基于载体的RNA干扰技术
RNA干扰技术和CRISPR的优势比较
RNA干扰技术和CRISPR的优势比较引言：在过去的几十年里，生物技术领域取得了巨大的进展，其中RNA干扰技术和CRISPR成为了热门研究领域。
它们都是目前最具潜力的基因编辑工具，为科学家们开辟了治疗疾病和改善生物体特性的新途径。
本文将对RNA干扰技术和CRISPR进行综合比较，分析它们各自的优势。
一、RNA干扰技术的优势RNA干扰技术是一种通过抑制目标基因的转录或翻译过程来实现基因靶向调控的技术。
它主要包括小干扰RNA (siRNA) 和微小干扰RNA (miRNA) 两种形式。
1.1 高度特异性RNA干扰技术具有高度特异性，可以精确地靶向任意基因序列，由此对目标基因进行有效调控。
这种特异性可以减少对其他基因的无意干扰，从而提高实验结果的可靠性。
1.2 简单灵活RNA干扰技术相对于其他基因编辑技术而言，操作上更为简单灵活。
研究人员只需设计合适的siRNA或miRNA序列，并通过合适的载体递送到靶细胞中，即可实现目标基因的抑制。
不需要复杂的基因编辑步骤，这使得RNA干扰技术更易于广泛应用于生物研究和药物开发等领域。
1.3 快速高效RNA干扰技术能够在短时间内降低或抑制目标基因的表达，从而迅速实现实验或治疗的效果。
通常，在注射siRNA或miRNA后的48小时内就能观察到基因表达水平的降低。
因此，RNA干扰技术在临床药物研发和治疗疾病方面具有潜在的优势。
二、CRISPR的优势CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）即簇状规律间隔短回文重复，是一种新兴的基因编辑技术，具有革命性的潜力。
2.1 高度精准CRISPR是一种高度精准的基因编辑技术。
通过设计合适的引导RNA (gRNA)，可以将Cas9蛋白复合物导向目标基因的特定位置，实现DNA序列的修饰或改变。
这种高度精准性使得CRISPR 成为研究人员进行基因组编辑的首选工具。
RNA干扰技术在基因沉默与功能解析中的应用
RNA干扰技术在基因沉默与功能解析中的应用引言RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是一种重要的基因调控方法，该技术可通过介导RNA的降解或抑制翻译的方式靶向沉默特定基因。
自从1998年发现RNA干扰的现象以来，科学家们已经广泛应用此技术在不同生物体系中研究基因功能。
本文将讨论RNA干扰技术在基因沉默与功能解析中的应用。
一、RNA干扰的基本原理RNA干扰是一种高度保守的生物学机制，在多种生物中都存在。
其基本过程分为两个阶段：小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的产生和干扰复合体的形成。
小干扰RNA（siRNA）是RNA干扰的关键组分。
siRNA通过外源或内源方法产生，随后与RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合。
RISC复合体能够识别和结合与siRNA互补的特定RNA，导致降解或抑制这些RNA的翻译过程，从而实现靶向基因的沉默。
二、RNA干扰技术的方法RNA干扰技术有两种主要的方法：siRNA转染和慢病毒载体介导的siRNA表达。
1. siRNA转染siRNA转染方法是通过将合成的siRNA直接导入靶细胞来实现基因沉默。
这种方法简单、快速且可靠，并且可以应用于各种细胞和生物体系。
转染过程中，siRNA进入细胞胞质，并与RISC复合体结合，从而引发基因沉默。
然而，这种方法的持续性较短，需要定期重新转染。
2. 慢病毒载体介导的siRNA表达慢病毒载体介导的siRNA表达是通过将siRNA基因插入慢病毒基因组中，然后利用慢病毒进行基因转导。
这种方法可以实现持续的基因沉默，并且适用于细胞和整个生物体内的基因沉默。
然而，该方法需要特殊实验环境和技术，且过程较为复杂。
三、RNA干扰技术在功能解析中的应用RNA干扰技术已广泛应用于功能基因组学和分子生物学研究中。
通过将其与高通量筛选等技术相结合，科学家们能够更好地理解基因的功能及其在生物体内的作用。
rna干扰的基本原理
rna干扰的基本原理RNA干扰技术是一种特殊的基因沉默技术，它通过人工合成的小干扰RNA（siRNA）或长干扰RNA（shRNA）引导RNA诱导靶向性降解特定基因的mRNA，从而达到抑制或沉默该基因表达的目的。
RNA干扰技术的发现和应用，为基因研究和基因治疗等领域提供了一个强有力的工具。
以下为RNA干扰的基本原理。
RNA干扰分为两种类型，分别是siRNA干扰和shRNA干扰。
首先是siRNA干扰，其中“si”指短干扰RNA。
干扰RNA在合成后，将被分解成21-23个碱基对的双链RNA，其中一个链称为“导引链”，该链的末端含有两个双脱氧核苷酸，为其引导RNA诱导靶向性降解目标mRNA提供了稳定性和特异性。
另一个链称为“反义链”，是导引链的完全互补，在小干扰RNA中起到了次要的配对作用。
在siRNA寻找目标时，导引链与目标mRNA的特定序列互相配对，而反义链与目标mRNA的另一段互补，最终引导该目标RNA被RNA酶切割。
其次是shRNA干扰，其中“sh”指短发夹RNA。
shRNA序列比siRNA序列长，例如，shRNA可以含有数百个核苷酸。
RNA干扰具有持续的靶向基因沉默作用，可以通过载体转导到目标细胞，并成为RNA酶III的底物，从而形成长时间的干扰效应。
shRNA启动子构成了RNA多聚酶III识别的序列，包括人类U6和霉红菌H1等次要RNA启动子。
shRNA被RNA聚合酶III识别和切割，将shRNA转化为短干扰RNA，它们寻找目标RNA，最终被RNA酶切割。
下面是RNA干扰的应用：RNA干扰应用广泛，比如应用于生物学基础研究、基因治疗、农业等领域。
在生物学研究中，使用RNA干扰可以比较准确地测量基因的功能，识别重要基因的突变，并清楚地了解它们的作用。
在基因治疗中，RNA干扰可用于治疗包括癌症、心血管疾病、自身免疫疾病和病原体感染等疾病。
在农业领域中，可使用基于RNA干扰技术的生物农药来控制有害生物的数量，并增加作物的产量和耐性。
RNA干扰技术的原理及应用
RNA干扰技术的原理与应用RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。
这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。
由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。
1 RNAi现象的发现及发展1995年, Guo等用反义RNA阻断秀丽新小杆线虫的part 1基因的实验中发现, 正义和反义RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义RNA技术的解释相反。
1998年2月卡耐基研究院的F i re 等将双链RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的mRNA发生了降解,证实高度纯化的ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链RNA至少高2个数量级,首次揭示了Guo等遇到的现象,即为RNAi。
随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。
在短短几年中,对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用RNAi技术抑制基因表达, 开创了RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组siRNA文库新技术和应用基因组siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量RNAi研究。
rna干扰
rna干扰RNA干扰技术是一种利用RNA分子干扰靶标基因表达的方法，该技术的研究与应用已经广泛扩展到生物学、医学以及生物技术领域。
本文将介绍RNA干扰技术的原理、应用和未来发展前景。
RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是由RNA介导的靶向基因沉默的一种机制。
它最早在植物中被发现，后来也被发现在动物细胞中广泛存在。
RNA干扰通过靶向性介导的方法，降低或抑制特定基因的表达，从而实现对基因功能的研究和调控。
RNA干扰的基本原理是双链RNA（dsRNA）通过酶切分解为20-25个碱基对长的小干扰RNA（small interfering RNA，简称siRNA）。
siRNA与RNA诱导静默复合体（RNA-induced silencing complex，简称RISC）结合，将其中一条链引导到靶标mRNA上，并通过与该mRNA互补配对，发挥沉默作用。
引导链与靶标mRNA形成稳定的双链结构，进而被RISC酶降解，从而阻断了该mRNA的翻译过程或引起其降解。
通过RNA干扰技术，可以特异性地沉默特定基因的表达。
RNA干扰技术的应用非常广泛。
首先，它被广泛应用于基因功能研究。
通过对单个基因进行沉默，可以直接观察到其对细胞及生物体的影响，从而揭示其在生物过程中的作用。
其次，RNA干扰技术也可以用于治疗疾病。
对于一些基因异常表达导致疾病的情况，通过RNA干扰技术恢复正常的基因表达，可以有望治疗相关疾病。
此外，RNA干扰技术还可以用于抗病毒研究、农业作物改良等领域。
在临床应用方面，RNA干扰技术已取得了一些重要的突破。
例如，目前已经有一些RNA干扰基因药物进入了临床试验阶段。
这些基因药物通过RNA干扰技术沉默与疾病相关的靶标基因，为患者治疗提供了新的选择。
此外，RNA干扰技术还可以用于个体化医学，根据患者基因的特点制定个体化的治疗方案，提高治疗的效果。
然而，RNA干扰技术仍然面临一些挑战和限制。
RNA干扰技术的使用注意事项
RNA干扰技术的使用注意事项RNA干扰技术是一种常用的实验室技术，通过介导RNA降解或抑制RNA翻译来靶向调控基因表达。
这项技术在基因功能研究、药物研发以及治疗某些疾病中起到了重要的作用。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，我们需要遵循一些注意事项。
首先，合理设计实验方案。
RNA干扰可以通过不同的途径进行，包括siRNA、shRNA和miRNA等。
在选择特定的干扰方法之前，我们需要全面了解目标基因的结构、寡核苷酸序列以及该基因在细胞或组织中的表达模式。
此外，还应考虑到表达获得的合适载体、基因递送系统以及细胞系的选择。
合理而全面的设计是确保RNA干扰实验成功的关键。
其次，注意靶点的选择。
在设计RNA干扰实验时，正确选择靶点基因是非常重要的。
通常，选择靶点时最好选择编码蛋白质的区域，避免选择含有剪切位点的部分。
此外，还要确保选择的靶点是唯一的，避免干扰到其他相关的基因。
正确选择靶点可以避免误导实验结果和分析。
此外，注意使用适当的阳性和阴性对照。
阳性对照用于验证RNA干扰技术的有效性，而阴性对照则用于排除非特异性效应。
阳性对照可以是选择一些已经被证实具有RNA干扰效果的基因作为模板，而阴性对照可以是采用随机序列或不与任何基因相关的RNA片段。
同时，为了进一步验证RNA干扰的特异性，还可以设计siRNA或shRNA与目标基因不同区域的非特异性控制对照。
合适的阳性和阴性对照可以提高实验的可信度。
在实验过程中，注意合适的RNA浓度和转染条件是非常重要的。
RNA的浓度过高可能导致细胞毒性或非特异性效应，而浓度过低则可能导致RNA干扰效果不明显。
因此，我们需要优化RNA的浓度并进行细胞毒性测试，以确保使用的RNA 浓度在细胞中具有最佳的RNA干扰效果。
同时，也需要注意转染条件的优化，以确保RNA能够有效地被细胞吸收。
另外，合适的检测方法和时间点选择也是非常重要的。
常用的检测方法包括Western blotting、荧光素酶报告基因测定和实时定量PCR等。
RNA干扰技术原理及应用
03 rna干扰的应用
在医学领域的应用
01
02
03
疾病诊断
利用rna干扰技术，可以 特异性地沉默致病基因的 表达，从而实现对疾病的 诊断。
药物研发
通过rna干扰技术，可以 筛选出对特定疾病具有治 疗作用的候选药物，加速 药物研发进程。
基因治疗
rna干扰技术可以用于基 因治疗，通过沉默致病基 因的表达，达到治疗遗传 性疾病的目的。
功能基因组学研究
rna干扰技术可以用于功能基因组 学研究，通过沉默基因的表达， 探究基因的功能和作用机制。
生物进化研究
利用rna干扰技术，可以探究生物 进化过程中基因表达的变化和演 化机制。
生物医学研究
rna干扰技术可以用于生物医学研 究，通过沉默特定基因的表达， 探究疾病的发生和发展机制。
04 rna干扰技术的挑战与前 景
药物研发
RNA干扰技术也可用于药物研发，帮助科学家快速筛选 出与特定疾病相关的基因，从而开发出新的药物。
农业应用
在农业领域，RNA干扰技术可用于培育抗病、抗虫的转 基因作物，提高农作物的产量和品质。
05 rna干扰技术的实验流程
设计siRNA
总结词
设计siRNA是RNA干扰技术的关键步 骤，需要选择与目标mRNA互补的特 定序列。
技术挑战
脱靶效应
RNA干扰过程中，有时会导致非目标基因的表达沉默，这被称 为脱靶效应。脱靶效应的产生可能与siRNA的序列、浓度以及
作用时间等因素有关。
细胞毒性
某些RNA干扰试剂可能对细胞产生毒性，影响实验结果。因此 ，在选择RNA干扰试剂时，需要考虑其对细胞的毒性。
体内应用限制
在体内应用RNA干扰技术时，如何将siRNA有效地传递到靶细 胞中是一个挑战。此外，如何维持siRNA的稳定性以及其在体
RNA干涉与基因敲除技术
RNA干涉与基因敲除技术基因编辑技术在生命科学领域有着广泛的应用，其中RNA干涉（RNA interference，RNAi）和基因敲除是两种常用的方法。
它们都可以用来研究和调控基因表达，但在实施过程中存在一些区别。
本文将重点介绍RNA干涉和基因敲除技术的原理、应用以及优缺点。
一、RNA干涉技术RNA干涉是一种常见的基因调控方法，通过沉默目标基因的mRNA从而抑制其表达。
其机制是通过转录和降解过程中的特定RNA 分子介导，主要分为siRNA（小干扰RNA）和miRNA（微小干扰RNA）。
下面将重点介绍这两种RNA干涉技术的原理和应用。
1. siRNA技术siRNA是由外源DNA合成的双链RNA分子，在细胞内由Dicer酶催化切割形成20-25个碱基的小分子干扰RNA（small interfering RNA）。
这些干扰RNA与RNA诱导靶向基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，并导致靶向mRNA的降解或翻译抑制。
siRNA技术一般通过载体转染或合成siRNA直接转染的方式传递到细胞。
siRNA技术在基因沉默和基因功能研究方面有着广泛的应用。
通过合成特异性靶向基因的siRNA，可以有效地抑制目标基因的表达，从而研究基因功能。
此外，siRNA还可以用于寻找新的治疗方法，如抑制特定病原体的基因表达。
2. miRNA技术miRNA是内源性产生的小RNA分子，主要通过通过碱基互补与靶向mRNA结合，并通过RNA诱导靶向基因沉默复合物（RISC）介导靶向mRNA的降解或翻译抑制。
与siRNA不同，miRNA通过调控基因表达来调节细胞过程的正常功能。
miRNA技术在基因调控和疾病治疗中具有重要的作用。
研究发现，miRNA可以调控多种生物学过程，如细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡。
通过合成特定的miRNA类似物或抑制miRNA的表达，可以进一步了解miRNA的功能和调节机制，并可能用于治疗相关疾病。
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Biochemical and Biophysical Research Communications《生物化学与生物物理学研究通讯》题目：基于载体的RNA干扰导致转基因斑马鱼中肌肉生长抑制素基因抑制从而引起双肌效果摘要：肌肉生长抑制素属于转化生长因子（TGF）-β超家族，对骨骼肌的形成和增长具有很强的负调节作用。
我们利用显微注射反义RNA的表达载体，构建了一个肌肉生长抑制素基因抑制而产生双肌表型并且能遗传稳定的斑马鱼品种。
实时PCR和免疫染色显示，在纯合的转基因斑马鱼中肌肉生长抑制素mRNA和蛋白水平分别是非转基因对照的33％和26％。
此外，肌肉生长抑制素抑制的转基因鱼MyoD、肌细胞生成素、Mrf4和Myf5这类生肌调节因子的mRNA水平相比于非转基因对照有显著的升高。
虽然在体长上没有显著的差异，但纯合的转基因斑马鱼比非转基因对照重45％。
组织化学分析表明，纯合转基因鱼的肌纤维的横截面积是非转基因对照的两倍。
这是第一个能稳定遗传的肌肉生长抑制素抑制基因型以及双肌表型的斑马鱼模型。
关键词：肌肉生长抑制素斑马鱼RNA干扰前言：McPherron和Lee在Belgian Blue和Piedmontese 这两种牛中发现了对肌肉的生长具有负调节作用的肌肉生长抑制素。
作为肌肉生长的调节物质，肌肉生长抑制素一般在骨骼肌中表达，是属于转化生长因子（TGF）-β超家族，拥有该超家族所有共同的结构组分。
在许多种牛和小鼠中，肌肉生长抑制素的基因突变会导致“双肌”现象。
此外，在猪和鸡中也观测到类似的肌肉生长抑制素的表达模式。
在成年哺乳动物中，肌肉生成抑制素主要是在该物质的靶组织——骨骼肌中表达。
然而，随后在研究中发现肌肉生长抑制素在乳腺、心脏、脾、脑中也有较低水平的表达，它会影响心肌的生长以及脂肪细胞的分化。
由于在子宫内进行研究比较困难，因此肌肉生长抑制素在哺乳动物胚胎发育时的表达模式大多仍不清楚。
在大鼠胚胎发育早期，肌肉生长抑制素只在体节中表达；而在胚胎发育后期，肌肉生长抑制素的表达始终伴随着肌肉的生长。
肌肉生长抑制素在鱼类中不仅抑制骨骼肌生长，在维持组织稳态增长、渗透压调节以及生殖组织的功能上也起着重要作用。
相比于哺乳动物，人们在在不同品种的鱼类的胚胎发育过程中，进行了许多定性和定量实验来研究肌肉生长抑制素的表达情况。
在斑马鱼中，发现了两种形式的肌肉生长抑制素（Ⅰ和Ⅱ）的基因。
肌肉生长抑制素Ⅰ的信使（m）RNA是母性遗传的，在受精后48小时的胚胎中表达量达到最高；而肌肉生长抑制素Ⅱ在受精后13小时，也就是8-体节阶段才能检测到。
对组织表达谱研究发现，肌肉生长抑制素Ⅰ基因广泛表达于肌肉，大脑，眼睛，肾脏，睾丸，卵巢，消化道和心脏中，但肌肉生长抑制素Ⅱ的基因表达谱则比较有限，大都局限于大脑。
只有肌肉生长抑制素Ⅰ的基因表达是在生长发育过程中是动态调节的，而肌肉生长抑制素Ⅱ基因的表达在生长发育的大多数情况下是不变的。
肌肉生长抑制素的功能是对骨骼肌生长进行负调节。
通过同源基因靶向的方法培育的小鼠骨骼肌明显比野生型（WT）小鼠的要大，由于细胞数量（增生性增长）和细胞大小（肥厚性增长）的增长，肌肉生长速率比野生型小鼠大2到3倍以上的。
在哺乳动物中，RNA干扰（RNAi）技术通常用来获得肌肉生长抑制素基因抑制的动物。
在鱼类中，有一些研究肌肉生长抑制素消除的斑马鱼的报告。
Amali等人通过对发育早期的胚胎显微注射反义寡核苷酸发现体节的数量和大小在这一发育期有所增加。
他们还发现，与肌肉生长相关的肌肉转录调节因子（MyoD）和肌细胞生成素（myogenin）基因转录的上调。
Xu等人发现能过度表达对肌肉生长抑制素具有显性失活作用的前导肽的转基因斑马鱼中，肌肉细胞数量仅略有增加，而且仅在雌鱼中。
Acosta 等人通过显微注射罗非鱼肌肉生长抑制素的双链（ds）RNA到斑马鱼的卵中，培育出了“巨型斑马鱼”。
虽然难以确定何种肌肉生长抑制素基因转录产物的构型或肌肉生长抑制素的横向同源物在上述研究中起作用，但这些研究表明，鱼类肌肉生长抑制素的生物功能可能不仅限于骨骼肌生长和发育的负调控。
由于目前在鱼类中还没有能进行基因敲除的技术，而且在鱼类中也没有种系稳定的基因抑制模式动物，因此我们使用一种基于载体的RNA干扰方法来获得遗传稳定的肌肉生长抑制素基因敲除的模型鱼来研究肌肉生长抑制素在斑马鱼中的功能。
这是第一个遗传稳定的肌肉生长抑制素抑制的斑马鱼种，能够用来研究肌肉生长抑制素基因的表达和功能。
材料和方法鱼的饲养斑马鱼（斑马鱼类）是从本地水族用品店购买的。
在28 ℃的温度、20 -L的光照强度以及14h:10h的日/夜周期下养殖。
用于显微注射的受精卵是在光期开始后的单细胞阶段收集的。
反义肌肉生长抑制素绿色荧光蛋白（GFP）质粒的构建肌肉生长抑制素Ⅱ基因（也就是肌肉生长抑制素ⅡA Y687474）是从受精后24小时的斑马鱼cDNA文库（Stratagene公司）中获得的。
为了便于跟踪转基因的表达，我们将包含了810个碱基对的斑马鱼肌肉生长抑制素Ⅱ编码区的DNA片段，反义克隆到pEGFP - C1载体（Clontech公司，一个能编码产生绿色荧光蛋白的载体）的EcoRⅠ酶切位点上。
斑马鱼胚胎的显微注射和转基因斑马鱼种的获得每个单细胞期的胚胎用玻璃微吸管注入约200微微升的质粒DNA（150微克/毫升）溶液。
使用荧光显微镜（Leica, MZFLⅢ）对转基因胚胎的绿色荧光进行观察和记录。
纯合的转基因斑马鱼是在这些GFP观测呈阳性的鱼种，通过加快它们性成熟并使之与非转基因鱼杂交从而筛选获得的。
实时逆转录聚合酶链反应（RT - PCR技术）斑马鱼孵化期胚胎全RNA提取是采用TRIZOL试剂盒（Invitrogen公司）。
对于RNA 样品的进一步分析，是用高容量cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems公司），采用随机引物进行反转录。
实时PCR反应程序：95 ℃10min；95 ℃15s、60℃1min，40个循环，使用的是2 ×SYBR Green PCR Master Mix预混液（Applied Biosystems公司）以及500nM浓度的正反引物。
每次检测都在Applied Biosystems7300型实时PCR仪中平行进行三次，而表达量的变化，则是用Ct值比较法得到的。
每次测定的肌肉生长抑制素基因转录产物的Ct 值都是以EF1α作为内参。
一步逆转录PCR法（Life technologies公司）使用的全RNA（250纳克）是从孵化阶段的胚胎中提取的。
内参选择的是EF1α，并在相同的PCR环境下中进行扩增。
逆转录PCR反应程序：60 ℃30min、95℃30s；95℃30s、60℃1min、72℃1min，25个循环，72℃7min。
所有程序都是在Applied Biosystems 2720型热循环仪中进行，最后的逆转录PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
引物序列引物序列设计如下：EF1α的前引物为5' - GGT GAG TTT GAG GCT GGT A TC TCC AAG AAC -3'，后引物为5' - GAA GCC AAC GTT GTC ACC AGG AGT GGC CTC - 3'；肌肉生长抑制素Ⅰ的前引物为5' - GCA TGT GGT CCA GTG GGT TA T - 3 '，后引物为5' - GTT TGA GTC ACT CAC A TG TGG AAC A - 3'；肌肉生长抑制素Ⅱ的前引物为5' - TCT CCT TTT TTA TCT GAG CTT TTG G - 3',反引物为5' - TCT CCA GGT GTC ACA AA T GCT T - 3'；肌肉转录调节因子（MyoD）的前引物为5' - CAA GAG A TG CAC GTC CAC CA - 3 '，反引物为5' - TTC TGA GAA GAG CCT GCA GAG AC - 3 '；MYf5的前引物为5' - AAC GCC TCC CCA AGG TAG A - 3'，反引物为5' - CGG CAG GCT GTA TTG CTC - 3'；MRf4的前引物为5' - AAG ACG GTG CCT A TT CCG AAC -3'，反引物为5' - TCC AGC GAA TGC AAG AGG TC - 3'；肌细胞生长素的前引物为5' - CAA TGG TGG CTT CGA GCA A - 3'，反引物为5' - TGT CTT CCA ACC CAA CTG TGG - 3'。
蛋白质印迹从每个肌肉样本中提取50微克蛋白质在12％十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶中分离。
之后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（试剂盒）。
膜用含5％脱脂牛奶的TBST封闭液封闭，在1:3000稀释的多克隆兔抗人肌肉生长抑制素（抗体）抗体中进行孵育。
TBST洗涤后膜上孵育产生的多克隆羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）的共轭碱性磷酸酶（Sigma公司）用TBST稀释1:2000 。
TBST洗涤后，用2％BCⅠP和NBT（Boston公司）对特定的蛋白条带进行检测。
生长评估和肌肉组织学分析为了确定转基因鱼的生长情况，对第6代转基因鱼（F6）从1到4 个月的体重、体长进行了测定。
肌肉组织学方面的研究方法是从各组中取六条鱼在福尔马林中固定1小时，之后进行常规石蜡切片以及苏木素/伊红（H和E）染色。
选择泄殖腔基部的截面来量化肌纤维的数量。
通过对石蜡包埋的肌肉进行数字成像序列分析获得其肌纤维截面。
得到个体的肌纤维截面后，通过电脑辅助分析系统来测定其横截面积(MetaMorph TM; 常用的成像公司）。
结果获得肌肉生长抑制素基因抑制的转基因斑马鱼为了获得可遗传的肌肉生长抑制素基因抑制的斑马鱼，我们显微注射肌肉生长抑制素的反义RNA的表达载体到受精卵中，创建一个转基因种系。
反义肌肉生长抑制素Ⅱ基因与绿色荧光蛋白基因的羧基端融合，之后由人巨细胞病毒（CMV）即早启动子驱动，这对转基因斑马鱼的筛选和以及反义RNA转录的检测有很大帮助。
转基因斑马鱼孵化的桑椹胚阶段可以在全胚体上观察绿色荧光;然而，在受精后72小时，只能在肝脏中观察到绿色荧光(如图1A)。
共有4条具有遗传性状的首建转基因鱼从1600个显微注射受精卵的胚胎中筛选得到。
繁殖十几代后还能表现出稳定的遗传。