志贺氏菌检验
志贺氏菌检验
• 番红或沙磺复染：在涂片薄膜上滴加番红1滴，染色1 ~ 2 min。
• 水洗：用水冲洗至冲下的水呈无色为止。 • ห้องสมุดไป่ตู้燥：于室温下自然干燥。 • 观察：干燥后，于涂片薄膜上滴香柏油1滴，置油镜下观
察。 • 结果:
革兰氏阳性菌——紫色； 革兰氏阴性菌——红色。
志贺氏菌检验
革兰氏阴性短杆菌
增菌 分离 初步生化试验 血清凝集试验 革兰氏染色
增菌
固体样品：25g（电子天平）
稀释瓶或具
液体样品：25mL（25mL吸量管） 塞广口瓶
+ 225mLGN增菌液（量筒），混匀。
培养（于36℃±1℃培养6~8h）
注意：液体样品先用无菌NaOH或HCl调节PH至7.0。
结果：志贺氏菌多价血清：凝固 灭菌生理盐水：不凝固
革兰氏染色步骤：
涂片—— 火焰固定——结晶紫初 染—— 水洗—— 碘液媒染—— 乙醇 脱色—— 水洗—— 吸干—— 番红或 沙磺复染—— 水洗—— 干燥—— 镜 检
• 涂片：在载玻片中央滴一滴生理盐水，用无菌操作法挑取 菌种于生理盐水中，调匀并涂成薄膜。注意：生理盐水不 宜过多；涂片必须均匀。
分离
从阳性增菌液中用接种环取
1环
HE琼脂平板，划线
36℃±1 ℃培养
1环
麦康凯琼脂平板，划线
18~24h
HE琼脂平 板
麦康凯琼脂 平板
开始处
开始处
平板划线示意图
HE琼脂平板上的典型 菌落特征：呈透明， 不发酵乳糖菌落
麦康凯琼脂平板上的 典型菌落特征：呈透 明，不发酵乳糖菌落
初步生化试验
取有明显典型菌落的HE或麦康凯琼脂平板 （在放阳性物品处）
• 火焰固定：载玻片通过火焰1 ~ 2 次固定，不可过热，以载 玻片不烫手背为宜。
志贺氏菌检验方法
03
，如实验服、口罩、手套等。
样品处理注意事项
样品采集时应保证无菌操作，避免污染。
样品应尽快送至实验室进行检验，避免长时间存 放导致细菌繁殖。
样品处理过程中应保持清洁卫生，避免交叉污染 。
检验方法选择注意事项
1
根据样品类型和检验目的选择合适的检验方法。
2
对于不同种类的志贺氏菌，应选择具有针对性的 检验方法。
断结果。
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
利用特异性引物扩增志贺氏菌基因片段，通过凝胶电泳检 测扩增产物，判断是否存在志贺氏菌。
基因测序
对志贺氏菌基因进行测序分析，与其他已知基因序列进行 比对，以确定志贺氏菌的种属和亚种。
生物传感器技术
利用生物传感器检测志贺氏菌的代谢产物或特异性抗原， 通过信号转换器将生物信号转化为电信号，实现快速、灵 敏的检测。
食品样品的处理
采集到的食品样品应尽快送往实验室进行检验，如果不能及时送检，应将样品低 温保存，避免样品变质和污染。
04
志贺氏菌检验的注意事项
实验室安全注意事项
01
实验室应保持清洁卫生，定期进行消毒处理，确保无菌环境。
02
实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染和意外感染。
实验人员应接受专业培训，熟悉操作规程，佩戴个人防护装备
03
志贺氏菌检验的样品采集与处 理粪便样品的采集与处理粪便样品的采集
采集粪便样品时，应确保采集到新鲜 、未被污染的粪便，并尽量多采集一 些，以增加检出率。
粪便样品的处理
采集到的粪便样品应尽快送往实验室 进行检验，如果不能及时送检，应将 样品低温保存，避免样品干燥和污染 。
水样品的采集与处理
志贺氏菌的检验
免疫性：病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。
四、志贺氏菌的检验
1、增菌 称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL 广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎 1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻 璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8h。 培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混 浊时即应中止培养。 2、分离和初步生化试验 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平 板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝 琼脂平板各1个，于36℃培养18～24h。 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖 的菌落。
麦康凯琼脂平板
EMB平板照片及原理
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多 挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24h，分别观察结果。
动力试验
三糖铁（TSI）琼脂试 验的原理
1. Pseudomonas aeruginosa：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile
3、血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。 先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的 存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查； 如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分 别试验。 如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检 查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先 用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果， 依次选用型因子血清检查。 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价 1、2、3分别检查，并进一步用1～18各型因子血清检查。 如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多 价血清及各型因子血清检查。
志贺氏菌检验方法
未来展望与研究方向
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接种
将处理后的样品接种到培养基上，根据不同的实验需求，可采用不同的接种方法，如划线法、稀释法等。
培养基制备与接种
细菌鉴定
通过形态学观察、生化试验、血清学鉴定等方法，对培养出的细菌进行鉴定，以确定是否为志贺氏菌。
药敏试验
对鉴定的志贺氏菌进行药敏试验，以测定其对不同抗菌药物的敏感性和耐药性。
细菌鉴定与药敏试验
2023
《志贺氏菌检验方法》
志贺氏菌概述志贺氏菌的检验方法志贺氏菌检验的实验室操作流程志贺氏菌检验的临床意义及注意事项志贺氏菌检验方法的发展趋势与展望
contents
目录
01
志贺氏菌概述
志贺氏菌的特性
志贺氏菌是一种革兰阴性杆菌，无芽孢、无鞭毛，具有荚膜。
革兰阴性杆菌
需氧菌
耐酸
耐药性
志贺氏菌是一种需氧菌，生长繁殖需要氧气。
分离培养
通过对分离出的细菌进行形态学、生化反应等实验，确定是否为志贺氏菌。
鉴定
对分离出的志贺氏菌进行药敏试验，以确定其对抗菌药物的敏感性。
药敏试验
细菌培养法
酶联免疫吸附试验（ELISA）
免疫荧光抗体法
胶体金免疫层析法
免疫学检测法
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增志贺氏菌的特异性基因片段，以检测样本中的志贺氏菌。
免疫学方法中的ELISA等，可能会与其它相似菌种发生交叉反应，影响结果的准确性。
基因组学应用
01
利用基因组学技术，开发基于基因序列的检测方法，能够更快速、准确地检测志贺氏菌。
食品中志贺氏菌检验
食品微生物检验技术
无色至浅粉红色， 半透明、光滑、湿 润、圆形、边缘整 齐或不齐
白色，不透明、圆形、 边缘不整齐，直径1 mm～3 mm，菌落 周围琼脂颜色变为紫 红色
操作规程
已培养的营养琼脂斜面上生 长的菌苔，进行生化试验
二、志贺氏菌检测
ß-半乳糖苷酶
尿素
选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固 体、营养琼脂斜面，36℃1 ℃培养20h～24h，观察结果。
食品微生物检验技术
一、志贺氏菌概况
概述
志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临 床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆 菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌 引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性 中毒性菌痢，死亡率甚高。
一、志贺氏菌概况
需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2-7.4； 在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、
在中等大小的菌落； 宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落
呈玫瑰红色； 在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
增菌：用GN增菌液使处于 濒死状态的细菌恢复活力
报告
二、志贺氏菌检测
操作规程
225ml 志贺氏 菌增菌液增菌
选择性增菌
细胞数量增殖 液体 25mL 摇匀
样品
25g 均质
固体 样品
鉴别培养基
寻找可疑典型菌落
穿刺划斜面
TSI、营养琼脂、半固体培养基
41.5±1℃
16~18h 厌氧培养
志贺氏菌检验
1 宋内氏典型菌落
XLD
志显
2 福氏典型菌落
XLD
志显
3 鲍氏典型菌落
XLD
志显
4 痢疾典型菌落
XLD
志显
5 熟肉制品中宋内的分离效果
R&F志显
XLD
6 蔬菜制品中宋内分离效果
XLD
志显
7 鲍氏在生肉中的分离效果
XLD
志显
8 熟肉制品中福氏的分离效果
志显
（四）初 步 生 化
• 选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖 半固体、营养琼脂斜面，36 ℃1 ℃培养20 h～24 h， 观察结果。
白色不透明圆形边缘不整齐直mm3mm菌落周围琼脂颜色变为紫红色宋内氏典型菌落xldxldxld熟肉制品中宋内的分离效果rf志显xld蔬菜制品中宋内分离效果xld鲍氏在生肉中的分离效果xld选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种tsi葡萄糖半固体营养琼脂斜面36培养20h24培养物中出现以下情况可以弃去a
（二）、培养特性
1 、 需 氧 或 兼 氧 性 厌 氧 ， 最 适 温 度 37℃ ， PH7.2~7.4
2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、 光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小 的菌落
3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁 平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。
4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
• 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察， 则继续培养至48 h再进行观察。
菌落特征
• MAC琼脂 ：无色至浅粉红色， 半透明、光滑、 湿润、圆形、 边缘整齐或不齐，直径2～3 mm
• XLD琼脂 ：粉红色至无色，半 透明、光滑、 湿润、圆形、边缘整齐或不齐， 直径1 ～2 mm
志贺氏菌的检验
志贺氏菌的检验汇报人：2024-01-06•志贺氏菌概述•志贺氏菌检验方法•志贺氏菌检验过程目录•志贺氏菌检验的注意事项•志贺氏菌检验的应用01志贺氏菌概述志贺氏菌属于革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无鞭毛，一般不形成荚膜。
革兰氏阴性杆菌需氧或微需氧抗原构造志贺氏菌在需氧或微需氧环境中生长良好，适宜温度为37℃。
志贺氏菌具有O抗原、K抗原和H抗原，其中O抗原是主要的毒力因子。
030201志贺氏菌的特性志贺氏菌随粪便排出体外，污染水源或食物，经口摄入后感染。
粪口途径传播接触被志贺氏菌污染的物品或环境，再经口摄入感染。
接触传播在医疗机构中，患者与医务人员、其他患者之间因接触而传播。
医疗机构传播志贺氏菌的传播途径志贺氏菌的危害肠道感染志贺氏菌主要引起肠道感染，导致腹泻、腹痛等症状。
败血症严重感染时，志贺氏菌可进入血液，引起败血症。
脑膜炎在特定情况下，如免疫功能低下，志贺氏菌可引起脑膜炎等严重并发症。
02志贺氏菌检验方法选择适合志贺氏菌生长的培养基，如SS琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基等。
培养基在37℃恒温条件下培养24-48小时，观察菌落形态、染色特性等特征。
培养条件通过生化试验、血清学试验等方法对培养出的菌落进行鉴定，以确定是否为志贺氏菌。
鉴定细菌培养法03胶体金免疫层析法利用胶体金标记的抗体与抗原的结合反应，通过肉眼观察或仪器检测金颗粒的聚集状态。
01酶联免疫吸附试验（ELISA）利用特异性抗体与抗原的结合反应，通过酶标记技术进行信号放大和检测。
02免疫荧光技术利用荧光标记的抗体与抗原的结合反应，通过荧光显微镜观察荧光信号。
免疫学检测法核酸检测法聚合酶链式反应（PCR）通过特异性引物扩增志贺氏菌的DNA片段，通过凝胶电泳检测扩增产物。
基因测序对志贺氏菌的基因组进行测序，通过比对已知基因序列确定菌种。
利用生物分子识别元件（如酶、抗体、核酸等）与目标物质特异性结合，将信号转换为可检测的电信号或光信号。
用于食品、水源等样品中志贺氏菌的快速检测，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
志贺氏菌检测
志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g ,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎lmin ,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培育6〜8h。
培育时间视细菌生长状况而定，当培育液消失稍微混浊时即应中止培育。
二、分别和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36工培育18~24h e志贺氏菌在这些培育基上呈现无色透亮不发酵乳糖的菌落。
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培育18~24h ,分别观看结果。
下述培育物可以弃去：a.在三糖铁琼脂斜面上呈扩散生长的培育物；b.在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培育物;C.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培育物；d.产气的培育物；e.有动力的培育物；f.产生硫化氢的培育物。
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培育物，做玻片凝集试验。
先用4种志贺氏菌多价血清检查，假如由于K抗原的存在而不消失凝集，应将菌液煮沸后再检查；假如呈现凝集，则用Al、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表10可先用群因子血清检查，再依据群因子血清消失凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。
假如鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。
四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖镀西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱竣酶pH7.2尿素KCN生长水杨昔和七叶昔的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培育物均为阴性结果。
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培养条件：41.5℃±1℃ 厌氧培养
原国标： 37℃需氧培养 ISO： 41.5℃厌氧培养 FDA： 42℃（除宋内其他志贺菌)
和44℃（宋内）厌氧培养 NMKL： 42℃厌氧培养
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分离用平板
原国标：HE或SS; MAC或EMB ISO： MAC、 XLD 、 HE FDA： MAC NMKL： MAC、 XLD 、 HE
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GB/T 4789.5-2003 标准不足处
1. 采用GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后 大肠菌的生长速度大大超过志贺氏菌, 检测 效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制 3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差
异
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增菌：用GN增菌液使 处于濒死状态的细菌 恢复活力
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（三）、生化反应
1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺 氏菌外，均不发酵乳糖。
2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。 3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，
不能利用柠檬酸盐。 4、甲基红阳性。
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（四）、抗原结构
1、抗原构成： O抗原：
群特异性抗原：A、B、C、D K抗原：除B群外，一般有K抗原
• 1994年5月11日，江苏省无锡市发生一起26 所小学的学生因课间餐食用豆奶导致1345 人食物中毒的事故，后经调查是一起志贺 菌和致病性大肠杆菌混合感染引起的食物 中毒，此次爆发波及范围之大，发病人数 之多，在我国历史上颇为少见。
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• 志贺菌致病力强，少量细菌进入人体即可 引起发病。是否发病，取决于细菌数量、 致病力（粘附、侵袭力、毒素）和人体的 抵抗力。
志贺氏菌的检验
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一、流行病学简介
• 一种古老的肠道传染性腹泻。19世纪曾出现全世 界菌痢的大流行。
• 1899年，日本人志贺氏首先发现菌痢是由痢疾杆 菌引起。
• 第一次世界大战期间（1914-1918年），德国死 于痢疾者约4万余人，并进一步证实痢疾杆菌是 菌痢流行的病原。
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• 细菌性痢疾历年来一直是我国夏秋季发病 率最高的肠道传染病。
• 各种志贺菌都可以产生强烈的内毒素，是 引起全身毒血症的主要因素。志贺菌还可 产生外毒素（志贺毒素），具有神经毒、 细胞毒和肠毒性作用，能引起更严重的临 床表现如溶血性尿毒综合症等。
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二、生物学特性
• （一）、形态与染色 • 革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无
鞭毛 • • 2~3um*0.5~0.7um
考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件 尽可能简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法
2.与国际接轨的原则
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ， 部分参考采用了美国FDA、NMKL等标准
精பைடு நூலகம்课件
3.与现有已颁布的新版国家标准协调 统一
参考了已颁布的2008版国标，在样品 的前处理步骤，培养条件的选择，文字 描述等方面尽量 保持一致。
• 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察， 则继续培养至48 h再进行观察。
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菌落特征
• MAC琼脂 ：无色至浅粉红色， 半透明、光滑、 湿润、圆形、 边缘整齐或不齐，直径2～3 mm
• XLD琼脂 ：粉红色至无色，半 透明、光滑、 湿润、圆形、边缘整齐或不齐， 直径1 ～2 mm
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R&F志贺氏菌显色琼脂 ：白色，不透明、圆形、 边缘不整齐，直径1 mm～3 mm，菌落周围琼脂 颜色变为紫红色
• 近年来报道非洲及中美洲流行的痢疾志贺 菌病死率达5%-15%。
• 我国属发展中国家，人民的生活条件虽然 在不断改善，但由于部分地区卫生知识普 及不够，食品卫生管理、监督不力，使得 志贺菌的感染在我国传染病中多年来一直 处于较高的地位。
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• 每年均有志贺菌感染暴发的报告，每次暴 发的发病人数在数十人到上千人不等。多 数由于食物和饮水污染引起。
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（二）、培养特性
1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.4 2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、
光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小 的菌落 3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁 平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。 4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
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2、志贺氏菌的分群与血清型
志贺氏菌分为四群： A群（痢疾志贺氏菌）：1~10型
B群（福氏志贺氏菌）：1~6型+X、Y两个变种， C群（鲍氏志贺氏菌 ）：1~15型 D群（宋内氏志贺氏菌） ：1个型
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三、志贺氏菌检验
GB 4789.5-2012
1.以原国标为基础，保持与原标准的连续性
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（一）增 菌 培 养
用志贺氏菌增菌液增菌, 41.5 ℃±１℃，16 h～20 h厌氧
培养。
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智能厌氧微需氧培养系统
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（二）分 离 培 养
• 取增菌后的GN增菌液或志贺氏增菌肉汤分 别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板 或R&F志贺氏菌显色培养基平板上
• 于36 ℃1 ℃培养20 h～24 h，观察各个 平板上生长的菌落形态
选择性平板分离培养： XLD+MAC/显色培养基
生化试验：可采用 API 20E或VITEK2
血清学鉴定：特异性 诊断血清鉴定到种。
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志贺氏菌操作流程
修改的内容
增菌部分
志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL ）
原国标：GN ISO ：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL ） FDA：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL 和3 μg/mL ） NMKL：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 μg/mL ）
8 熟肉制品中福氏的分离效果
志显
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（四）初 步 生 化
• 选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖 半固体、营养琼脂斜面，36 ℃1 ℃培养20 h～24 h， 观察结果。
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1 宋内氏典型菌落
XLD
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志显
2 福氏典型菌落
XLD
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志显
3 鲍氏典型菌落
志显
XLD
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4 痢疾典型菌落
XLD
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志显
5 熟肉制品中宋内的分离效果
R&F志显
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XLD
6 蔬菜制品中宋内分离效果
XLD
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志显
7 鲍氏在生肉中的分离效果
XLD
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志显