细菌标本片的制备及染色方法
细菌涂片的制备及革兰氏染色实验报告
实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。
2、学习无菌操作，树立无菌观念。
[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。
根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。
微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。
前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。
分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。
此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。
其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。
而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。
细菌涂片和革兰染色法
细菌涂片和革兰染色法是常用的微生物学实验技术，用于观察和鉴定细菌。
细菌涂片是一种简单而常见的方法，用于制备细菌样品的薄层。
它通常包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并使用吸管或接种环在玻璃
片上均匀涂抹。
2.干燥：将涂片放置在室温下使其自然干燥，以确保细菌固定在玻璃片上。
3.固定：通过加热或使用特定化学药剂（如甲醇）进行固定，以保持细菌在涂片上的
形态结构。
4.染色：涂片可以使用不同的染色方法进行染色，例如格拉姆染色、苏木精染色等，
以区分不同类型的细菌。
5.观察：准备好的细菌涂片可在显微镜下观察。
通过观察细菌的形态、大小、排列方
式等特征，可以初步判断细菌的类型和特性。
革兰染色法是最常用的细菌染色方法之一，用于区分细菌的革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两类。
它包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并涂抹在玻璃片上。
2.固定：对细菌进行固定，通常使用加热的方法使其附着在玻璃片上。
3.染色：首先将细菌涂片涂上紫色的革兰染色试剂（如紫晶染剂），然后用碘溶液形
成复合物。
接下来，使用酒精溶液洗去多余染料，并进行脱色。
最后，用蓝色的对
照染剂（如苏木精）进行染色。
4.观察：通过显微镜下观察细菌涂片。
革兰阳性细菌会呈现紫色或深紫色，而革兰阴
性细菌则呈现粉红色。
革兰染色法的结果可以提供有关细菌类型及其细胞壁结构的信息，这对于细菌分类和鉴定非常重要。
它是微生物学中常用的一种初步鉴定方法。
细菌标本片的制备及染色方法
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
1．碱性美蓝染色液
甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL； 乙液：0.01%苛性钾溶液100mL 先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精 研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤 纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈 旧的染色好。
2．革兰氏染色液
（1）草酸铵结晶紫溶液 甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml； 乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶 解的乙液与甲液混合即成。
2．革兰氏染色法
（1）在固定好的抹片上，滴加草酸 铵结晶紫染色液，作用1～ 3min，水洗。
（2）加革兰氏碘液，作用1～2min， 水洗。
（3）加95％酒精脱色约30s至1min， 水洗。
（4）加稀释石炭酸复红，复染30s左 右，水洗，吸干后镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰 氏阴性菌呈红色。
（2）组织抹片的制作
待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色2～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
微生物的染色实验报告
微生物的染色实验报告微生物的染色实验报告一、引言微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌和病毒等。
它们在自然界中广泛存在，对人类的生活和健康具有重要影响。
为了更好地研究微生物的形态和结构，染色实验成为一种常用的方法。
本实验旨在通过染色技术观察微生物的形态和结构。
二、实验材料和方法1. 实验材料：（1）细菌标本：如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等；（2）染色试剂：如甲基蓝、碘液等；（3）显微镜和玻片。
2. 实验方法：（1）制备细菌涂片：取一滴细菌液滴在玻片上，用另一块玻片将其均匀涂开。
（2）甲基蓝染色：将制备好的细菌涂片放入甲基蓝溶液中浸泡片刻，然后用水冲洗净。
（3）碘液染色：将经过甲基蓝染色的细菌涂片放入碘液中浸泡片刻，然后用水冲洗净。
（4）观察：将染好色的细菌涂片放在显微镜下观察，并记录所见。
三、实验结果经过甲基蓝染色和碘液染色后，观察到细菌在显微镜下呈现出不同的形态和结构。
1. 大肠杆菌大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，呈杆状。
在染色后，我们观察到大肠杆菌呈现出深蓝色，细胞形态清晰可见。
通过放大镜，我们可以看到大肠杆菌的细胞体长约为2-3微米，直径约为0.5微米。
细菌细胞内部还可观察到细胞核和胞质等结构。
2. 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，呈球状。
在染色后，我们观察到金黄色葡萄球菌呈现出浅蓝色，细胞形态圆润。
放大镜下，我们可以看到葡萄球菌的细胞直径约为1微米左右，呈团状生长。
细菌细胞内部可见到细胞壁和胞质等结构。
四、实验讨论通过本实验，我们成功地使用染色技术观察了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态和结构。
染色技术能够使细菌在显微镜下更加清晰可见，有助于研究微生物的特征和生理功能。
细菌的染色实验是一种常用的方法，不仅可以观察细菌的形态和结构，还可以帮助鉴定不同种类的细菌。
在实际应用中，染色技术在医学、食品安全和环境监测等领域具有重要作用。
例如，医生可以通过染色技术快速鉴定细菌感染的类型，从而指导治疗方案的选择。
细菌标本片的制备及染色方法PPT精选文档
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实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
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仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
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（2）组织抹片的制作 待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
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（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
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1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色2～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
（2）卢戈氏碘液 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵 中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加 水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入， 再装入瓶中。
（3）石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于 95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸 复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释 液。
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3．瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片 上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液 等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻 轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗， 干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈 其他颜色。
细菌染色标本制作的基本程序
细菌染色标本制作的基本程序细菌染色是微生物学中最常用的一项实验技术，它可以通过给细菌染色剂上色，使其在显微镜下更容易观察和分辨。
当然，制作细菌染色标本是一项需要一定技巧和步骤的工作，下面将为您介绍细菌染色标本制作的基本程序。
首先，我们需要准备好实验所需的材料和试剂。
这些包括：细菌培养物、正常盐水、草酸、无菌显微镜玻璃片、无菌染色盒、无菌棉签、无菌吸管、脱脂酒精、革兰氏染色液（包括靛基紫、碘酒、酒精洗涤液和地高辛溶液）等。
第二步，我们需要从培养物中取出一小部分细菌。
这时候，我们可以用无菌吸管将一小滴的细菌悬浮液滴在无菌玻璃片上。
这个步骤要小心且迅速，以避免细菌的污染。
第三步，取一片无菌玻璃片，将其浸入细菌悬浮液中，在载玻片上面均匀地涂抹细菌，然后将它晾干。
第四步，取一片已经晾干的载玻片，将其放置在无菌染色盒中，并加入足够的靛基紫染液。
注意，染液要保持润湿玻璃片的表面。
第五步，加入适量的草酸，进行解染处理。
解染时间要控制好，一般为10-15秒。
解染液会使染色菌体失去原有的紫色。
第六步，用水冲洗载玻片，直至冲洗出的水完全清晰。
这个步骤的目的是除去多余的染色剂和解染液，同时保留已染色的细菌。
第七步，加入碘酒，进行固定处理。
这个步骤可使细菌维持染色，还可以增加其稳定性。
第八步，用脱脂酒精进行洗涤处理。
这个步骤可以除去碘酒和细菌的余溶剂。
第九步，用无菌棉签将细菌标本上的水分吸干，然后将载玻片晾干。
最后，将制作完成的细菌染色标本放置在显微镜下观察。
在观察时，我们可以通过调整显微镜的倍数和焦距，进一步细致地观察和分析细菌的形态、结构和染色情况。
在进行细菌染色标本制作时，需要注意一些关键点。
首先，所有使用的材料都必须经过无菌处理，以避免外源性细菌的污染。
其次，在进行每个步骤时，都要小心操作，严格控制每一步骤的时间和温度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
最后，制作完成的染色标本要储存好，以便保持其染色效果的稳定性。
细菌标本片的制备及染色法.
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块 病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片 的涂面向上，置酒及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
• 滴加瑞氏染色液于涂片上 以固定标本，1～3min后， 再滴加与染色液等量的磷 酸缓冲液或中性蒸馏水于 玻片上，轻轻摇晃使与染 色液混和均匀，5min左右 水洗，干后镜检
• 注：瑞氏染液含甲醇，无需另 行固定
瑞氏染色镜检结果
细菌（蓝色） 细胞
(2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩
取细菌培养液1～2环，在玻片上作 直径1cm的涂面
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
• 室温下自然干燥或 将标本片的涂面向 上，置酒精灯火焰 高处微烤加热干燥。
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
水洗 水洗 水洗
革兰氏染色镜检结果
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
大肠杆菌（G-菌，红色）
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
45°
• 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血 液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上， 以45°角均匀推成一薄层的涂面。
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
– 组织病料（肝脏）：触片及美兰染色 – 固体细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌）：涂片及革
兰氏染色 – 液体病料：血涂片及瑞士染色
3. 镜检结果 4. 注意事项
实验二、细菌染色法
微生物分类鉴定的特征
形态学和生理生化特征 血清学实验和噬菌体分型 氨基酸序列和蛋白质分析 核酸碱基组成和序列分析
形态学特征
培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表 面特征、光泽等 细胞形态：形状、大小、排列方式 特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等 细胞内涵物 染色反应：革兰氏染色、抗酸性染色 运动性
察(防止水的折射，以便于观察)。
Microbiological Sterile Techniques
实验二 细菌染色法
一、目的要求
1、掌握细菌染色标本的制备。
2、掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操
作步骤。
3、熟悉革兰染色法在鉴定细菌上的重要意义。
二、基本原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使
菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，
从而有利于对细菌标本的观察。 细菌染色法可分为单染色法和复染色法两大类。
染色时间：
吕氏碱性美蓝染色1~2min； 石炭酸复红染色约1min 草酸铵结晶紫染色约1min。
5、水洗
将细菌涂片上染液倒入废液缸中； 手持细菌染色涂片，臵于废液缸上方，用 洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无 色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使 水从载玻片的一端流下。水流不宜过急， 过大，以免涂片薄膜脱落。
呈红色。
革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较
成分 占细胞壁干重的%
革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性菌
肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（~10）
磷壁酸 含量较高（<50） 无 类脂质 一般无（ < 2） 蛋白质 无 含量较高（~20） 含量较高
革兰氏染色的意义
• 细菌分类鉴定 • 指导临床用药
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3．瑞氏染色液
取瑞氏染料 0.1g，纯中性甘油 1ml，在研钵中 混合研磨，再加入甲醇 60ml，使其溶解，装 入中性瓶中过夜，次日过滤，盛入棕色瓶中， 保存于暗处。保存越久，染色越好。
课后作业
1.写出实习报告； 2.掌握美兰染色的方法； 3.掌握革兰氏染色的方法
（2）干燥涂片 在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰上来回微 烤使其干燥。
（3）固定涂片 干燥后，将涂面向上，在火焰上快速来回通过2～3次，其 温度以手背接触玻片底面感觉微烫手为宜。
2．血液推片和组织抹片的制作
（1）血液推片的制作 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取少许血液， 在另一张干净无油脂的载玻片上，以45°角度均匀地 推成一薄血涂片，以红细胞不重叠为宜。
3．瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片 上以固定标本， 1 ～ 3min 后，再滴加与染色液 等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻 轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗， 干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈 其他颜色。
（三）常用染色液的配制
1．碱性美蓝染色液 2．革兰氏染色液
（2）组织抹片的制作 待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法
3．瑞氏染色法
1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色 2 ～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
2．革兰氏染色法
（ 1 ）在固定好的抹片上，滴加草酸 铵结晶紫染色液，作用1～ 3min，水洗。 （2）加革兰氏碘液，作用1～2min， 水洗。
（3）加95％酒精脱色约30s至1min， 水洗。
（4）加稀释石炭酸复红，复染30革兰 氏阴性菌呈红色。
3．瑞氏染色液
1．碱性美蓝染色液 甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL； 乙液：0.01%苛性钾溶液100mL
先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精 研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤 纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈 旧的染色好。
2．革兰氏染色液
（1）草酸铵结晶紫溶液 甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml； 乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶 解的乙液与甲液混合即成。
（2）卢戈氏碘液 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵 中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加 水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入， 再装入瓶中。 （3）石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于 95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸 复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释 液。
技能训练5 细菌标本片的制备及染色方法
实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备
掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
方法步骤
（一）细菌标本片的制作 （二）常用的细菌染色方法 （三）常用染色液的配制
（一）细菌标本片的制作
1．涂片标本的制作
（1）涂片 （2）干燥涂片 （3）固定涂片 2．血液推片和组织抹片的制作 （1）血液推片的制作 （2）组织抹片的制作
1．涂片标本的制作
（1）涂片 取清洁载玻片一块，用吸管吸取生理盐水 1 滴置于玻片中 央，再将接种环在火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑 取少许菌落，置于玻片上的生理盐水中混均匀，并在玻片 上涂成直径约为1cm的涂面，要求薄而均匀。