食品中志贺氏菌检验
食品中志贺氏菌检验
志贺氏菌的致病性
细菌性痢疾是最常见的肠道传染病,夏秋两季患者 最多。传染源主要为病人和带菌者,通过污染了痢 疾杆菌的食物、饮水等经口感染。 志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途 径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量 病菌（至少为10个细胞）进入，就有可能致病。 人类对志贺氏菌易感，10～200个细菌可使10～ 50%志愿者致病。
志贺氏菌属的分类
志贺氏菌的抗原有K和O抗原而无H抗原。K抗原 是自患者新分离的某些菌株的菌体表面抗原，丌 耐热，加热100℃1小时被破坏。K抗原在血清学 分型上无意义
根据志贺氏菌菌体（O）抗原和分解甘露醇的能 力，将其分为4群，即痢疾志贺氏菌（A群），福 氏志贺氏菌（B群），鲍氏志贺氏菌（C群）和宋 内氏志贺氏菌（D群）。
志贺氏菌属的抵抗力
本菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆菌为弱。 对酸敏感，在外界环境中的抵抗力能以宋内氏菌 最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般56～ 60℃经10分钟即被杀死。在37℃水中存活20天， 在冰块中存活96天，蝇肠内可存活9～10天，对 化学消毒剂敏感，1%石碳酸15～30分钟死亡。
致病机理
侵袭力
内毒素 外毒素
侵袭力
志贺氏菌进入大肠后，由于菌毛的作用粘附于大 肠粘膜的上皮细胞上，继而进入上皮细胞并在内 繁殖，扩散至邻近细胞及上皮下层。由于毒素的 作用，上皮细胞死亡，粘膜下发炎，并有毛细吸 管血栓形成以至坏死、脱落，形成溃疡。志贺氏 菌一般丌侵犯其他组织，偶尔可引起败血症。目 前认为丌论是产生外毒素的还是只有内毒素的志 贺氏菌，必须侵入肠壁才能致病。因此，对粘膜 组织的侵袭力是决定致病力的主要因素。
志贺氏菌属
人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，营养丌良的 幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。 细菌性痢疾是其导致的常见的肠道传染病,夏秋两 季患者最多。传染源主要为病人和带菌者,通过污 染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。
《食品检验工》(三级)志贺氏菌
试题单
试题代码：1.1.1
试题名称：乳粉志贺氏菌检验
规定用时：240min
1、操作条件
（1）乳粉样品
（2）生物安全柜
（3）志贺氏菌检验培养基和试剂
（4）检验常用玻璃器皿
（5）检验设备
（6）常用耗材
（7）检验方法标准（GB/T 4789.5-2003）（8）志贺氏菌阳性平板、阳性生化管培养物
2、操作内容
（1）选择检验设备、培养基和稀释液
（2）检验乳粉中志贺氏菌
（3）对考场提供的阳性培养物进行检验操作（4）填写检验原始记录，对检验结果做出判定（5）实验后消毒处理
3、操作要求
（1）正确选择检验设备、培养基和以及试剂（2）按检验方法标准操作
a．无菌操作
b．样品制备
c．检验操作步骤
d．检验结果观察并作判断
（3）逐项填写实验记录
（4）做好实验后消毒处理工作
答题卷
试题代码：1.1.1
姓名：准考证号：1、选用设备和培养基试剂
2、实验记录表
食品检验工（三级）操作技能鉴定试题评分表与参考答案
考评员（签名）：考评日期。
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法Mic伪biological examination of food hygi叨ewe Examination of Salmonellae , Shigellae , and diarrhoea causative及cherich血coli妙means of thed泣agnostic typing phage set for enterobacteriaceae前言本标准对GB/T4789.31一1994袭食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌肠杆菌科噬菌体检验方法》进行修订。
本标准与GB/T4789.31一19料相比主要修改如下：―按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式和文字进行修改。
―规范原标准中的“设备和材料”。
本标准自实施之日起，GB/T4789.31一19944同时废止。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。
本标准起草单位：江西省卫生防疫站、中国疚病预防控制中心营养与食品安全所。
本标准主要起草人：何晓青、付萍、计融。
本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。
范围本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验．2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其墩新版本适用于本标准。
GB／T4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB/T4789.5一2003食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB/T4780.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3、设备和材料3.1恒温培养箱：36℃士1℃。
《食品中致病菌限量》(GB29921-2013)问答
《食品中致病菌限量》（GB29921-2013）问答中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2014-03-06一、标准的制定目的致病菌是常见的致病性微生物，能够引起人或动物疾病。
食品中的致病菌主要有沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
据统计，我国每年由食品中致病菌引起的食源性疾病报告病例数约占全部报告的40%至50%。
《食品安全法》规定，食品安全标准应当包括食品、食品相关产品中的致病性微生物、农药残留、兽药残留、重金属、污染物质以及其他危害人体健康物质的限量规定。
目前，我国涉及食品致病菌限量的现行食品标准共计500多项，标准中致病菌指标的设置存在重复、交叉、矛盾或缺失等问题。
为控制食品中致病菌污染，预防微生物性食源性疾病发生，同时整合分散在不同食品标准中的致病菌限量规定，国家卫生计生委委托国家食品安全风险评估中心牵头起草《食品中致病菌限量》（GB29921-2013，以下简称GB29921）。
标准经食品安全国家标准审评委员会审查通过，于2013年12月26日发布，自2014年7月1日正式实施。
GB29921属于通用标准，适用于预包装食品。
其他相关规定与本标准不一致的，应当按照本标准执行。
其他食品标准中如有致病菌限量要求，应当引用本标准规定或者与本标准保持一致。
二、标准的实施要求GB29921实施日期（2014年7月1日）前，允许并鼓励食品生产经营单位按照本标准执行。
在标准实施日期之后，食品生产经营单位、食品安全监管机构和检验机构应按照本标准执行。
在实施日期前已生产的食品可在保质期内继续销售。
进口食品的标准执行时间应按照相关规定执行。
致病菌检验应按照GB29921引用的检验方法执行。
食品生产经营者应当严格执行食品生产经营规范标准或采取相应控制措施，严格生产经营过程的微生物控制,确保产品符合GB29921规定。
国家卫生计生委将组织对GB29921实施情况进行跟踪评价，根据评价情况适时修订完善标准。
食品中志贺氏菌检验
食品微生物检验技术
无色至浅粉红色， 半透明、光滑、湿 润、圆形、边缘整 齐或不齐
白色，不透明、圆形、 边缘不整齐，直径1 mm～3 mm，菌落 周围琼脂颜色变为紫 红色
操作规程
已培养的营养琼脂斜面上生 长的菌苔，进行生化试验
二、志贺氏菌检测
ß-半乳糖苷酶
尿素
选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固 体、营养琼脂斜面，36℃1 ℃培养20h～24h，观察结果。
食品微生物检验技术
一、志贺氏菌概况
概述
志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临 床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆 菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌 引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性 中毒性菌痢，死亡率甚高。
一、志贺氏菌概况
需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2-7.4； 在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、
在中等大小的菌落； 宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落
呈玫瑰红色； 在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
增菌：用GN增菌液使处于 濒死状态的细菌恢复活力
报告
二、志贺氏菌检测
操作规程
225ml 志贺氏 菌增菌液增菌
选择性增菌
细胞数量增殖 液体 25mL 摇匀
样品
25g 均质
固体 样品
鉴别培养基
寻找可疑典型菌落
穿刺划斜面
TSI、营养琼脂、半固体培养基
41.5±1℃
16~18h 厌氧培养
4789.5志贺菌检验
对可疑的食品，包括在使用前需用手处理的或 轻微加热的产品，且其酸度范围由PH5.5至6.5 之间。一般来说，当食品中含有大量的大肠菌 群，大肠杆菌与沙门氏菌时，同时即可疑含有 志贺氏菌。
现行GB/T 4789.5-2003标准不足处
1. 采用的GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌
的生长速度大大超过志贺氏菌,所以检测效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制 3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差异
修 订 原 则
1.以原国标为基础，保持与原标准的连续性
考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件尽可能 简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法
2.与国际接轨的原则
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，部分参 考采用了美国FDA、NMKL等标准
培 养 特 性
志贺氏菌属于革兰氏阴性短杆菌； 无芽孢、无荚膜、无鞭毛、不运动 需氧或兼性厌氧，营养要求不高，能在普通培 养基上生长 能利用葡萄糖与其他碳水化合物，产酸不产气。 除A群外，B 、 C 、 D群均能发酵甘露醇，除 D群外，A 、 C和D群均不发酵乳糖； D群具 有鸟氨酸脱羧酶
菌体（0）抗原 1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所 含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常 随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分 为A、B、C、D四个群及39个抗原型。 2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌 体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所 含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。
西蒙氏柠檬酸盐实验
挑取少量琼脂培养物接种，于36±1℃培 养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌 落生长，培养基从绿色转为蓝色。
PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立
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中 国 人 兽 共 患 病 学 报
志贺氏菌检验
志贺氏菌检验志贺氏菌属于肠杆菌科，是一种革兰氏阴性菌，会引起肠道感染，引发肠炎，当人出现连续性腹泻、腹痛等症状的时候，就需要考虑是否感染志贺氏菌。
志贺氏菌的传播途径主要是食物和水，比如沙拉、土豆、金枪鱼、虾、奶制品等，在密闭以及不卫生的条件下志贺氏菌会迅速传播，而且经常出现在人员比较密集的地方，比如餐厅、食堂等地。
食源性志贺氏菌的传播主要是因为从事食品工作的人员感染了志贺氏菌，并且将其传播到食物上所引起的，另外，保存食物的温度不当，也可能引起志贺氏菌。
志贺氏菌检验是临床上检验肠道感染疾病的一个重要途径，在检测过程中常用的方法有以下几种。
一、生化鉴定法常规的生化鉴定方法是志贺氏菌检验过程中的常用方法，需要对细菌进行增殖培养、分离、生化试验、血清学检验等步骤来完成，步骤比较繁琐，而且耗时较长，每一次一般只能检验一个样品，但是检测的结果比较准确，检测稳定性较高，假阳性率低。
二、免疫学检验方法免疫学是检验志贺氏菌最快速、准确的方法，特异性较强，而且灵敏度很高，主要的免疫学检验方法有以下几种：第一，酶联免疫法。
这种方法的灵敏度很高，而且简单快速，检测过程比较稳定，可以进行自动化操作，是志贺氏菌检测过程中最快速的一种方法。
但是，使用酶联免疫法进行检验的时候，影响检测结果的因素较多，而且假阳性率高，所以还需要采用其他的方法进行配合检验。
第二，SPA协同凝集法。
这种方法是使用已知标准血清吸附到含Ａ蛋白的金黄色葡萄球菌表面之后，让金黄色葡萄球菌成为吸附抗体的载体，再根据吸附的结果来诊断是否感染志贺氏菌的一种方法。
三、分子生物学方法分子生物学是建立在很多其他的检测技术基础上的，敏感度高、检测快速，而且特意性高，是生物技术革命的一个重要产物，目前在志贺氏菌的检测过程中十分常见。
志贺氏菌的分子生物学检测方法有以下几种：第一，聚合酶链式反应法，比如常规PCR、多重PCR法、实时荧光PCR法和恒温荧光PCR法等。
以恒温实时荧光PCR法为例，这种方法的原理是利用环介导等温扩增反应为原理进行测量的方法，灵敏度很高，与传统的荧光测量方法相比，灵敏度高出2～5个数量级，而且测量十分迅速，荧光反应的时间较短，一般30-60分钟就可以完成荧光反应。
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扎：要将报纸裁成5-10公分，成30°卷起，结尾处向上折 叠即。
培养基的制备
❖ 增菌液 ❖ 成分:胰蛋白胨20g 柠檬酸钠5g 磷酸二氢钾1.5g 葡萄糖1g 去氧胆碱
酸钠0.5g 氯化钠5g 甘露醇2g 磷酸氢二钾4g 蒸馏水1000ml ph7.0 ❖ 制法：按上述成分配好，加热溶解，校正PH。分装每瓶225ml ，
2.04g 蒸馏水120mL 乳糖1.2g 0.01%结晶紫水溶液1.2mL 0.5%中性红水 溶液 0.6mL ❖ 制法： ⅰ将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2， ❖ 将琼脂加入于600ML蒸馏水中， 加热溶解。将两液合并，分装于121℃高压 灭菌15min备用。 ⅱ 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃ 时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后 倾注平板。
培养基的制备
❖ 3、SS琼脂液的配制 ❖ 成分：牛肉膏0.6g 琼脂2.04g 三号胆盐0.42g 蒸馏水120ml，月示胨0.6g ❖ 制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入600ml蒸 ❖ 馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合121℃高压灭菌15min,保存备用。 ❖ 4、麦慷慨琼脂液的配制 ❖ 成分：蛋白胨2.04g 脙胨0.36g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g 氯化钠0.6g 琼脂
培养基的制备
❖ 5、伊红美蓝琼脂（EMB） ❖ 成分：蛋白胨 10g 2%伊红溶液20ml 乳糖10g 0.65%美兰溶液10ml 磷酸二氢
钾28g 蒸馏水1000ml 琼脂17g PH7.1 ❖ 制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧杯内，
121c高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶解琼脂，冷却，加入伊 红和美蓝溶液，摇匀。倾注平板。 ❖ 6、三糖铁琼脂的配制 ❖ 成分：蛋白胨4.8g 牛肉膏0.6g 乳糖1.2g 蔗糖1.2g 葡萄糖0.12g 氯化钠 0.6g 硫酸亚铁胺0.024g 硫代硫酸钠0.024g 琼脂0.72g 酚红0.003g 蒸馏水 120mL pH7.4 ❖ 制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂， 加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装 量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。
培养基的制备
❖ 7、生理盐水的配制 ❖ 成分Nacl0.9g,蒸馏水100ml ❖ 制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml
蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入 500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包 扎后于121度高压灭菌15min ❖ 8、氯化钠结晶紫增菌液的配制 ❖ 成分：蛋白胨2.4g 氯化钠4.8g 0.01%结晶紫溶液0.6mL 蒸馏水 120mL pH9.0 ❖ 制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧 化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸， 过滤。再加入结晶紫溶液， 混合后分装试管。121℃高压灭菌15min
5支 13×100mm试管
5支
13×100mm试管
四、实验步骤
实 验 步 骤
操作步骤 流程图
流程图
采样 ↓
样品处理 ↓
选择性增菌 ↓
选择性平板划分 ↓
生化实验 ↓
镜检 ↓
结果报告
实验前的准备
包扎灭菌
❖ 对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗 ❖ 注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条
操作步骤
❖ 1.灭菌 ❖ 干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌 ❖ 湿热灭菌：均质袋、纱布、各种培养基、生理盐
志贺氏菌检验
一、实验目的
1 了解食品安全与志贺氏菌检验关系 2 了解志贺氏菌生理形态化学性质 3 掌握志贺氏菌检验方法和结果判断 4 检验食品中是否有志贺氏菌
二.实验原理
需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长 ，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小 时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘 整齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵 乳糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不 分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。
三、实验的试剂和仪器
试剂和仪器
仪器与设备
培养基与试剂
仪器与设备
❖
规格名称Biblioteka ❖1、500ml广口瓶
❖
2、500ml三角瓶
❖
3、250ml三角瓶
❖
4、18×180mm试管
❖
5、13×100mm试管
❖
6、1ml移液管
❖
7、10ml移液管
❖
8、直径为90mm平皿
❖
9、250ml量筒
❖
10、玻璃棒
❖
11.、恒水浴箱
❖ 蛋白胨水
2ml/支
❖ 5%乳糖发酵管
3ml/支
❖ 甘露醇发酵管
3ml/支
❖ 棉子糖发酵管
3ml/支
❖ 甘油发酵管
3ml/支
1瓶 500ml三角瓶
1瓶 250ml三角瓶
1瓶
250ml三角瓶
6支 15×150mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
5支 13×100mm试管
❖
12、显微镜
数量 1个 1个 4个
5副 1个
1个 1台
用途 稀释样品 制增菌液 制培养基 制三糖铁培养基 制蛋白胨水等
制SS、EMB平板
镜检
培养基与试剂
❖ GN增菌液
225ml/瓶
❖ EMB培养基
100ml/瓶
❖ SS琼脂
100ml/瓶
❖ 三糖铁斜面
6ml/支
❖ 葡萄糖半固体培养费基 4ml/支
115 C高温灭菌15min ❖ 2、HE琼脂 ❖ 成分：蛋白胨12g 水杨素2g 蒸馏水1000ml 乙液20ml 牛肉膏3g 胆盐
20g 0.4% 溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼 脂20g 甲液20ml HP7.5 ❖ 制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶 解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶 解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合 并，冷却，倾注平板，