猕猴桃细菌性溃疡病菌gacA基因的克隆及功能分析
猕猴桃对溃疡病抗性评价指标的研究的开题报告
猕猴桃对溃疡病抗性评价指标的研究的开题报告
1.研究背景
溃疡病是一种常见病，多见于消化道，给患者带来很大的影响。
目前，常用的药物治疗不能完全治愈溃疡病，而且还存在一定的毒副作用，因此有必要寻找新的治疗方式。
猕猴桃是营养成分丰富、富含多种维生
素和矿物质的水果，且含有多种生物活性物质，具有抗氧化、抗炎、抗
老化等多种保健功效。
有研究表明，猕猴桃提取物具有一定的抗溃疡病
作用，因此有必要对猕猴桃对溃疡病的抗性进行评价。
2.研究目的
从生物学角度入手，研究猕猴桃对溃疡病的抗性评价指标，以期为
研发猕猴桃抗溃疡病功能食品提供理论依据。
3.研究内容
（1）收集猕猴桃及其提取物研究文献，了解其化学组成、营养价值和生物活性物质；
（2）以动物模型为研究对象，分别用不同剂量的猕猴桃提取物处理溃疡病动物，观察其抗溃疡病作用；
（3）采用理化分析、生化指标、免疫组织化学和分子生物学等多种研究方法，评价不同指标对猕猴桃提取物的抗溃疡病作用。
4.研究意义
猕猴桃是一种常见的水果，富含营养素和生物活性物质，具有多种
保健功效。
本研究将应用生物学方法从多个方面评价猕猴桃的抗溃疡病
作用，为其进一步应用于溃疡病防治和研发猕猴桃抗溃疡病功能食品提
供理论依据。
同时，本研究提供了一种新的治疗溃疡病的思路，为寻找
新的溃疡病治疗方式提供了新的思路。
猕猴桃溃疡病研究现状及展望
猕猴桃溃疡病研究现状及展望猕猴桃溃疡病是一种由病原菌引起的植物病害。
该病害主要由细菌Erwinia amylovora引起，它是一种革兰氏阴性的杆状细菌，可以引起多种果实和果树的病害，如苹果等。
猕猴桃溃疡病影响了猕猴桃产量和质量，给果农带来了经济损失，也给猕猴桃的商业化种植带来了巨大威胁，因此对该病害的研究成为了近年来极为关注的热点领域。
目前，关于猕猴桃溃疡病的研究主要集中在病原菌的鉴定、防治措施研究及遗传鉴定等几个方面。
首先，对病原菌的鉴定是研究该病害的关键。
现有研究表明，引起猕猴桃溃疡病的主要病原菌是Erwinia amylovora。
特别是在欧洲，这种菌株的研究非常深入。
除此之外，还有其他一些菌株也可引起类似的病害，比如酸枝溃疡病菌等，因此对这些病原菌的鉴定也越来越受到关注。
其次，对于防治措施的研究也是研究猕猴桃溃疡病的重点之一。
目前，主要采用的防治措施包括化学防治和生物防治两种。
化学防治主要是利用杀菌剂喷洒猕猴桃果树表面来杀灭病原菌；生物防治则是通过引入一些天敌来控制病原菌的繁殖，比如利用一些细菌来攻击病原菌。
此外还有其他一些方法，如培育抗病品种、改良种植技术等。
在这方面，还有许多研究需要深入探索，以取得更好的防治效果。
最后，遗传鉴定也是目前比较热门的研究方向。
随着基因芯片技术、转录组测序技术等新技术的发展，越来越多的基因变异引起的猕猴桃耐抗性被发现，并且利用遗传工程技术制造出一些抗病品种。
这些成就本着猕猴桃鲜美的品质，可持续发展并保持猕猴桃生态平衡。
总之，猕猴桃溃疡病的研究成果将对缓解病害带来的经济损失和环境污染等问题产生积极影响。
但是，目前猕猴桃溃疡病的研究还有许多未知和需要探索的领域，希望在不断的研究中，能够找到更好的防治措施，使猕猴桃产业健康可持续发展。
猕猴桃细菌性溃疡病防治-2013
猕猴桃细菌性溃疡病防控技术（安徽农业大学果树种的实验室）猕猴桃细菌性溃疡病（Kiwifruit bacterial canker）是一种寄生性强、极耐低温的细菌性枝干病害，致病菌为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidae，PSA），其侵染、传播不易发觉、具有隐蔽性，发生速度快、具有暴发特征，对猕猴桃植株危害性极大。
由于该病害隐蔽性强，一般在侵染部位未流出菌脓前，很难发现，一旦发现有菌脓流出，危害已经扩展蔓延，严重发生时造成死树毁园。
目前，细菌性溃疡病已经在全世界流行，对猕猴桃产业的威胁巨大。
广大猕猴桃种植户，在注意果园的清洁卫生的同时，应抓住关键时期，及时采取有效措施，进行综合防治。
1、检疫与隔离注意苗木检疫、不从溃疡病流行地区引种接穗、苗木等活体材料；搞好发病果园隔离，进出发病猕猴桃园时，做好消毒、防疫隔离工作。
育苗采集接穗，应选在无感病史果园，嫁接时严格刀具消毒，防止嫁接传染。
2、品种选择根据目前观察，生产上应用的‘徐香’、‘金魁’、‘华优’、‘海沃德’等品种较耐病；‘红阳’、‘Hort16A’等品种易感病，应慎重发展。
新建猕猴桃园，要选用抗病性强的品种、无病菌苗木建园。
3、保持树势根据品种特性、树龄大小、树势强弱、立地条件，合理负载产量；秋季增施有机肥，提高有机质含量，改良土壤；实施平衡施肥、配方施肥，维持健壮的树势。
4、药剂防控抓住关键时期喷药预防：萌芽前，全园喷布5°Be石硫合剂；采果后，可用代森铵1200-1500倍液、20%乙酸铜600-800倍液、或加瑞农800-1000倍液、或噻菌铜600-800倍液，对叶面、枝干等部位进行喷雾。
生长季节，注意对黑尾大叶蝉等刺吸式口器的害虫进行防控。
重病果园，落叶后可用乙酸铜100倍液、加瑞农200倍液、施纳宁100倍液等进行枝干灭菌。
5、清除病原对局部枝条感染、发病较轻的植株，及时剪除已染病的各类枝条，带出果园销毁，防止病原再次传播，修剪刀具每次使用前后都要用75%酒精或10波美度石硫合剂消毒。
猕猴桃细菌性溃疡病的危险性分析
省的苍溪县 、都 江堰市 ，陕 西省的周 至县猕猴桃 栽培区域发生 ，并造 成 了严重 的经济损 失。２０ ０１
年全国森林植物检疫对 象普查结果 ，该 病分 布 区 进一 步扩 大到陕 西省 的长 安 区、户县 、蓝 田县 、
灞 桥 区 、雁 塔 区、 眉 县 、武 功 县 、杨 凌 区 ，安 徽
要：猕猴桃细 菌性 溃疡 病是 猕猴桃的重要病 害。为 了正确 认识该 病发生 的危 险性 ，有效 防止其进 一步扩 散
蔓延 ，参照 国际上有 害生物风 险分析方法 ，对 猕猴桃细 菌性溃 疡病在 国 内的危 险性 进行 了定 性和定 量分析 。做
出了综合评价 ，并提 出检疫 和防治管理措 施。
省的岳西县 ，北京市的房山县等 ］ 。猕猴桃细菌
性溃疡病在 四川省发生 面积 ２８６ ７ｈ ０ ． ｍ ，陕西省
发生 ３ １５ｈ １． ｍ ，安徽省发生 １ ｍ ，湖南省发生 ４ｈ ２６ｈ ． ｍ ，北京发生 １３ ｍ 。１９ ～ ０２ ．３ｈ ９２ ２０ 年的 １ ０
关键词 ：猕猴桃 ；细菌性 溃疡病 ；危 险性 分析 中图分类 号：￥ ３ ．３ ． ４ ６ ６４ １ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１０ ８ １ ２ ０ ）４—０９ ０ ０ ０－ １Ｘ（０ ７ ０ ０ １— ４
猕 猴 桃 细 菌 性 溃 疡 病 （ ｓｕｏ ｏａ ｙ ｎａ Ｐｅｄｍ ｎｓＳｆ ｇｅ ｉ
对其危险性 进行分 析与评估 。同时，提 出相应 的 风险管理措施 ，为林业 有害生物 管理工作提供科
学的依据。
年间 ， 陕西猕猴桃栽培 区发生面积从 ０ １ ｈ ．３ ｍ 扩
大到 ３ １５ｈ １． ｍ ，平均发病株率从 ３６ ．％迅速 增加 到 ２ ％ 以上 ，周 至、户县发病株率高达 ５ ％，并 ０ ２ 且有蔓延趋势 。
猕猴桃细菌性溃疡病的发病规律及防治对策
猕猴桃细菌性溃疡病的发病规律及防治对策作者：龙晓玲来源：《吉林农业·下半月》2013年第11期摘要：随着社会经济的快速发展，人民生活日新月异，生活水平不断提高。
在膳食方面，对食物的种类与质量的要求也越来越高。
猕猴桃作为一种高营养水果，兼有很好的医疗保健价值，受到越来越多群众的青睐与喜爱。
然而，在种植和生长过程中，猕猴桃却面临着规律性的细菌性溃疡病的威胁，给猕猴桃的产量和品质都带来了极大的影响。
本文就猕猴桃细菌性溃疡病的发病规律这个问题展开论述，并提出相关防治对策。
关键词：猕猴桃；细菌性溃疡病；发病规律；防治对策中图分类号： S663.4 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-22-33-11 猕猴桃细菌性溃疡病的发病规律综述1.1 猕猴桃细菌性溃疡病简介猕猴桃细菌性溃疡病容易发生在冷凉、湿润的地区，而这类地区同时也是生产优质猕猴桃的理想生态环境。
这种病被列为国家森林植物检疫对象，一旦发病，不仅直接降低猕猴桃产量，还会导致猕猴桃果实变小、果皮变厚、果形不一、果味变酸，品质大大下降，给猕猴桃的生产造成毁灭性危害。
不仅如此，这种病来势非常凶猛，发病严重的年份可导致整个果园濒于毁灭。
1.2 发病规律概述猕猴桃细菌性溃疡病的发生必须在有伤口的地方开始，像是雹伤、冻伤、剪口伤、擦伤、裂皮等，这样的地方才能给溃疡病病菌的入侵提供入口。
此外，从客观环境上讲，多雨年份发病要比少雨年份频繁；迎风带和高寒区病害要比避风带和温暖区严重。
从种植管理方面看，成片种植的地区比隔离种植的地区更严重，而粗放管理地区要比精耕细作地区更为严重。
从果树自身的生长来看，已经长大的果树比幼年树发病频繁，而衰老的树又比成年健壮的树发病严重。
1.3 发病特点猕猴桃细菌性溃疡病有些规律性的特点。
第一，发病较早。
很多地方从元月份开始就有发病现象。
第二，发病率较高。
据调查数据显示，平均发病率在5%～10%之间，严重的果园发病率可达30%～40%，最高纪录有达到60%的。
猕猴桃细菌性病害的发生及抗性研究进展
针对以上问题，未来猕猴桃细菌性抗性研究应以下几个方面：
1.深入开展抗性机制研究：了解猕猴桃抗细菌性病害的机制，有助于针对性 地开展抗性品种的选育和改良。通过深入研究植物与病原菌之间的相互作用，
揭示抗性的分子机制，为抗性品种的选育提供理论依据。
2.加强抗性资源的筛选与利用：对抗性资源进行广泛筛选和鉴定，发掘具有 优良抗性的猕猴桃品种和种质资源。同时，通过杂交、诱变等育种手段，培育具 有多重抗性的新品种，提高抗性水平。
研究方法主要包括文献回顾、专家调查、实验设计和数据分析等。文献回顾 主要是对前人研究的总结和评价；专家调查则主要是对当前研究现状和发展趋势 的评估；实验设计主要是探索有效的生物防治方法；数据分析则主要是对实验结 果的总结和分析。
最近的研究成果揭示了马铃薯细菌性病害的新病因和病理。例如，研究发现 一些新的微生物种群可以有效地抑制马铃薯环腐病和青枯病病原菌的生长。此外， 生物多样性的研究也取得了重要进展。研究发现，在健康的马铃薯田中，细菌种 类丰富且分布
针对这些病害，研究者们提出了多种防治方法。其中，最常用的方法是使用 化学农药。然而，长期使用化学农药不仅会对环境造成污染，还会导致病原菌产 生抗药性。因此，生物防治方法逐渐受到人们的。生物防治方法主要包括利用有 益微生物和生物
农药抑制病原菌的生长，同时提高马铃薯自身的抗病能力。相较于化学农药， 生物防治方法具有环保、安全和可持续等优点。
食用菌病害。近年来，随着食用菌产业 的快速发展，细菌性病害的发生也日益严重。细菌性病害对食用菌的产量和质量 造成极大的影响，给种植户带来了巨大的经济损失。因此，对食用菌细菌性病害 的研究具有重要意义。
二、病原菌及病害发生
食用菌细菌性病害的病原菌主要包括假单胞菌、黄单胞菌和欧文氏菌等。这 些病原菌在食用菌生长环境中广泛存在，当环境条件适宜时，就会引起食用菌病 害。例如，假单胞菌和黄单胞菌可导致食用菌的软腐病和锈斑病，欧文氏菌则可 引起根腐病和叶斑病等。
猕猴桃溃疡病研究现状及展望
猕猴桃溃疡病研究现状及展望猕猴桃溃疡病是一种由细菌感染引起的猕猴桃植株疾病。
该病在猕猴桃产业中造成了严重的经济损失，因此对该病的研究变得非常重要。
本文将对猕猴桃溃疡病的研究现状进行综述，并对未来的研究方向进行展望。
目前，关于猕猴桃溃疡病的研究主要集中在以下几个方面：1. 猕猴桃溃疡病的病原菌鉴定及生物学特性研究：已经确定猕猴桃溃疡病的主要病原菌是一种名为Pseudomonas syringae pv. actinidiae（简称Psa）的细菌。
研究人员通过对病原菌的分离培养、形态学观察和生理生化特性分析，深入研究了Psa的生物学特性。
这些研究为进一步探究猕猴桃溃疡病的病因机制奠定了基础。
2. 猕猴桃抗性育种研究：由于猕猴桃溃疡病的侵害，研究人员致力于培育抗病品种。
通过研究猕猴桃的抗病性遗传规律，筛选出抗病性较强的猕猴桃品种。
也通过转基因技术导入抗病基因，使得猕猴桃植株对病原菌更具抵抗力。
3. 病害防控措施研究：为了有效控制猕猴桃溃疡病，研究人员探索了各种防治方法。
开展了猕猴桃植株的消毒处理研究，通过消毒种植材料等措施减少病原菌传播。
也利用化学药剂和生物制剂进行病害防治，减轻病害对猕猴桃产业的危害。
未来，猕猴桃溃疡病的研究仍然面临许多挑战，研究人员需要进一步深入探究以下几个方面：1. 病因机制研究：虽然已经确定了Psa是猕猴桃溃疡病的主要病原菌，但其具体引起病害的机制还不完全清楚。
需要通过研究细菌与猕猴桃之间的相互作用，解析猕猴桃溃疡病的发生和发展机制。
2. 抗病育种研究：目前，虽然已经培育出一些抗病性较强的猕猴桃品种，但是其抗性可能受到个体差异的影响，且对不同的病原菌类型表现不同。
需要进一步研究猕猴桃的抗病遗传规律，提高抗病品种的育种效果。
3. 环境条件对病害传播的影响研究：环境条件对病害的传播起着重要的影响，而猕猴桃溃疡病的发生与环境因素之间的关系还不清楚。
需要研究环境条件对猕猴桃溃疡病传播的影响，为制定相应的防控措施提供科学依据。
猕猴桃细菌性病害的发生及抗性研究进展
作者 简介 ： 张弛 （９ ６ ） １８ 一 ，男，汉 族 ，安徽 涡 阳人 ，在读硕 士研 究生 ， 主
要从 事果树 现代 生物技术 与遗传 育种研 究。Ｅｍａ － ｌ ｇ ｈｓ ｕ ６ ． ｍ。 — ｉｚ ｌ ￣ ｃｉ ＠１ ３ ｏ ｗ ｃ 通讯 作者 简介 ： 郭启 高 （９ ５ ） １ ７ 一 ，男，汉族 ，重庆 永川人 ，博 士 ，副研 究 员，主要从事果树现代生物技 术与遗 传育种研 究，Ｅｍａ ：ｉ ｏｕ ＠１６ ｏ 。 － ｉｑ ａｇ ｏ ２ ． ｉ ｌ ｇ ｃｎ
１４ 年 ，Ｆｏ 在研究亚麻锈病 时提 出了 “ 因对 性 鉴定 。值得 一 提 的是 ，在所 获得 的多倍 体植 株 中 ， ９７ ｌｒ 基
国 、新 西兰 、意 大利 、智利等 国¨。猕 猴桃果 实具有 １
１ 猕 猴 桃 细 菌 性 病 害 的 发 生
猕猴桃 细菌性病 害主要 有 溃疡 病 、花腐 病 、根癌
很高 的营养价 值和药用 价值 ，富含 氨基酸 、矿 物质及 １ 病 原 及为 害 ． １
多种维生素等 ，其 中维生素 ｃ含量 丰富 ，被誉为 “ ｃ Ｖ
针对 猕猴 桃抗 病 育种 的研 究 较 少 。 仅在 猕 猴桃 细 菌
４种病 害的分 布及病 症见 表 １ 。
性 病 害 的发生 、预 报 以及抗 性 机理 研 究 方面 有一 定 １ 发 生及 侵染 规 律 ． ２
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猕猴桃细菌性溃疡病菌gacA基因的克隆及功能分析丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)
引起的细菌性溃疡病是猕猴桃生产上一种毁灭性细菌性病害,该病害于1980年
首次发现在美国加利福尼亚和日本静冈县,随后蔓延至新西兰、意大利、中国等地,此病害的流行给猕猴桃产业的发展造成重大的经济损失。
gacA基因是一类广泛存在于革兰氏阴性细菌中的调控因子,调控着细菌的毒性及次生代谢产物。
Psa在寄主选择类型及致病流行条件方面与其他丁香假单胞细菌具有很大
差异,然而,至今关于gacA基因在猕猴桃溃疡细菌致病中的作用机制尚未见报道。
因此本研究根据已知的丁香假单胞番茄致病变种(P.s.pv.tomato)中调控基因gacA的序列,利用生物信息学手段,从猕猴桃溃疡菌的全基因组中克隆出gacA基因的同源基因。
然后采用同源重组的方法构建gacA基因的缺失突变体及回复突变体,并对
其功能进行初步分析。
研究内容如下:1.猕猴桃溃疡病菌gacA基因的克隆及生物信息学分析根据来源于假单胞菌属(Pseudomonas syringae)、芽孢杆菌属(Bacillus Cohn)、黄单胞菌属(Xanthomonas Campestris)、欧文氏菌属(Erwinia amylovora)已报道的gacA基因,利用CLUSTALX软件进行序列分析,分析结果表明假单胞菌属中gacA基因高度同源,相似性达98%。
以猕猴桃溃疡病菌野生型菌株AHP-18为供试菌株,根据假单胞菌属中gacA
基因的保守序列,设计特异性引物gacA3/gacA4,克隆得到gacA基因,测序验证正确后,在NCBI上对测序结果进行分析。
利用
SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对Psa的GacA蛋白序列的进行结构域分析。
结果表明,Psa中GacA具有GacA相似蛋白的结构,GacA蛋白的N端具有一个REC结构域,主要作用是接受信号感受蛋白传递来的磷酸基团;C端具有HTH结构,负责多极化以及和启动子DNA结合。
2.猕猴桃溃疡病菌gacA基因缺失突变体的构建及筛选采用同源双交换的方法对猕猴桃溃疡病菌的gacA基因进行缺失突变,首先设计特异性引物(gac-1U/gac-1R、gac-2U/gac-2R)扩增出gacA基因的上下游同源臂片段,为了降低筛选突变株的难度,同时引入氯霉素抗性片段然后采用融合PCR技术构建融合片段作为外源目的片段,测序验证正确后,与自杀载体
pK18mobsacB相连,构建重组载体pK18gacA。
本研究基于三亲结合技术将重组载体转入野生型菌株AHP-18中,经过同源单交换,得到260株gacA基因单交换菌株,从单交换菌株中筛选得到双交换菌株20株,即为gacA基因的缺失突变株。
3.ΔgacA功能互补菌株的构建及筛选设计特异性引物对(gac-F/gac-R)从菌株AHP-18扩增出要补入的基因片段,并且在片段两端同时引入合适的酶切位点(PstI/BamHI),将扩增的外源片段及广宿主质粒pLAFR3分别酶切,然后以3:1进行连接,构建互补重组载体,然后基于三亲结合技术将重组载体导入突变株△gacA基因组中,利用四环素抗性筛选得到阳性克隆,然后进行菌落PCR验证,正确的即为互补菌株。
4.猕猴桃溃疡病菌gacA基因的功能分析将野生型菌株、突变型菌株及恢复突变株分别接种猕猴桃活体枝条、离体叶片和烟草叶片,研究gacA基因的生物学功能。
试验结果表明,gacA基因参与调控了病菌的毒素和胞外酶合成,病菌的游动能力及致病性等,该基因的缺失导致病菌的产phaseotoxion毒素丧失、胞外酶合成和鞭毛游动能力下降以及致病力降低。