志贺氏菌的检验
志贺氏菌检验
• 番红或沙磺复染：在涂片薄膜上滴加番红1滴，染色1 ~ 2 min。
• 水洗：用水冲洗至冲下的水呈无色为止。 • ห้องสมุดไป่ตู้燥：于室温下自然干燥。 • 观察：干燥后，于涂片薄膜上滴香柏油1滴，置油镜下观
察。 • 结果:
革兰氏阳性菌——紫色； 革兰氏阴性菌——红色。
志贺氏菌检验
革兰氏阴性短杆菌
增菌 分离 初步生化试验 血清凝集试验 革兰氏染色
增菌
固体样品：25g（电子天平）
稀释瓶或具
液体样品：25mL（25mL吸量管） 塞广口瓶
+ 225mLGN增菌液（量筒），混匀。
培养（于36℃±1℃培养6~8h）
注意：液体样品先用无菌NaOH或HCl调节PH至7.0。
结果：志贺氏菌多价血清：凝固 灭菌生理盐水：不凝固
革兰氏染色步骤：
涂片—— 火焰固定——结晶紫初 染—— 水洗—— 碘液媒染—— 乙醇 脱色—— 水洗—— 吸干—— 番红或 沙磺复染—— 水洗—— 干燥—— 镜 检
• 涂片：在载玻片中央滴一滴生理盐水，用无菌操作法挑取 菌种于生理盐水中，调匀并涂成薄膜。注意：生理盐水不 宜过多；涂片必须均匀。
分离
从阳性增菌液中用接种环取
1环
HE琼脂平板，划线
36℃±1 ℃培养
1环
麦康凯琼脂平板，划线
18~24h
HE琼脂平 板
麦康凯琼脂 平板
开始处
开始处
平板划线示意图
HE琼脂平板上的典型 菌落特征：呈透明， 不发酵乳糖菌落
麦康凯琼脂平板上的 典型菌落特征：呈透 明，不发酵乳糖菌落
初步生化试验
取有明显典型菌落的HE或麦康凯琼脂平板 （在放阳性物品处）
• 火焰固定：载玻片通过火焰1 ~ 2 次固定，不可过热，以载 玻片不烫手背为宜。
志贺氏菌检验方法
03
，如实验服、口罩、手套等。
样品处理注意事项
样品采集时应保证无菌操作，避免污染。
样品应尽快送至实验室进行检验，避免长时间存 放导致细菌繁殖。
样品处理过程中应保持清洁卫生，避免交叉污染 。
检验方法选择注意事项
1
根据样品类型和检验目的选择合适的检验方法。
2
对于不同种类的志贺氏菌，应选择具有针对性的 检验方法。
断结果。
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
利用特异性引物扩增志贺氏菌基因片段，通过凝胶电泳检 测扩增产物，判断是否存在志贺氏菌。
基因测序
对志贺氏菌基因进行测序分析，与其他已知基因序列进行 比对，以确定志贺氏菌的种属和亚种。
生物传感器技术
利用生物传感器检测志贺氏菌的代谢产物或特异性抗原， 通过信号转换器将生物信号转化为电信号，实现快速、灵 敏的检测。
食品样品的处理
采集到的食品样品应尽快送往实验室进行检验，如果不能及时送检，应将样品低 温保存，避免样品变质和污染。
04
志贺氏菌检验的注意事项
实验室安全注意事项
01
实验室应保持清洁卫生，定期进行消毒处理，确保无菌环境。
02
实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染和意外感染。
实验人员应接受专业培训，熟悉操作规程，佩戴个人防护装备
03
志贺氏菌检验的样品采集与处 理粪便样品的采集与处理粪便样品的采集
采集粪便样品时，应确保采集到新鲜 、未被污染的粪便，并尽量多采集一 些，以增加检出率。
粪便样品的处理
采集到的粪便样品应尽快送往实验室 进行检验，如果不能及时送检，应将 样品低温保存，避免样品干燥和污染 。
水样品的采集与处理
志贺氏菌检验方法
未来展望与研究方向
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接种
将处理后的样品接种到培养基上，根据不同的实验需求，可采用不同的接种方法，如划线法、稀释法等。
培养基制备与接种
细菌鉴定
通过形态学观察、生化试验、血清学鉴定等方法，对培养出的细菌进行鉴定，以确定是否为志贺氏菌。
药敏试验
对鉴定的志贺氏菌进行药敏试验，以测定其对不同抗菌药物的敏感性和耐药性。
细菌鉴定与药敏试验
2023
《志贺氏菌检验方法》
志贺氏菌概述志贺氏菌的检验方法志贺氏菌检验的实验室操作流程志贺氏菌检验的临床意义及注意事项志贺氏菌检验方法的发展趋势与展望
contents
目录
01
志贺氏菌概述
志贺氏菌的特性
志贺氏菌是一种革兰阴性杆菌，无芽孢、无鞭毛，具有荚膜。
革兰阴性杆菌
需氧菌
耐酸
耐药性
志贺氏菌是一种需氧菌，生长繁殖需要氧气。
分离培养
通过对分离出的细菌进行形态学、生化反应等实验，确定是否为志贺氏菌。
鉴定
对分离出的志贺氏菌进行药敏试验，以确定其对抗菌药物的敏感性。
药敏试验
细菌培养法
酶联免疫吸附试验（ELISA）
免疫荧光抗体法
胶体金免疫层析法
免疫学检测法
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增志贺氏菌的特异性基因片段，以检测样本中的志贺氏菌。
免疫学方法中的ELISA等，可能会与其它相似菌种发生交叉反应，影响结果的准确性。
基因组学应用
01
利用基因组学技术，开发基于基因序列的检测方法，能够更快速、准确地检测志贺氏菌。
食品中志贺氏菌检验
食品微生物检验技术
无色至浅粉红色， 半透明、光滑、湿 润、圆形、边缘整 齐或不齐
白色，不透明、圆形、 边缘不整齐，直径1 mm～3 mm，菌落 周围琼脂颜色变为紫 红色
操作规程
已培养的营养琼脂斜面上生 长的菌苔，进行生化试验
二、志贺氏菌检测
ß-半乳糖苷酶
尿素
选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固 体、营养琼脂斜面，36℃1 ℃培养20h～24h，观察结果。
食品微生物检验技术
一、志贺氏菌概况
概述
志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临 床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆 菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌 引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性 中毒性菌痢，死亡率甚高。
一、志贺氏菌概况
需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2-7.4； 在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、
在中等大小的菌落； 宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落
呈玫瑰红色； 在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
增菌：用GN增菌液使处于 濒死状态的细菌恢复活力
报告
二、志贺氏菌检测
操作规程
225ml 志贺氏 菌增菌液增菌
选择性增菌
细胞数量增殖 液体 25mL 摇匀
样品
25g 均质
固体 样品
鉴别培养基
寻找可疑典型菌落
穿刺划斜面
TSI、营养琼脂、半固体培养基
41.5±1℃
16~18h 厌氧培养
志贺氏菌检验
1 宋内氏典型菌落
XLD
志显
2 福氏典型菌落
XLD
志显
3 鲍氏典型菌落
XLD
志显
4 痢疾典型菌落
XLD
志显
5 熟肉制品中宋内的分离效果
R&F志显
XLD
6 蔬菜制品中宋内分离效果
XLD
志显
7 鲍氏在生肉中的分离效果
XLD
志显
8 熟肉制品中福氏的分离效果
志显
（四）初 步 生 化
• 选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖 半固体、营养琼脂斜面，36 ℃1 ℃培养20 h～24 h， 观察结果。
白色不透明圆形边缘不整齐直mm3mm菌落周围琼脂颜色变为紫红色宋内氏典型菌落xldxldxld熟肉制品中宋内的分离效果rf志显xld蔬菜制品中宋内分离效果xld鲍氏在生肉中的分离效果xld选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种tsi葡萄糖半固体营养琼脂斜面36培养20h24培养物中出现以下情况可以弃去a
（二）、培养特性
1 、 需 氧 或 兼 氧 性 厌 氧 ， 最 适 温 度 37℃ ， PH7.2~7.4
2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、 光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小 的菌落
3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁 平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。
4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
• 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察， 则继续培养至48 h再进行观察。
菌落特征
• MAC琼脂 ：无色至浅粉红色， 半透明、光滑、 湿润、圆形、 边缘整齐或不齐，直径2～3 mm
• XLD琼脂 ：粉红色至无色，半 透明、光滑、 湿润、圆形、边缘整齐或不齐， 直径1 ～2 mm
志贺氏菌的检验
志贺氏菌的检验汇报人：2024-01-06•志贺氏菌概述•志贺氏菌检验方法•志贺氏菌检验过程目录•志贺氏菌检验的注意事项•志贺氏菌检验的应用01志贺氏菌概述志贺氏菌属于革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无鞭毛，一般不形成荚膜。
革兰氏阴性杆菌需氧或微需氧抗原构造志贺氏菌在需氧或微需氧环境中生长良好，适宜温度为37℃。
志贺氏菌具有O抗原、K抗原和H抗原，其中O抗原是主要的毒力因子。
030201志贺氏菌的特性志贺氏菌随粪便排出体外，污染水源或食物，经口摄入后感染。
粪口途径传播接触被志贺氏菌污染的物品或环境，再经口摄入感染。
接触传播在医疗机构中，患者与医务人员、其他患者之间因接触而传播。
医疗机构传播志贺氏菌的传播途径志贺氏菌的危害肠道感染志贺氏菌主要引起肠道感染，导致腹泻、腹痛等症状。
败血症严重感染时，志贺氏菌可进入血液，引起败血症。
脑膜炎在特定情况下，如免疫功能低下，志贺氏菌可引起脑膜炎等严重并发症。
02志贺氏菌检验方法选择适合志贺氏菌生长的培养基，如SS琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基等。
培养基在37℃恒温条件下培养24-48小时，观察菌落形态、染色特性等特征。
培养条件通过生化试验、血清学试验等方法对培养出的菌落进行鉴定，以确定是否为志贺氏菌。
鉴定细菌培养法03胶体金免疫层析法利用胶体金标记的抗体与抗原的结合反应，通过肉眼观察或仪器检测金颗粒的聚集状态。
01酶联免疫吸附试验（ELISA）利用特异性抗体与抗原的结合反应，通过酶标记技术进行信号放大和检测。
02免疫荧光技术利用荧光标记的抗体与抗原的结合反应，通过荧光显微镜观察荧光信号。
免疫学检测法核酸检测法聚合酶链式反应（PCR）通过特异性引物扩增志贺氏菌的DNA片段，通过凝胶电泳检测扩增产物。
基因测序对志贺氏菌的基因组进行测序，通过比对已知基因序列确定菌种。
利用生物分子识别元件（如酶、抗体、核酸等）与目标物质特异性结合，将信号转换为可检测的电信号或光信号。
用于食品、水源等样品中志贺氏菌的快速检测，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
志贺氏菌检测
志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g ,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎lmin ,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培育6〜8h。
培育时间视细菌生长状况而定，当培育液消失稍微混浊时即应中止培育。
二、分别和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36工培育18~24h e志贺氏菌在这些培育基上呈现无色透亮不发酵乳糖的菌落。
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培育18~24h ,分别观看结果。
下述培育物可以弃去：a.在三糖铁琼脂斜面上呈扩散生长的培育物；b.在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培育物;C.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培育物；d.产气的培育物；e.有动力的培育物；f.产生硫化氢的培育物。
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培育物，做玻片凝集试验。
先用4种志贺氏菌多价血清检查，假如由于K抗原的存在而不消失凝集，应将菌液煮沸后再检查；假如呈现凝集，则用Al、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表10可先用群因子血清检查，再依据群因子血清消失凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。
假如鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。
四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖镀西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱竣酶pH7.2尿素KCN生长水杨昔和七叶昔的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培育物均为阴性结果。
志贺氏菌检验
志贺氏菌检验志贺氏菌属于肠杆菌科，是一种革兰氏阴性菌，会引起肠道感染，引发肠炎，当人出现连续性腹泻、腹痛等症状的时候，就需要考虑是否感染志贺氏菌。
志贺氏菌的传播途径主要是食物和水，比如沙拉、土豆、金枪鱼、虾、奶制品等，在密闭以及不卫生的条件下志贺氏菌会迅速传播，而且经常出现在人员比较密集的地方，比如餐厅、食堂等地。
食源性志贺氏菌的传播主要是因为从事食品工作的人员感染了志贺氏菌，并且将其传播到食物上所引起的，另外，保存食物的温度不当，也可能引起志贺氏菌。
志贺氏菌检验是临床上检验肠道感染疾病的一个重要途径，在检测过程中常用的方法有以下几种。
一、生化鉴定法常规的生化鉴定方法是志贺氏菌检验过程中的常用方法，需要对细菌进行增殖培养、分离、生化试验、血清学检验等步骤来完成，步骤比较繁琐，而且耗时较长，每一次一般只能检验一个样品，但是检测的结果比较准确，检测稳定性较高，假阳性率低。
二、免疫学检验方法免疫学是检验志贺氏菌最快速、准确的方法，特异性较强，而且灵敏度很高，主要的免疫学检验方法有以下几种：第一，酶联免疫法。
这种方法的灵敏度很高，而且简单快速，检测过程比较稳定，可以进行自动化操作，是志贺氏菌检测过程中最快速的一种方法。
但是，使用酶联免疫法进行检验的时候，影响检测结果的因素较多，而且假阳性率高，所以还需要采用其他的方法进行配合检验。
第二，SPA协同凝集法。
这种方法是使用已知标准血清吸附到含Ａ蛋白的金黄色葡萄球菌表面之后，让金黄色葡萄球菌成为吸附抗体的载体，再根据吸附的结果来诊断是否感染志贺氏菌的一种方法。
三、分子生物学方法分子生物学是建立在很多其他的检测技术基础上的，敏感度高、检测快速，而且特意性高，是生物技术革命的一个重要产物，目前在志贺氏菌的检测过程中十分常见。
志贺氏菌的分子生物学检测方法有以下几种：第一，聚合酶链式反应法，比如常规PCR、多重PCR法、实时荧光PCR法和恒温荧光PCR法等。
以恒温实时荧光PCR法为例，这种方法的原理是利用环介导等温扩增反应为原理进行测量的方法，灵敏度很高，与传统的荧光测量方法相比，灵敏度高出2～5个数量级，而且测量十分迅速，荧光反应的时间较短，一般30-60分钟就可以完成荧光反应。
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（一）样品处理 无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌 液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以800010000r/min打碎1min。 （二）增菌培养 放于36℃培养6～8h。 培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微 混浊时即应中止培养。
第二次 接种选择性平板进行分离培养
志贺氏菌在TSI生长的结果（现象）： （1）斜面产碱仍为红色或粉红色； （2）底层产酸不产气，变黄色； （3）不产H2S，不出现黑色。
志贺氏菌在葡萄糖半固体培养基生长：沿线生 长，无动力。
ห้องสมุดไป่ตู้
葡萄糖半固体原理及结果。 三糖铁（TSI）琼脂试验的原理
2－志贺氏菌
3－沙门氏菌
4－大肠杆菌
1. 铜绿假单胞菌 2. 志贺氏菌 3. 枯草芽孢杆菌
（一）进一步生化试验 即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和 鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以 及水杨苷和七叶苷的分解， 36℃培养。 志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。
（二）生化分群试验
接种生化培养基 从三糖铁琼脂上挑取培养物上,接种到： 5%乳糖发酵、甘露醇、棉籽糖和甘油发酵、靛基质 试验。 见P167：根据不同生化反应结果，可分为A群（痢 疾志贺氏菌）、B群（福氏志贺氏菌）、C群（鲍 氏志贺氏菌）、D群（宋内氏志贺氏菌）。
不发酵乳糖，菌落呈蓝绿色或蓝色 可能就是志贺氏菌
SS平板原理及反应 SS Agar (Salmonella Shigella Agar)
是沙门氏菌。有黑色中心。 如果没有黑色中心，就很可能 是志贺氏菌了
大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌
麦康凯琼脂平板
菌落为粉红色，半透明的，
可能为志贺氏菌
EMB平板照片及原理
（三）结果报告 综合生化试验结果判定菌型并作出报告
在志贺氏菌检验中可弃去的培养物：
（1）在TSI表面上呈现蔓延生长的培养物 （2）在18~24h发酵乳糖、蔗糖的培养物 （3）不分解葡萄糖，只在半固体培养基表面生长 的培养物。 （4）产气的培养物 （5）有动力的培养物 （6）产H2S的培养物
第四天、进一步的 生化试验
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气 (福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动 力的菌株，可做进一步的生化试验和生化 分型实验。
GB/T4789.5-2003 中志贺氏菌检验程序
（一）实验内容
样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分 离→→生化学试验→→结果报告
第一次 样品处理和增菌培养
预先准备并灭菌的器材 规格名称 • 1、18×180mm试管
数量
6支
• • • •
2、10ml移液管 1支 3、直径为90mm平皿 2套 4、250ml量筒与500毫升广口瓶 酌情 7 、不锈钢汤匙1把 ，玻璃珠，杜氏小管 酌情
（一）接种选择性平板 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂 平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或 EMB（伊红美蓝）琼脂平板各1个。 （二）培养 放于36℃培养18～24h。 结果：志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发 酵乳糖的菌落
HE平板原理及反应
发酵乳糖的肠杆菌
不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生 硫化氢，可能是沙门氏菌
志贺氏菌的检验
一、生物学特性 （一）形态与染色 革兰氏阴性短杆菌、无荚 膜，无芽胞，无鞭毛， 有菌毛
2~3um*0.5~0.7um
（二）培养特性
1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH6。 4~7.8 2 、在普通琼脂和 SS 平板上，能形成圆形、 微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、 在中等大小的菌落 3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙 而扁平，在 SS平板上可迟发酵乳糖，菌落 呈玫瑰红色。 4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
二、志贺氏菌的致病性与食物中毒 • （一）传染源 • 食物、病人、粪便、苍蝇等
（二）志贺氏菌的致病性
致病因素： 侵袭力、菌体内毒素、外毒素 临床症状 A、急性细菌性痢疾： 急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。 B、慢性细菌性痢疾： 慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。
三、志贺氏 菌的检验
（三）生化反应
1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏 菌外，均不发酵乳糖。 2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。 3 、不产生 H2S ，不分解尿素， V-P 试验阴性， 不能利用柠檬酸盐。 4、甲基红阳性，靛基质不定。 5、痢疾志贺氏菌不分解甘露醇，其它（福氏、 鲍氏、宋内氏）均可分解甘露醇。
菌落为无色半透明状， 可能为志贺氏菌
大肠杆菌
第三次 初步生化试验
（一）接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基 从HE或SS、麦康凯或EMB琼脂平板、挑取平板 上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体 各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。经 36℃培养18～24h，分别观察结果。 （二）培养 放于36℃培养18～24h。 结果：乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福 氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力
各项生化试验现象
• 葡萄糖铵：阳性者斜面上有正常大小的菌落生长，阴性者 不生长或生长极微小的菌落。 • 西蒙氏柠檬酸盐：阳性者斜面上菌落生长，培养基由绿色 转为蓝色，阴性者不生长。 • 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶：阳性者为紫色，阴性者为黄色。 • pH7.2尿素：阳性者为红色，阴性者为黄色。 • KCN：阳性者细菌生长，阴性者细菌不生长。 • 水杨苷和七叶苷：阳性者产气。