免疫实验技术第9组

NO.9小鼠/兔多克隆抗体制备实验方案
实验原理：当将抗原注射入实验动物体内时，会引起体液免疫，一系列抗体生成细胞B 细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体，而免疫效果与抗原有关,如抗原纯度、抗原分子量、免疫原性、佐剂、抗原注射剂量、抗原免疫次数等。

实验器材：乳化器、打孔器、橡胶手套、电子天平、1ml/5ml注射器、剪刀、恒温水浴箱、EP管、移液枪、玻璃片、棉签、牙签、酒精灯、剪刀、止血钳、眼科弯镊、兔台、棉线、烧杯、离心管、冰箱、青霉素小瓶、记号笔、湿盒
实验试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、琼脂、生理盐水、PBS、70％的酒精、1.5%戊巴比妥
一、抗原的选择：
人IgG：分子量是146KD，分子量大，纯度较高，对家兔而言种属差异大，免疫原性高；
牛血清白蛋白：分子量 68KD，纯度较高、分子量大，对小鼠而言种属差异大，免疫原性高。

二、抗原的乳化
乳化的方法：在乳化之前，将抗原用保存在4℃的PBS稀释好，稀释后的浓度为1mg/ml。

弗氏佐剂、不完全佐剂与抗原乳化时，弗氏佐剂与稀释后抗原的比例为1：1。

1：PBS的配置:用电子天平称NaCl 0.8g、KCl 0.02g 、Na2HPO4 0.144g、KH2PO4 0.024g、ro水80ml; 加盐酸调节pH 7.2后，定容至100ml.放置在4℃。

2、人IgG的稀释：称取2mg的人IgG于5ml的EP管中，用移液枪移取 1ml PBS将2mg 的人IgG稀释。

牛血清白蛋白的稀释：称取2mg的牛血清白蛋白于5ml的EP管中，用移液枪移取1ml 的PBS将牛血清白蛋白稀释。

3、乳化：人IgG的乳化，将稀释后的1ml人IgG加入乳化器中，再加入1ml弗氏完全佐剂/不完全佐剂，进行乳化操作，操作时要缓慢，均匀。

乳化好的标志:取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。

如出现平展扩散即为未乳化好。

乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现,均要重新乳化。

三、动物选择
小鼠：18g左右的青年期的近交系普通雄性2只
家兔：健壮生理状态良好的青年雄性，体重为2Kg左右
四、动物的抓取与固定
（1）待小鼠在笼内安静以后，用右手拇指和食指捏住尾部中央提起来，放到粗糙的鼠笼盖上，轻轻向后拉鼠尾，再用左手拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈部皮肤，将其置于左手心中，翻转抓住颈背部皮肤，右手拉住小鼠尾部，将后肢拉直，尾巴由小指压紧，以手掌心夹住背部皮肤。

（2）待家兔在笼内安静以后，以右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托其臀部或腹部，让其体重重量的大部分集中在左手上，一般采用五点法固定。

五、动物免疫
（1）初次免疫：两只小鼠分别用标记笔标记，采用多点皮内注射，注射时用70％的酒精消毒注射部分，鼠共2只，第一次基础免疫用稀释好人的牛血清白蛋白(2mg／mL) lmL与等量的弗氏完全佐剂充混匀乳化完全后后为2ml，取0.1ml,予背皮内多点注射（10点左右）,每次注射10微升，免疫一次；
兔的首次免疫：将所选用的兔做好标记，用稀释好人的牛血清白蛋白(2mg／mL) lmL与等量的弗氏完全佐剂充混匀乳化完全后,同样采用皮下多点注射，在兔的背部，选择10点以上注射，进行注射，每点大约注射0.1ml左右，每只兔注射乳化好的抗原的总量为1ml。

（2）1两周后，进行加强免疫
间隔两周后，小鼠第二次加强免疫用牛血清白蛋白(2mg／mL)lmL与等量的弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化为2ml，取0.1ml,予皮下多点点注射10次，免疫一次；
家兔为耳缘静脉注射抗原，人IGg(2mg／mL)lmL与等量的弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化为2ml，取1ml,予皮下多点注射10次，每点0.1ml左右，免疫一次；
注意：①皮内注射于皮下注射的区别,皮下注射:注射的时候用拇指和食指夹住皮肤轻轻上提一点，在拇指和食指前方形成的三角区进针，小鼠、家兔的皮较厚，注射针头穿过其皮肤后有空感。

③腹腔注射：左腹注射，一定要注意回抽，无回血、无肠液、无尿液，才能注射药液。

六、验血
在第二次加强免疫一周后后，验血。

（1）采血：小鼠尾部采血：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，或者涂抹二甲苯，使尾部血管充盈。

擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用1.5mlEP管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。

取血后用棉球压迫止血，每次采血量0.2ml（安全采血量）。

家兔：固定之后兔耳静脉采血，将兔耳洗干净后，用针头扎破让血自然流出，下方接一离心管（安全采血量3ml以内）。

（2）血清的制备:试管的血液中,不做任何抗凝处理,3000r/min离心15min收集到离心管中待用；在5天内测定的血清标本可放置于4℃保存。

（3）效价检测：
本实验采用免疫双扩散法，①1％琼脂配制：1g琼脂+100mL生理盐水，融化后，制作琼脂板：用移液管吸取融化琼脂3.5ml~4ml注于水平放置的载玻片上，使其均匀分布不流失，厚度约2mm左右，自然冷却凝固；②打梅花孔孔6个，孔径3mm，孔距8mm，针尖挑去孔内琼脂；封底，在火焰上缓缓加热，使孔底琼脂少许融化，以免加样后液体从孔底渗漏；用记号笔给梅花孔编号；③加样：以微量移液器取15微升抗血清于中央孔，同剂量用PBS倍比稀释1:1、1；2、1:4、1:8、人IGg/牛血清白蛋白抗原分别逆时针加于周围孔，最后留一孔加生理盐水最阴性对照；将玻片放入密闭湿盒，置37℃温箱中扩散24h，④观察：若有白色沉淀线生成，即免疫成功即为阳性，则进行下一步实验；若实验结果为阴性，则需要第三次免疫，家兔腹腔注射不加佐剂的IGg液IgG(1mg／mL)，取1ml予腹腔注射1次；小鼠注射不加佐剂的牛血清白蛋白(1mg／mL)，取0.1ml予腹腔注射1次。

注意：兔耳静脉采血最好不要用注射器直接抽取，若抽取时，缓慢，让其自然流出为佳，以免有气泡，避免反复采血而发生溶血现象；生理盐水也就是浓度是0.9%的氯化钠溶液。

七、免疫血清的收获、保存与效价检测：
动物免疫后5--7天后放血，采血前禁食12h。

①小鼠眼球放血：左手拇、食指抓取小鼠双耳及颈后皮肤，小指固定尾部；中指将小鼠左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部，捻动拇指，轻压取血侧眼部皮肤，使眼球充血突出；用眼科弯镊夹取眼球，并且将其头朝下提起动物，血液很快从眼眶中流入离心管；根据需要捻动拇指与食指的方向，同时用左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度；当血液流尽时，用脱臼法处死小鼠。

②家兔：放血时仰卧固定，用1.5%戊巴比妥（2ml/kg）麻醉后，切开颈部皮肤，分离出颈动脉，结扎远心端，用止血钳夹住近心端，剪口后，松开止血钳与500ml烧杯口放血。

两次放血尽量不要让血出现在上EP管或离心管壁上，两次采集的血液37℃放置1h，在置于冰箱4℃过夜，待血清充分析出之后，3000r/min离心15min，如果一周之内用用血清分装于青霉素小瓶于4℃保存。

如果时间过长，加入0.02%卡松于-20℃保存，测定效价见验血中的免疫双扩散法。

瓶于4℃保存。

如果时间过长，加入0.02%叠氮化钠于-20℃保存。

测定血清效价见验血。