花粉的形态观察及生活力测定

实验一花粉贮藏及花粉生活力的测定
花期不遇给杂交工作造成困难，有的园林植物可通过调整花期来解决，有的则不得不进行花粉贮藏，或者从外地寄运花粉。

为了避免杂交工作失误，在使用外地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉的生活力进行检测，以便对杂交结果进行分析与研究。

因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术
一、实验目的
掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。

二、实验材料
百合、金鱼草、菊花等花粉。

三、仪器及药品
显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、吸水纸、TTC（2.3.5—氯化三苯基四唑）、KI-I2、蓝墨水。

四、实验原理
花粉在低温（ 0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。

花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过
氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。

鉴定花粉生活力的方法很多，概括起来主要有如下几种：
1 ．直接测定法将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。

此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。

也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。

2 ．形态观察法直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。

此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。

3 ．染色观察法
1 ）碘－碘化钾染色法：以碘－碘化钾溶液（ 0.3g 碘＋ 1.3g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水）染色后于显微镜下观察，花粉被染成蓝色者表示具有生活力，花粉呈黄褐色者不具有生活力。

2 ） TTC 染色法：使用TTC测定花粉生命力的原理，主要是无色药液进入花粉遇到活组织里的脱氢酶，接受氢离子，还原成红色三苯基甲腊TTF，还原结果使有生命力的花粉染上红色，死花粉不着色；花粉生活力强弱有异，染色深浅也有不同。

在28—30℃的温度下2小时以上(花卉不同染色时间也不同)。

4 ．培养基发芽法在培养基上进行花粉的人工萌发，鉴定待测花粉萌发率的高低。

此法若采用适宜的培养基能较精确地测定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌发条件存在较大的差异，所以很多时候测定的结果也只是相对可靠。

五、实验步骤：
１．花粉的贮藏：
（１）将采集的花粉进行干燥（凉干或放入盛有无水氯化钙的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏结为度。

（２）将干燥的花粉装在指形管中（不要太多，一般以五分之一体积或更少为宜），瓶口塞以纱布，瓶外贴以标签，注明花粉种类、采收日期。

（３）将指形管放入无水氯化钙控制一定湿度的干燥器中，干燥器置于 0 ～ 2℃的冰箱内。

２．花粉生活力的测定：
（１）染色观察法——TTC 染色法
①配制 TTC 染色液：称取 0.5g TTC 溶于 100ml 磷酸盐缓冲液（ 100ml 蒸馏水中溶解 0.832g Na 2 HPO 4 ·2H 2 O 和 0.273g KH 2 PO 4 ， pH7.2 ）中，装入棕色瓶备用。

②制片：取少量花粉于载玻片上，滴入 1 ～ 2 滴 0.5 ％TTC 染色液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，于 35 ～ 40℃条件下净置 15 ～ 20min 。

③观察统计：在显微镜下观察三个不同的视野，凡被染成红色或玫瑰红的都是有生活力的花粉，黄色或不着色者为没有生活力的花粉。

（２）培养基发芽法——固体培养基
①配制培养基：称取 1g 琼脂， 5g 蔗糖，量取 94ml 蒸馏水，装入烧杯，加热使琼脂融化呈透明状（注意补充水分，以保持培养基的浓度），即配成 5% 浓度的培养基。

同法配制 10% 、 15% 、20% 浓度的培养基。

②制片：用滴管吸取少量培养基，趁热滴在载玻片的凹槽内，放置片刻，使其凝固。

③播种花粉：将少量花粉均匀地撒播在培养基上，注意不可过多，否则难以观察。

④培养与观察：将制备好的片子放在垫有湿润滤纸的培养皿内，于 20 ～ 22℃的温箱中培养；待花粉萌发后于显微镜下观察并统计发芽率。

观察时每片随机取三个视野，统计花粉总数及发芽数，计算平均萌发率（花粉总数不少于 100 粒）。

六、作业及思考题：
１、按下表统计实验结果。

用染色法计算花粉生活力 (3 -5个视野 ) 。

花粉生活力 ( ％ ) =有生活力花粉数／观察花粉总数× 100
染色法测定结果记载表
2.检测花粉生活力能否采用蓝墨水？其原因及机理是什么？。