植物花粉生活力检测技术进展_左丹丹
植物花粉生活力检测技术进展
左丹丹1,2,明军23,刘春2,王丽娜1
(1.长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025;2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)
摘要 总结了植物花粉生活力检测的染色法、萌发测定法以及田间授粉测定法等的基本原理和应用,并且分析了各种方法的特点。
关键词 花粉;生活力;检测技术
中图分类号 Q945 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)16-04742-04
Advance in T echnique of P lant Pollen V iability
ZU O Dan2d an et al (C ollege of H orticulture and Landscape Architecture,Y angtze University,Jingzh ou,Hubei434025)
Abstract T he principle and application of technique of plant pollen viability were summ arized,including staining m eth od,germ ination m eth od and polli2 nation in field m eth od,etc.T he characteristics of different techniques were studied.
K ey w ords P ollen;Viability;T esting technique
花粉是高等植物的雄配子体。它在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。花粉既是植物遗传、育种、进化、生殖等研究的重要对象,又是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理试验等的重要材料。花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力。在农业和林业的常规育种中,为了进行人工辅助授粉或杂交授粉,需要早期采集和贮存花粉。尤其是在杂交育种工作中,研究花粉的生活力和育性是必不可少的基础性工作。为了解决亲本花期不一致或远距离杂交的困难,更需要保存花粉的活力。在使用采集和贮存花粉之前,通常要做花粉生活力的鉴定。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命、花粉的适宜贮存条件以及花粉生活力的适宜测定方法均有所差异。这些差异对于研究花粉贮藏期间控制花粉生活力、花粉—柱头间的相互作用、品种改良与育种操作、基因库的保持、不亲和性与受精关系、生理调节对花粉萌发的影响以及基因流等均有重要的实践意义[1]。因此,掌握花粉生活力检测的方法对于提高植物育种效率具有较高的实际应用价值。
1 染色法
1.1 I22KI染色法 I22K I染色法的基本原理是:根据淀粉遇碘变蓝的特性,根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量,从而确定花粉粒活性的高低。
具体操作步骤如下:①I22K I的配制。称取2g K I溶于10 m l蒸馏水中,然后加入1g I2,待全部溶解后,加蒸馏水定容至300m l。②染色。取少量花粉置于载玻片上,滴上1～2滴
I2K I染色液,5m in后在显微镜下观察。③结果判断。凡是染成蓝黑色的花粉粒具较强活力,淡蓝色次之,几乎无色则为无活力花粉。
该方法在柑橘[2]、辣椒[3-4]、梅(桃)属[5]、瓜叶菊[6]、黄
瓜[7]、澳洲坚果[8]等植物上均有应用。该方法的局限在于,它是靠花粉粒内的淀粉着色而进行判定的。虽然花粉失去了活力,但是淀粉依然存在,所以测定值偏高,而且对于那些淀粉含量少的种类如菊属[9]不适宜。
基金项目 国家社会公益研究项目(2005DI B022);湖北省自然科学基金(2004ABA142);林木、花卉遗传育种教育部重点实验室开放
基金(200605212)。
作者简介 左丹丹(1981-),女,湖北宜昌人,硕士研究生,研究方向:园林及观赏植物资源与分子育种。3通讯作者。
收稿日期 20072022061.2 TTC染色法 TT C即2,3,52氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料。TT C染色法的基本原理是:当TT C渗入细胞后,可被呼吸代谢中的还原酶所还原,并由无色的氧化型变成红色的还原型,由此来判断花粉的生活力。
具体操作步骤如下:①磷酸盐缓冲溶液的配制。称取1.673g十二水磷酸氢二钠和0.273g磷酸氢二钾溶解于100 m l的蒸馏水,调整pH值为7.17。②TT C溶液的配制。称取0.02～0.05g TT C(依植物而定)溶解在10m l磷酸盐缓冲溶液中,然后放于棕色瓶中于暗处待用。因氯化三苯基唑有毒,操作时要注意安全。③染色。取少量花粉置于普通载玻片上,滴入TT C溶液2滴,用镊子搅拌均匀,盖上盖玻片,在25～28℃的温度下放置15～20m in。④显微镜下观察。具较强生活力的花粉粒呈红色,微弱活力的花粉粒呈淡红色,无活力或不育的花粉为无色。
该方法已应用于黄瓜[7]、枇杷[10]、猕猴桃[11]、番木瓜[12]、瓜叶菊[7]、芸薹属[13]、百合[14]等的花粉生活力检测。但该方法耗时长,染色后花粉的颜色差别很小,不易分辨,且颜色受染色时间的影响较大,不便统计。
1.3 FCR染色法 FCR染色法即荧光染料反应法(Flu o2 rochrome Reaction),其基本原理是:荧光染料本身不产生荧光,无极性,可以自由地透过完整的原生质膜,当这种染料进入原生质后,即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质———荧光素,并且这种物质不能自由出入原生质膜,而只在细胞内积累,所以可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。而且,该方法可同时反映出酶活和质膜情况2个指标[15]。
具体操作步骤如下:①母液1(SS1)的配制。1.75m ol/L 蔗糖、3.32mm ol/L硼酸、3.05mm ol/L硝酸钙、3.33mm ol/L硫酸镁、1.98mm ol/L硝酸钾,混合后用蒸馏水定容。另外,可以增加蔗糖浓度以避免由渗透压引起的花粉管破裂,也可以根据荧光的强弱来调整盐的浓度。②母液2(SS2)的配制。
7.21mm ol/L双乙酸荧光素(Flu orescein Diacetate)溶于丙酮中,放于4℃冰箱。③染色液的配制。取8～12滴SS2于10m l SS1中,混匀直到该混合液变为轻乳状。④染色。取2～3滴染色液于花粉粒上,盖上盖玻片,2m in后在荧光显微镜下观察即可。产生绿色荧光的花粉具有生活力,无荧光产生的花粉则没有生活力。
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2007,35(16):4742-4745 责任编辑 刘月娟 责任校对 胡先祥
FCR 法测定芜菁芸苔属的花粉生活力结果偏低,与离体萌发试验结果不一致,颜色深浅变化很大,所以不能作为该花粉生活力测定的标准[15]。S chueler 等应用FCR 法对橡树的花粉进行测定,发现花粉生活力随着太阳辐射时间的延长而下降,与体外萌发试验比较,FCR 法的误差偏小,测定值偏高[16]。Aronne 在研究相对湿度和温度对迷迭香花粉活力的影响时应用了该方法[17]。另外,尹增芳在研究鹅掌楸花粉保存条件时,采用较简便的荧光染色法———FDA (荧光素二醋酸酯),其具体方法是将5mg FDA 溶解于1m l 丙酮中,观察前用0.5m ol/L 蔗糖溶液将其稀释50倍,即得到100μg/m l
FDA 测定液,检测时在撒有花粉载玻片上滴1滴FDA 测定
液,盖上盖玻片,静置5m in 后荧光显微观察,以活细胞发出绿色荧光、死细胞无荧光为依据,统计花粉细胞存活率(FCR 值)[18]。其实质也是FCR 染色法。M araschin 对大麦花粉进行了FDA 活力测定[19]。Reale 等应用FDA 研究了橄榄的生殖生物学[20]。该方法与萌发测定有相关性,对亲本与F 1代的鉴别非常有效,但稳定性差,需要重复测定,估计值偏高,测定时间长,15m in 后就会退色,所以必须在落射荧光显微镜下观察。
1.4 联苯胺染色法 联苯胺染色法又称过氧化物酶染色法
或B.C 夏尔达考夫染色法[21]。基本原理是根据花粉中过氧化物酶的活性来判断花粉的生活力。
具体操作步骤如下:先将0.2g 联苯胺溶于100m l 50%酒精,0.15g α2萘酚溶于100m l 50%酒精,0.25g 碳酸钠溶于
100m l 蒸馏水,等量配制成混合溶液I ;接着配制0.3%过氧
化氢溶液II ;加1滴混合液I 和1滴溶液II 于带有花粉的载玻片上,静置3～4m in 后,在显微镜下检查。显红色的为有生活力的花粉,凡为黄色或透明的均为无生活力的花粉[22]。
该方法主要是由于有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶,所用试剂能与该酶发生氧化而染色。但是随着花粉生活力的丧失,该酶活性不消失,所以仍能染色,因此,测定值偏高[4]。而且笔者在研究蜡梅花粉生活力时发现,在显微镜下难以区分红色和黄色,染色界线不分明,与萌发测定没有相关性。
1.5 MTT 法 MTT 染色法是根据花粉粒中脱氢酶的活性判
断花粉生活力,适用试剂是四唑盐类染料。
染料的配制方法如下:1%2,52联苯四唑溴化物(MTT 或噻唑兰)溶于5%蔗糖。若染色后,花粉呈深粉红色或表面有不规则的黑线,则证明花粉有生活力[23]。姜雪婷等应用该方法测定了梨花粉的生活力,发现测定值明显偏高,不适宜梨花粉生活力的测定[21]。该方法的缺点是与萌发测定不相关,染色后花粉的颜色差别很小,不易分辨,导致测定值偏高,所以应用很少。
1.6 X 2G al 染色法 X 2G al 染色法是根据花粉中β2半乳糖苷
酶的存在与否来测定花粉生活力。X 2G al 染液的配制方法如
下:1mg X 2G al (52溴242氯232吲哚2β2半乳糖)溶于50μl N ,N 2二甲基甲酰胺和1m l 醋酸缓冲液(50mm ol/L ,pH 值4.8)中。若染色后的花粉呈蓝色,则花粉具有生活力。该方法染色后花粉颜色鲜亮,易于鉴别,并与花粉管生长有相关性。缺点是对花粉的生活力估计偏高,也可使死亡花粉着色[24]。
1.7 B aker ’s 染色法 Baker ’s 染色法通过检测乙醇脱氢酶
活性判断花粉的生活力。Baker 试剂的配制方法如下:0.7
mg/m l 磷酸缓冲液(pH 值7.3～7.5),少量硝基兰-四唑,6mg NAD +,0.5～1m l 35%酒精。若染色后的花粉呈紫罗兰色
或粉红色,则花粉有生活力。该方法简便,但也能使死花粉着色,测定值偏高[24]。由于药品毒性大,对某些植物存在潜在的危害,所以一般不采用。
1.8 P 2苯二胺法 P 2苯二胺测定法(p 2phenylenedia m ine 2per 2oxidase 2test ,简称ppp 2test )[24-25]。P 2苯二胺法的基本原理是通
过检测花粉中髓过氧化物酶的存在与否来判断花粉生活力。具体操作步骤如下:把一小管过氧化物酶指示剂(包括25
m g p 2苯二胺双盐酸和50m g 邻苯二酚,S igm a 39021)和200μl
3%H 2O 2(30%过氧化氢和磷酸缓冲液按1∶9比例混合,pH 值7.4),加入到37℃预热的50m l 稀释的T rizm al 6.3缓冲液中(用T rizm al 6.3浓缩液和去离子水按1∶9比例混合)。由于染液对
温度和光敏感,所以应在使用前2d 配制,并且在4℃冰箱中暗保存。若发现染液颜色由浅棕色变为深棕色或黑色,则说明染液失效。使用前,先在37℃下预热10～15m in 。测定时,取少量预热的染液滴到待测的花粉样品上,10～15m in 后在显微镜下观察。如果花粉变黑,则说明花粉具有生活力。死花粉与活花粉染色差异非常明显,易于鉴定,适于野外操作。但由于药品对温度和光敏感,所以必须在暗处操作。
1.9 其他 醋酸洋红染色法的染色原理是靠花粉中的脱氢
辅酶而染色。当花粉失去活力时,该酶的活性仍然存在,所以该方法的测定结果偏高[26-29]。靛红染色法是根据花粉中脯氨酸的有无来判断花粉生活力的,对于细胞中脯氨酸含量少的种类如向日葵不实用[30],染色界限也不明显;甲基兰、中性红等染色法是根据细胞质的有无来判断花粉生活力的[31],与离体萌发测定和种子形成测定有相关性,但能使死花粉着色,测定值偏高。
2 萌芽测定法
2.1 离体萌发测定法 抽取花粉在培养基上萌发,在显微
镜下观察花粉的萌发率,以此作为花粉生活力的标准。一般把花粉管的长度大于、等于花粉的直径作为花粉萌发的标准。常用的培养基有固体和液体2种,以后者最为简便。培养基主要成分是蔗糖和硼酸,其浓度一般为蔗糖10%～
20%,硼酸0.001～0.005%,pH 值5.8～6.5。蔗糖的作用是
提供合适的渗透压和花粉管形成所需能量,硼酸的作用是促进花粉管的萌发[32-33]。不同植物花粉萌发所需要的培养基种类和浓度不同。二细胞型花粉如豆科、兰科、蔷薇科、腊梅等较易萌发,一般在仅含蔗糖和硼酸的基本培养基上培养即可;而三细胞型花粉如十字花科、菊科、禾本科等较难萌发,要在基本培养基的基础上添加其他促进花粉萌发的元素,如
C a (NO 3)2、M gS O 4、K H 2PO 3、V B 1、PEG (聚乙二烯)等[34-35]。另
外,葡萄糖也可以作为培养基成分,因为葡萄糖是真正的小分子物质,较蔗糖而言易被细胞吸收,花粉萌发效果好。曹广力等在研究外源性糖对4种木本观赏植物花粉离体培养的影响时发现,葡萄糖对于桃的花粉萌发作用优于蔗糖[36]。
培养基的配制方法包括悬滴法、点试法、井试法、琼胶法和膜试法5种[37],其中琼胶法采用固体培养基,其他采用液
3
47435卷16期 左丹丹等 植物花粉生活力检测技术进展
体培养基。
花粉萌发率是鉴定花粉生活力的一项重要指标。除了与花粉本身的质量有关外,萌发率还与萌发时的环境条件密切相关,如培养温度、营养物质、矿质元素等。所以,培养条件有差异时,测定结果也有差异。同时,花粉管的长度在一定程度上也反映了花粉生活力的状况。
与染色法相比,离体萌发试验虽然操作复杂,花粉不易涂抹均匀,耗时长,但花粉萌发测定的数据却科学可靠,并可完全定量,对于许多植物都与结实和种子形成有相关性,故仍为目前杂交育种中花粉生活力测定的首选方法。Zhao2 lifeng等在研究OsAP221对花的发育所起的作用时比较了I22 K I、TT C和离体萌发,发现离体萌发数据较准确[38]。
2.2 活体萌发测定法 活体萌发测定法的基本原理是,具有花粉管的花粉粒能被锚定在柱头上,并且不会被漂洗掉,所以可以通过漂洗柱头、比较漂洗前后柱头上的花粉粒数目来推测其萌发率[39]。
具体操作步骤如下:①将待测花粉人工授粉于柱头上,保证花粉与柱头充分接触,并把授粉的柱头与外界隔离;②一段时间后(以具体物种而定),将柱头取下并小心置于1%醋酸结晶紫水溶液内,使花粉的外壁着上深紫色,与浅色的柱头区别开来;③在解剖镜下,对柱头上的花粉粒记数;④将该柱头用水漂洗几次后,再对剩余的花粉粒记数,得出萌发率。
M ayer在对蝇子草属(Silene L.)的花粉生活力研究中使用了活体萌发测定法[40]。与其他方法相比,该方法最为直接可靠,模拟了自然状态下的受精状况,但仅适合于感受性柱头,测定结果偏低,柱头的表面性质对所测试样也有所限制。
3 田间授粉测定法
将新鲜花粉与贮藏的花粉同时授给相关植物,观测并比较贮藏前后授粉后的结实率。基本原理是根据果实和种子形成情况判断花粉生活力。该方法比较可靠和精确,但是费时费力,不利于生产,而且还受到田间气候、环境条件及母本植株性状的影响,测定结果明显低于染色法。Inagaki将新鲜花粉与贮藏在-196、-80、-20℃的花粉分别给六倍体珍珠稷授粉,发现新鲜花粉的胚形成率高于贮藏花粉,而且贮藏温度间产生胚的频率差异明显[41]。孙文根对李花粉贮藏期间生活力变化及田间授粉效果进行了研究,发现低温、干燥、避光贮藏后的花粉坐果率低于新鲜花粉[42]。M azzucato采用授粉结实方法对番茄单性果实突变体的花粉进行了活力测定,发现虽然花粉的活力很高,但是结籽率很低[43]。
4 其他方法
4.1 形态测定法 室内形态测定法的基本原理是根据花粉自身的形状来判断花粉生活力。该方法虽然简单,但测定的有活力花粉的比率明显高于实际值,且重复之间差异较大,所以一般不采用。王少先对辣椒花粉生活力的测定结果表明,该方法比离体萌发结果要低很多[3]。苗青等对文冠果花粉进行了形态学观察,发现败育花粉和可育花粉均为圆形,表面有疣状突起,但大小不同;两者均有3个萌发沟,萌发沟内有复饰物,莲花状;但败育花粉在萌发沟之间有压痕,上下各3个,对称分布[31]。
4.2 无机酸测定法 无机酸测定法也叫“瞬时花粉管”形成法。其基本原理是:酸对花粉管质膜的刺激作用使细胞膜变得十分脆弱,通透性增大,以致大量的吸收H+,使内压迅速增加,并导致质膜膨胀,最后喷射出活性花粉的胞质内含物,形成“瞬时的花粉管”。该测定法首选的无机酸是硝酸,其次是硫酸。对于大多数植物的花粉来说,硫酸的浓度以1.60 m ol/L为最佳,而2.23m ol/L硫酸会破坏花粉粒;硝酸的最佳浓度是0.8m ol/L[39,44]。该方法在体外产生花粉管最快,但产生的不是真正的花粉管,而是渗透压或pH值的作用使原生质渗出,形成象花粉管的结构。所以,该方法只检测细胞质的存在与否,实质是形态学方法,一般很少采用。
5 小结与讨论
总体上,染色法简单、迅速,能够在一定程度上直接反映花粉的代谢情况或营养含量,但受花粉自身特性的影响较大,不能直接表现花粉的萌发率。因此,不同的染色法只适合某些植物花粉生活力的测定。离体萌发测定法可以直观区分死亡或缺乏活力的花粉,数据可靠,但需要依据不同种类配制不同的培养基,在适宜的温度、湿度等培养条件下测定其生活力,耗时相对较长。活体萌发测定法精确,模拟了自然状态下的受精状况,但仅适合于感受性柱头,测定结果可能偏低,柱头的表面性质对所测试样有限制。田间授粉测定法准确但速度太慢,不利于生产,而且还受到田间气候、环境条件及母本植株性状的影响,测定结果明显低于染色法。Antonia等利用基因突变手段测出5个与拟南芥(Arabidop sis thaliana)花粉活性直接相关的基因[45]。这为在分子水平上测定花粉生活力提供了可能。
为了得到比较准确的测定结果,应注意以下问题:①认真记录花粉收集和贮藏的基本情况数据,如温度、RH、水合或脱水程度等;②同种花粉不同的测定方法所得结果可能有很大差异,因此应选择适合于所测样品的最佳方法;③形态测定法和染色法分别根据花粉形态和染色反应来检验生活力,两者都是对花粉生活力进行的间接检验,并非直接表现花粉在田间的实际萌发率,只有在这些检验方法得到的数据与萌发检验、授粉检验相一致或呈相关性的情况下,才适合应用这些方法。
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(上接第4723页)
影响较小,以浓度为800mg/L时胚状体的生长最好。噻孢霉素的浓度在100mg/L和300mg/L时,农杆菌已抑制了胚状体的生长,500和800mg/L时胚状体的生长最好,浓度在1000mg/L时严重抑制了枇杷胚状体的生长。
表2抗生素对枇杷胚状体生长的影响%
抗菌素浓度∥m g/L接种15d存活率接种30d存活率
安必西林0 100 100
100226
3002810
5005432
8006042
10004834
噻胞霉素0100100
1003016
300124
5003024
8002020
10001812
硫酸庆大霉素
0100100 100142 300140 50080 80020 100000
3 讨论
抗生素的种类不同,对植物材料的影响不同,同时抗生素的浓度也因植物种类不同而不同。即使是同一植物,不同品种对抗生素的耐受力也存在较大的差异。材料越幼嫩,对抗生素的耐受力越弱,所以每种外植体都有其最佳的抗生素使用量[5]。研究表明,安必西林、噻孢霉素和硫酸庆大霉素对农杆菌EH A52均有较好的抑制效果。其中,硫酸庆大霉素对农杆菌的抑制效果最好,但是它对枇杷胚状体的生长影响最大,浓度在100mg/L时就严重影响到枇杷胚状体的生长,浓度越高则越影响枇杷胚状体的生长,接种30d枇杷胚状体几乎无生长;安必西林和噻孢霉素的浓度在高于500mg/L时对农杆菌的抑制效果较好。所以,在枇杷胚状体遗传转化中,安必西林作为抗生素最为合适,其最佳浓度为500～1000 mg/L。
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35卷16期 左丹丹等 植物花粉生活力检测技术进展
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
花粉活力测定的3种方法
实验16花粉活力的测定 在作物杂交育种、作物结实机理和花粉生理的研究中，常涉及花粉活力的鉴定。掌握花粉活力快速测定的方法，是进行雄性不育株的选育、杂交技术的改良以及揭示内外因素对花粉育性和结实率影响的基础。 一、花粉萌发测定法 【原理】 正常的成熟花粉粒具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下可直接观察计算其萌发率，以确定其活力。 【器材与用具】 载玻片；显微镜；玻棒；恒温箱；培养皿；滤纸。 【试剂】 培养基：10%蔗糖，10mg/L硼酸，0.5%的琼脂。称10g蔗糖、1mg硼酸、0.5g 琼脂与90ml水放入烧杯中，在100℃水浴中熔化,冷却后加水至100ml备用。 【方法】 1.将培养基熔化后，用玻棒蘸少许，涂布在载玻片上，放入垫有湿润试纸的培养皿中，保湿备用。 2.采集丝瓜、南瓜或其他葫芦科植物刚开放或将要开放的成熟花朵，将花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃左右的恒温箱（或室温20℃条件下）中孵育，5~10min后在显微镜下检查5个视野，统计其萌发率。 【注意事项】 1.不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而改变培养条件。
2.此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度，离体时间，环境条件等因素对花粉活力的影响。 3.不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的葫芦科等植物花粉活力的测定。 二、碘- 碘化钾染色测定法 【原理】 多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I 2 -KI溶液可将其染 成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，I 2 -KI溶液 染色呈黄褐色。因此，可用I 2 -KI溶液染色来测定花粉活力。 【器材与用具】 显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。 【试剂】 I 2-KI溶液：取2g KI溶于5～10ml蒸馏水中，加入1g I 2 ，待完全溶解后， 再加蒸镏水300ml。贮于棕色瓶中备用。 【方法】 采集水稻、小麦或玉米可育和不育植株的成熟花药，取一花药于载玻片上， 加一滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1～2滴I 2 -KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。观察2～3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。 【注意事项】 此法不能准确表示花粉的活力，也不适用于研究某一处理对花粉活力的影响。因为三核期退化的花粉已有淀粉积累，遇碘呈蓝色反应。另外，含有淀粉而 被杀死的花粉粒遇I 2 -KI也呈蓝色。 三、氯化三苯基四氮唑（TTC）法
花粉生活力测定方法研究进展.
花粉生活力测定方法研究进展 摘要:总结了花粉活力测定的染色法、离体萌发法以及田间授粉法等的原理和应用并分析了各种方法的优缺点。 关键词:花粉花粉活力测定方法 花粉是高等植物的雄性配子体,在有性繁殖过程中起到传递雄性亲本的遗传信息。花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象,也是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉具有生长、萌发、或发育的能力。在农业生产及农业常规杂交育种的中,研究花粉的生活力和育性是不可缺少的基础性工作。农业生产和育种工作通常会遇到花期不一致带来的困难,为解决这一难题,保存花粉的活力成为重要手段,而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。因此,掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有较高的作用和意义。 综合前人的研究结果,花粉生活力的检测方法可以分为四大类:①染色法;②萌发测定法;③田间授粉检测法;④形态测定法、无机酸检测法。 1染色法 1.1TTC 染色法 TTC 即 2,3,5-氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料,水溶液无色。基本原理是 [1]:当 TTC 渗入细胞后, 遇到活细胞里的脱氢酶接受氢离子,由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物,由此来判断花粉的生活力。 具体操作步骤:①配制 PH 为 7.17的磷酸缓冲液。称取 0.832克磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾溶于 100ml 的蒸馏水中,调整 pH 为 7.17。② TTC 溶液配制。依据不同植物称取 0.02~1.0g 的 TTC 溶于 100ml 的磷酸缓冲液中, 于棕色瓶中黑暗处保存。③染色。取少量花粉置于载玻片上,加上一滴 TTC 溶液,用镊子搅拌均匀,
基因芯片及其在植物病原物检测中的应用
基因芯片及其在植物病原物检测中的应用 摘要:基因芯片是近年来发展起来的一项新兴技术，是把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵，在基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等方面起着重要的作用。基因芯片技术已广泛应用于病原物检测，在植物病害预测和防治中起着重要的作用。 关键词:基因芯片; 病原物检测 1996年，美国Affvmetrix生物公司制造出世界上第一块商业化的基因芯片(Gene chips)，由此掀起了基因芯片研究热潮。基因芯片被迅速而广泛地应用于生命科学与医学的各领域，被誉为继大规模集成电路后又一次意义深远的科技革命[1]。随着基因芯片技术的不断发展，其在生命科学和医学中的研究领域中的应用几乎是全方位的，包括基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等［2］。本文仅叙述基因芯片原理已经基因芯片在植物病原物检测中的作用。 基因芯片的基本原理 基因芯片，又称DNA芯片(DNA chips)，属于生物芯片(bio-chip)中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA分子点阵，因固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片［3］。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术:将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，待分析样品经过标记后与固定在芯片上的探针杂交。其技术流程主要包括芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强以及可以反复利用等诸多优点［4］。
植物细胞的微核检测技术-
设计性实验 化生院生物科学教研室
一、实验目的 ?1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点；?2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。?3、小组合作，掌握设计实验的基本能力。
二、实验原理 ?微核(micronuclei)简称MCN，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。 ?一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/20 ~1/5，这就是微核。
?微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
三、实验材料： 大蒜、大豆、蚕豆等。 四、实验仪器设备： 显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、 载玻片及盖玻片。
五、实验步骤： 1、幼根的培养：提前3~5天进行培养，将大蒜瓣剥去外边膜 质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置培养箱中，注意每天换水，经3~5天后，即可长出1-2cm的嫩根。 2、处理根尖：阳性检测采用1.0~2.5M CrO3，0.5~ 1.5M NaN3，150250mM EMS，对照用自来水处理， 处理时间24h。 3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次 2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。
花粉的形态观察及生活力测定
实验一花粉贮藏及花粉生活力的测定 花期不遇给杂交工作造成困难，有的园林植物可通过调整花期来解决，有的则不得不进行花粉贮藏，或者从外地寄运花粉。为了避免杂交工作失误，在使用外地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉的生活力进行检测，以便对杂交结果进行分析与研究。因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术 一、实验目的 掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。 二、实验材料 百合、金鱼草、菊花等花粉。 三、仪器及药品 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、吸水纸、TTC（2.3.5—氯化三苯基四唑）、KI-I2、蓝墨水。 四、实验原理 花粉在低温（ 0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。 花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过
氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。 鉴定花粉生活力的方法很多，概括起来主要有如下几种： 1 ．直接测定法将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。 2 ．形态观察法直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。 3 ．染色观察法 1 ）碘－碘化钾染色法：以碘－碘化钾溶液（ 0.3g 碘＋ 1.3g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水）染色后于显微镜下观察，花粉被染成蓝色者表示具有生活力，花粉呈黄褐色者不具有生活力。 2 ） TTC 染色法：使用TTC测定花粉生命力的原理，主要是无色药液进入花粉遇到活组织里的脱氢酶，接受氢离子，还原成红色三苯基甲腊TTF，还原结果使有生命力的花粉染上红色，死花粉不着色；花粉生活力强弱有异，染色深浅也有不同。在28—30℃的温度下2小时以上(花卉不同染色时间也不同)。
病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三病毒核酸检测常用技术 （Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。 实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。 【基本原理】 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
微核试验报告
方便面面饼液对蚕豆根尖微核率的影响 专业年级:2012级生物工程 成员:王浩楠 王绍伟 谢帅
一、摘要 用蚕豆根尖细胞微核技术检测不同种类方便面面饼液微核的诱变效果。设置了阴性对照：自来水处理组，实验组：小浣熊、康师傅、统一、五谷道场、幸运五组饼液分别处理蚕豆根尖，阳性对照：用0.02g/L的醋酸铅溶液处理。发现方便面面饼液在诱导微核产生方面影响明显，醋酸铅溶液具有诱导微核产生的作用。 关键字：蚕豆根尖，方便面面饼，微核千分率，污染指数 二、实验背景和目的 随着现代社会的发展，越来越多的化学物质运用到人们的日常生活之中，如种类繁多的食品添加剂。而其中有些物质具有较强的危害，如致畸，致癌，致突变性。为了检测已存在或潜在的危害，各种检测技术应运而生。微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法,在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用。微核计数经济,迅速,简便,不需要特殊技能,可以统计更多的细胞并实现计算机自动计数。我们采用蚕豆作为实验材料，采用植物微核技术来检测方便面面饼中添加剂对人体是否产生危害。 方便面是日常生活中经常接触到的食品，其市场占据快餐食品的大壁江山，在超市中油炸方便面与非油炸方便面占到快餐食品的60%
到70%。另一方面，在各媒体的报道中，经常出现有关方便面的食用危害，而且很有争议，所以这也是我们进行本实验的一个原因。三、实验原理 微核是间期细胞中在细胞核之外存在的一个或多个圆形或杏仁状结构，大小在主核的1/3以下，是有丝分裂后期丧失着丝粒的落后的染色体片段形成。20世纪70年代初，Matter和Schmid等首先用动物骨髓细胞微核率来测定怀疑具有诱变活力的化合物，并称之为微核。许多能引起染色体断裂的理化因素，如辐射、化学诱变剂等，均可作用于分裂细胞而产生微核。 在有丝分裂的后期，断裂的染色体片段或完整的染色体落后于其他染色体，当大部分染色体到达细胞两极并重新被核膜包裹时，这些落后的染色体或染色体片段不能进入主核，便形成了独立于主核之外的核质物团，并在间期时浓缩成小核。含微核的细胞数占观察细胞总数的比率称为微核细胞率，简称微核率，可以用来反映遗传物质受伤的程度。在一定范围内，微核率与环境因子的剂量呈正相关，因此，人们常用微核率来反映环境中有害物质的污染程度。 不同厂家生产的面饼化学成分不一，用微核作为面饼材料是否含有有害人体健康物质的手段之一。 四、实验用品 材料：蚕豆种子，小浣熊、康师傅、统一、五谷道场、幸运五个品种方便面 器材：镊子4把，解剖针4支，显微镜，水浴锅，大托盘、培养皿7
花粉生活力测定
实验九花粉生活力测定 一、实验目的 1．学习和了解植物花粉生活力测定方法及原理。 2．初步掌握稻、麦的花粉生活力测定方法。 二、内容说明 农业常规育种工作中，为了进行人工辅助授粉和杂交授粉，尤其是杂交育种工作，为解决亲本花期不一致和远距离杂交的问题，通常需要早期采集和储藏花粉。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命，花粉的储藏条件，以及花粉生活力的测定有所区别，这一是由花粉本身的特征决定的，二是由贮藏条件决定的。一般来说，禾谷类作物花粉的寿命较短，自花授粉植物花粉的寿命尤其短，如小麦在花药开裂后30min，花粉即由鲜黄色变为深黄色，此时己有大量花粉丧失活力。 在许多特殊条件下，花粉生活力的差异对于研究花粉-柱头的相互作用，作物改良与育种操作，基因库的保持，不亲和性与受精关系，生理调节对花粉萌发的影响和基因流等，均有非常重要的实践意义。因此，对于外地采集来的花粉的短暂贮藏、花粉的生物学研究、自交或远缘杂交分析结实率或不结实原因、鉴定雄性不育系时，花粉生活力的测定显得很重要。 花粉生活力有很多表述法，为了方便起见，现将各种表述方法列表如下(表9-1)，以供参考。 表9-1 花粉生活力的各种表述法 花粉生活力的测定方法较多，通常可分为萌发测定和不萌发测定两大类，常用的有：（1）形态鉴定法是一种简便的鉴定新采集花粉的方法。可通过直接观察花粉在形态上有明显差异来鉴定花粉有无生活力。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物充实饱满，形状规则，大小整齐。因
内部含有较多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代花粉形态和育性的鉴定。 （2）染色鉴定法（FCR法）用不同的化学试剂如双乙酸荧光素(fluorescein diacetate)、联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。双乙酸荧光素是一种荧光染料，其本身不产生荧光，无极性，可以自由地透过完整的原生质膜。当此种染料进入原生质后，即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质—荧光素，并且这种物质不能自由出入原生质膜，而只在细胞内积累，所以，可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。此方法可同时反映出酶活和质膜情况两个指标。 （3）花粉发芽测定法配制一定浓度的蔗糖溶液等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验。根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。 三、材料仪器药品 1．材料当天采集的稻、麦任一种作物的新鲜花粉。 2．仪器用具冰箱、荧光显微镜、普通显微镜、恒湿箱、载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、镊子、解剖针、吸水纸、滤纸、标签、铅笔等。 3．药品KNO3、NaOH、MgSO4、MnSO4、Ca(N03)2、H3BO3、1%I-IK溶液、双乙酸荧光素、丙酮、乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、苯胺蓝、冰醋酸、蔗糖、琼脂、马铃薯淀粉、蒸馏水。 四、方法步骤 花粉的育性和生活力可由浅入深按以下顺序观察鉴定：外形观察→I-IK测定内含物的充实度→染色法鉴定花粉酶学性质→花粉发芽试验→观察花粉在柱头上萌发和伸长情况。 （一）形态鉴定 1．将少量正常的稻、麦的新鲜花粉用解剖针播于一般载玻片上，于低倍显微镜下观察花粉形态。根据形态特征，判断花粉的生活力状况。一般来说，畸形、皱缩、小型化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。将观察的结果统计一下填写表格9-2。 2．与形态观察相同。但在有花粉的载玻片上滴1滴1%I-IK，再观察花粉是否染色和染色深浅情况，以判断花粉内含物的充实度。正常花粉应有较多的淀粉粒，遇I-IK呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。 （二）FCR测定法（荧光染料反应法) 荧光染色法可根据细胞质膜完整性判断花粉的生活力。迅速简便，与萌发测定有相
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
浅谈计算机病毒的检测技术
浅谈计算机病毒的检测技术 摘要：在互联网高速发展的今天，计算机病传染性越来越强，危害性也越来越大。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。本文对其特点以及优缺点逐一进行了叙述。 关键词：计算机病毒检测技术 一、引言 Internet改变了人们的生活方式和工作方式，改变了全球的经济结构、社会结构。它越来越成为人类物质社会的最重要组成部分。但在互联网高速发展的同时，计算机病毒的危害性也越来越大。在与计算机病毒的对抗中，早发现、早处置可以把损失降为最少。因此，本文对计算机病毒的主要检测技术逐一进行了讨论。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。这些方法依据原理不同，检测范围不同，各有其优缺点。 二、计算机病毒的检测方法 (1)长度检测法 病毒最基本特征是感染性，感染后的最明显症状是引起宿主程序增长，一般增长几百字节。在现今的计算机中，文件长度莫名其妙地增长是病毒感染的常见症状。长度检测法，就是记录文件的长度，运行中定期监视文件长度，从文件长度的非法增长现象中发现病毒。知道不同病毒使文件增长长度的准确数字后，由染毒文件长度增加大致可断定该程序已受感染，从文件增长的字节数可以大致断定文件感染了何种病毒。但是长度检测法不能区别程序的正常变化和病毒攻击引起的变化，不能识别保持宿主程序长度不变的病毒。 (2)病毒签名检测法 病毒签名(病毒感染标记)是宿主程序己被感染的标记。不同病毒感染宿主程序时，在宿主程序的不同位置放入特殊的感染标记。这些标记是一些数字串或字符串。不同病毒的病毒签名内容不同、位置不同。经过剖析病毒样本，掌握了病毒签名的内容和位置之后，可以在可疑程序的特定位置搜索病毒签名。如果找到了病毒签名，那么可以断定可疑程序中有病毒，是何种病毒。这种方法称为病毒签名检测方法。但是该方法必须预先知道病毒签名的内容和位置，要把握各种病毒的签名，必须解剖病毒。剖析一个病毒样本要花费很多时间，是一笔很大的开销。 (3)特征代码检测法
微核试验报告
基础生物学实验自主设计性实验 实验名称：方便面面饼液对蚕豆根尖微核率的影响专业年级：2008级生物科学类 成员: 指导教师： 起止时间：2010年10月-2010年12 月 一、摘要
用蚕豆根尖细胞微核技术检测不同种类方便面面饼液微核的诱变效果。设置了阴性对照：自来水处理组，实验组：小浣熊、康师傅、统一、五谷道场、幸运五组饼液分别处理蚕豆根尖，阳性对照：用0.02g/L的醋酸铅溶液处理。发现方便面面饼液在诱导微核产生方面影响明显，醋酸铅溶液具有诱导微核产生的作用。 关键字：蚕豆根尖，方便面面饼，微核千分率，污染指数 二、实验背景和目的 随着现代社会的发展，越来越多的化学物质运用到人们的日常生活之中，如种类繁多的食品添加剂。而其中有些物质具有较强的危害，如致畸，致癌，致突变性。为了检测已存在或潜在的危害，各种检测技术应运而生。微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法,在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用。微核计数经济,迅速,简便,不需要特殊技能,可以统计更多的细胞并实现计算机自动计数。我们采用蚕豆作为实验材料，采用植物微核技术来检测方便面面饼中添加剂对人体是否产生危害。 方便面是日常生活中经常接触到的食品，其市场占据快餐食品的大壁江山，在超市中油炸方便面与非油炸方便面占到快餐食品的60%到70%。另一方面，在各媒体的报道中，经常出现有关方便面的食用
实验四、花粉生活力的测定
实验四、花粉生活力的测定 一、实验目的：通过实验掌握花粉生活力测定的具体技术和方法。 二、实验原理：花粉生活力是指在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 三、实验材料：苹果花粉 四、实验用具与试剂：指形管、显微镜、载玻片、盖玻片、凹式载玻片、滴瓶、培养皿、天平、烧杯、玻璃棒、微波炉、滤纸、水浴锅、计数器、镊子；碘化钾（KI）、碘、蓝墨水、蒸馏水、蔗糖、琼脂、硼酸等。 五、实验步骤 常用的测定花粉生活力的方法：形态观察法、碘-碘化钾染色法、蓝墨水染色法和培养基发芽法。 1. 形态观察法 直接在显微镜下观察花粉的形态，根据花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。具体方法：将花粉置于载玻片上，在显微镜下观察3个不同视野，要求被检查的花粉粒总数达到100粒以上，计算正常花粉粒占总数的比率。 此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。 2. 染色法 (1) 碘-碘化钾染色法 ①原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正常花粉用I-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当I-KI染色时呈黄褐色。 ②I-KI溶液：取2.0 g KI溶于5～10mL蒸馏水中，然后加入1.0 g I2待全部溶解后，再加蒸馏水至200mL，贮于棕色瓶中备用。 ③具体方法：取少量花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再加一滴I-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察。凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。为了保证实验的准确性，要求观察不同的3个视野，求其平均值，统计花粉生活力。 (2) 蓝墨水染色法 ①蓝墨水溶液：正常购买的蓝墨水稀释10倍。
浅析马铃薯病毒检测技术
马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。 马铃薯病毒检测包括：基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法（DAS-ELISA）检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。 1马铃薯病毒的概况 1.1马铃薯X病毒（PVX） 也称普通花叶病毒,是一种长520～550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。一般减产5%～10%,症状是叶片从轻型花叶到叶片有较轻的皱缩。马铃薯X病毒靠汁液传播,也是传播最广泛的一种病毒。 1.2马铃薯Y病毒（PVY） 也称重花叶病毒,是马铃薯第二个重要病毒性病害,是一种长680～900nm的线状病毒,在电镜下找不到它的中心孔和外壳蛋白亚基的横纹,它比PVX更细一些、更长一些。通过感染的块茎长期存在并由蚜虫非持续性地传播,产量损失可达80%。症状随着病毒株系、马铃薯品种及环境条件变化很大。1.3马铃薯A病毒（PVA） 又称轻花叶病毒,在许多方面类似于马铃薯Y病毒。在某些品种中出现时,一般比马铃薯Y病毒轻,产量损失可达40%。马铃薯A病毒引起花叶(有时很严重),同时也发生脉缩和卷曲,叶片可能出现闪光。 1.4马铃薯S病毒（PVS） 也称潜隐性花叶病毒,感病块茎变小,一般减产 浅析马铃薯病毒检测技术 景彩艳 （甘肃省定西市农产品质量安全监督管理站定西743000） 摘要：随着科学技术的不断发展,马铃薯病毒检测技术在日益的完善,DAS-ELISA法已经成为马 铃薯病毒检测的常规方法。容易侵染马铃薯的病毒类型主要有6种,分别是马铃薯的PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA病毒。马铃薯在生长的过程中,因受到各种不同病害的侵染,容易造成减产 和退化。血清学技术是马铃薯病毒检测的主要手段。 关键词：马铃薯病毒；血清学技术；双抗体夹心酶联免疫吸附法 215 --
植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
实验二 植物细胞微核检测技术
实验二植物细胞微核检测技术 一、实验目的 1、理解细胞微核形成的机理及其形态特点， 2、学会培养植物根尖的技术。 3、学会植物根尖的微核诱导技术。 3、学会习植物根尖细胞的微核检测技术。 4、了解毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义。 二、实验原理 毒理遗传学，用遗传学方法研究环境因子对生殖细胞或体细胞的遗传物质的损伤及其毒理效应的遗传学分支学科。环境因素造成的遗传毒理效应包括三个方面：突变形成、癌形成、致畸效应，简称为毒理遗传的三致效应。毒理遗传学的应用：鉴定生殖细胞、体细胞致突变物；预测潜在的致癌物；环境遗传毒物污染的监测和评价。根据危害鉴定、描述剂量-反应关系、致突变机制，进行危险度和致癌危险度评价。 微核(micronuclei)简称MCN，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。 微核形成：有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片不能
向两极移动，游离于细胞质中，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核，直径大约是细胞直径的1/20～1/5。 三、实验材料、仪器及试剂 大蒜、显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、载玻片及盖玻片、盐酸、乙醇、石碳酸品红染液、硫酸铜。 四、实验步骤 1、幼根的培养（提前3—5d进行培养） 将大蒜瓣剥去外边膜质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置培养箱中，注意每天换水，经3—5d后，即可长出1-2cm的嫩根。 2、处理根尖：阳性检测采用0.1g/L硫酸铜，以及自行设计（或采集）的液体，对照用自来水处理，处理时间24h，处理液浸没根尖。 3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。 4、固定：切取1cm左右的根尖，用无水乙醇：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去固定液，移入70％酒精中，4℃冰箱保存。 5、酸解：弃去固定液，用蒸馏水漂洗2-3次，吸净水。用1
三花粉的贮藏和生活力测定
实验三花粉的贮藏和生活力测定 一、目的和要求 在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 从生产上来看，在选择相互授粉的品种时，也应考虑到品种的花粉发芽能力，凡是花粉发育不全的品种，其花粉的发芽率都很低。因此不适宜做授粉品种。 本实验的主要目的是掌握花粉贮藏和花粉生活力测定的方法。 二、花粉及用具 材料：桃或苹果树的花粉。 用具：显微镜、天平、盖玻片、凹式载玻片、培养皿、干燥器、试管、滴瓶、蒸馏水、凡士林、蔗糖、氯化钙、琼脂、联苯胺、α-奈酚、碳酸钠、过氧化氢等。 三、方法 （一）花粉贮藏 从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中，放于干燥的室内，令其开裂，花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中，口上塞以棉花或橡皮塞，贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内，使花粉在空气相对湿度较低的条件下（一般0～40%）保存；为了减少呼吸作用，可以放在低温（0～4℃）黑暗的地方贮藏。 （二）花粉生活力试验 1、花粉发芽法 人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。 （1）培养基的制作与接种 一般采用5～20%蔗糖或葡萄糖加1～2%琼脂，溶于蒸馏水中。加热煮沸即可，将已配制好的培养基保持在40℃温度即不凝固，用玻璃棒点一点培养基敷在载玻片的凹坑内，然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。轻轻振动，使花粉均匀地撒在培养基上，将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上，并