便 污染指标评价食品的卫生 状况，推断 食品中肠道致 病菌污染的可能。
食品卫生微生物学检验及国标 GB4789-2010
内 容 提 要
总则、菌落总数、霉菌酵母菌计数、商业无菌
大肠菌群计数
沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌检验方法
其他致病菌
食品卫生标准中的微生物指标
• 指示菌
– 概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全 性的指示性微生物 – 类型：一般性、特定性（如粪便污染）、其他 – 项目：菌落总数 、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群 – 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、溶血性 链球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、阪 崎肠杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希氏菌等 – 黄曲霉毒素B1 、B2等
结果表述
10-1 均数
255 多不 可计 12 330 0
10-2 均数
36 345 2 29 0
描
述
最终结果 2.6×103 3.5×104 1.2×102 2.9×103 1×10，10
均在30~300间则按计数公式 各平板均>300，取稀释度最高者 报告，余计为多不可数 均小于30则取稀释度最低者报告 所有平板均不在30~300CFU且一 部分<30 或>300者以最接近30或 300者报告 所有平板均无菌落则记为1乘以 最低稀释倍数报告
4789.5志贺菌检验
对可疑的食品，包括在使用前需用手处理的或 轻微加热的产品，且其酸度范围由PH5.5至6.5 之间。一般来说，当食品中含有大量的大肠菌 群，大肠杆菌与沙门氏菌时，同时即可疑含有 志贺氏菌。
现行GB/T 4789.5-2003标准不足处
1. 采用的GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌
的生长速度大大超过志贺氏菌,所以检测效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制 3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差异
修 订 原 则
1.以原国标为基础，保持与原标准的连续性
考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件尽可能 简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法
2.与国际接轨的原则
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，部分参 考采用了美国FDA、NMKL等标准
培 养 特 性
志贺氏菌属于革兰氏阴性短杆菌； 无芽孢、无荚膜、无鞭毛、不运动 需氧或兼性厌氧，营养要求不高，能在普通培 养基上生长 能利用葡萄糖与其他碳水化合物，产酸不产气。 除A群外，B 、 C 、 D群均能发酵甘露醇，除 D群外，A 、 C和D群均不发酵乳糖； D群具 有鸟氨酸脱羧酶
菌体（0）抗原 1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所 含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常 随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分 为A、B、C、D四个群及39个抗原型。 2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌 体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所 含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。
西蒙氏柠檬酸盐实验
挑取少量琼脂培养物接种，于36±1℃培 养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌 落生长，培养基从绿色转为蓝色。
志贺氏菌检验
志贺氏菌检验志贺氏菌属于肠杆菌科，是一种革兰氏阴性菌，会引起肠道感染，引发肠炎，当人出现连续性腹泻、腹痛等症状的时候，就需要考虑是否感染志贺氏菌。
志贺氏菌的传播途径主要是食物和水，比如沙拉、土豆、金枪鱼、虾、奶制品等，在密闭以及不卫生的条件下志贺氏菌会迅速传播，而且经常出现在人员比较密集的地方，比如餐厅、食堂等地。
食源性志贺氏菌的传播主要是因为从事食品工作的人员感染了志贺氏菌，并且将其传播到食物上所引起的，另外，保存食物的温度不当，也可能引起志贺氏菌。
志贺氏菌检验是临床上检验肠道感染疾病的一个重要途径，在检测过程中常用的方法有以下几种。
一、生化鉴定法常规的生化鉴定方法是志贺氏菌检验过程中的常用方法，需要对细菌进行增殖培养、分离、生化试验、血清学检验等步骤来完成，步骤比较繁琐，而且耗时较长，每一次一般只能检验一个样品，但是检测的结果比较准确，检测稳定性较高，假阳性率低。
二、免疫学检验方法免疫学是检验志贺氏菌最快速、准确的方法，特异性较强，而且灵敏度很高，主要的免疫学检验方法有以下几种：第一，酶联免疫法。
这种方法的灵敏度很高，而且简单快速，检测过程比较稳定，可以进行自动化操作，是志贺氏菌检测过程中最快速的一种方法。
但是，使用酶联免疫法进行检验的时候，影响检测结果的因素较多，而且假阳性率高，所以还需要采用其他的方法进行配合检验。
第二，SPA协同凝集法。
这种方法是使用已知标准血清吸附到含Ａ蛋白的金黄色葡萄球菌表面之后，让金黄色葡萄球菌成为吸附抗体的载体，再根据吸附的结果来诊断是否感染志贺氏菌的一种方法。
三、分子生物学方法分子生物学是建立在很多其他的检测技术基础上的，敏感度高、检测快速，而且特意性高，是生物技术革命的一个重要产物，目前在志贺氏菌的检测过程中十分常见。
志贺氏菌的分子生物学检测方法有以下几种：第一，聚合酶链式反应法，比如常规PCR、多重PCR法、实时荧光PCR法和恒温荧光PCR法等。
以恒温实时荧光PCR法为例，这种方法的原理是利用环介导等温扩增反应为原理进行测量的方法，灵敏度很高，与传统的荧光测量方法相比，灵敏度高出2～5个数量级，而且测量十分迅速，荧光反应的时间较短，一般30-60分钟就可以完成荧光反应。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃， PH7.2~7.4。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第11页
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞 第12页
• 2、对营养要求不高，在普通培养基生长良 好，37 ℃，24h，能形成菌落中等大小，直 径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润， 无色半透明，边缘整齐菌落
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第23页
四、微生物检验
（一）、基本步骤（程序定→汇报
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第24页
• 1、前增菌：用无选择性培养基使处于濒死状 态M恢复活力;
• 2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，基它 细菌变到抑制;
BS上菌落
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
SS上菌落
第28页
3、五项生化试验
H2S、靛基质 、 PH7.2尿素酶、KCN 、 赖氨酸脱羧酶
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第29页
（1）三糖铁培养培养
经典沙门氏菌在三糖铁培养上特征： 表面（-）粉红色、底层（+）黄色、 H2S （+）底层有黑色、有动
• 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长， 无菌膜。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第13页
• （三）、生化特征
• 1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤 寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）
• 2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇
• 3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-）， 不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（ V—P）（-），
• 3、选择性平板分离培养：分离出所需细菌;
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I
1，2，4，5，9……
＋＋－
2a
II
1，3，4……
＋－－
2b
II
1，7，8，9……
－－＋
3a
III
1，6，7，8，9……
－＋＋
3b
III
1，3，4，6……
＋＋－
4a
IV
1，（3，4）……
（＋）－－
4b
IV
1，3，4，6……
＋＋－
5a
V
1，3，4……
＋－－
5b
V
1，5，7，9……
－－＋
6
VI
1，2，（4）……
（＋）－－
X变体
－
1，7，8，9……
－－＋
Y变体
－
1，3，4……
＋－－
注：＋凝集；－不凝集；（）有或无。
3．2．2进一步的生化试验
在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖胺，西蒙氏柠檬酸盐。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，PH7.2尿素，氰化钾（KCN）生长，以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养基均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
食品志贺氏菌的检验方法
1．仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：45±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4均质器
1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃
1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm
1．7锥形瓶:500ml 灭菌吸管
1．10灭菌均质杯
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5％乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见下表：
志贺氏菌属四个群的生化特性
生化群
5％乳糖
甘露醇
棉子糖
甘油
靛基质
A群：痢疾志贺氏菌
－
－
－
（＋）
－/＋
B群：福氏志贺氏菌
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原
型和亚型
型抗原
群抗原
在群因子血清中的凝集
3，4 6 7，8
1a
I
1，2，4，5，9……
＋－－
2．13氨基酸脱羧酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸、及对照培养基
2．14糖发酵管
2．15 5％乳糖发酵管
2．16蛋白胨水、靛基质试剂
2．17志贺氏菌属诊断血清
3．检验程序
3．1分离和培养
3．2血清学分型和进一步的生化试验
3．2．1血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则A1、A2B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见下表。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
1．11酒精棉
1．12天平:感量0.1g
1.13冰箱：0-4℃和-15～-20℃
2．培养基的制备
2．1 GN增菌液
2．2 HE琼脂
2．3 SS琼脂
2．4麦康剀琼脂
2．5伊红美蓝琼脂
2．6三糖铁琼脂
2．7葡萄糖半固体
2．8半固体管
2．9葡萄糖胺琼脂
2．10尿素琼脂
2．11西蒙氏柠檬酸盐琼脂
2．12氰化钾（KCN）培养基
－
＋
＋
－
（＋）
C群：鲍氏志贺氏菌
－
＋
－
（＋）
－/＋
D群：宋内氏志贺氏菌
＋/（＋）
＋
＋
d
－
注：＋阳性；－阴性；－/＋多数阴性，（＋）迟缓阳性；d有不同生化型。
3．3结果报告
综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。