槐耳清膏体外诱导人肝癌细胞
槐耳提取物抗血管新生及抗癌作用的研究王晓龙1、张宁1、霍强1
槐耳提取物抗血管新生及抗癌作用的研究王晓龙1、张宁1、霍强1、杨其峰1,31山东大学齐鲁医院乳腺外科，山东济南，250012，摘要中草药，作为有效抗癌药物的一个丰富资源，正广泛地被越来越多的人重视。
最近，槐耳的抗癌功效正被广泛研究。
然而，其药物机理尚不明确。
此课题旨在阐明槐耳提取物对血管新生及癌细胞生长所起的抑制作用。
用槐耳提取物培养，可抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和小鼠乳腺癌细胞（4T1）的增殖。
此外，在体外环境用槐耳提取物处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），可以一种剂量依赖的方式降低其侵袭迁移和血管形成的形成。
蛋白质印迹分析所示，槐耳提取物可剂量依赖性减少细胞外调节蛋白激酶(ERK),p65表达，c-Jun氨基端激酶（JNK）, 信号传导与转录激活因子(STAT3), 血管内皮生长因子(VEGF)的水平。
在体内试验中，通过槐耳提取物对鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）和小鼠动脉环处理实验分析，其对血管新生起抑制作用。
为了更好地研究其抑制机理，对BALB/c小鼠皮下注射4T1细胞。
槐耳提取物对抑制肿瘤体积，降低微血管密度，诱导细胞凋亡有一定作用。
这些数据显示，槐耳提取物可以作为一种有效抗血管新生及抗癌抗菌药物。
关键词槐耳，血管新生，癌症，4T1，人脐静脉内皮细胞癌症，是一种多步骤、系统性的疾病。
在2008年，据记载，共有7千6百万人死于癌症（约占总死亡率的13%）。
乳腺癌作为癌症的一种主要类型，在2008年共造成458000人死亡。
在美国，仅2011年便新增230480例浸润型乳腺癌病例，39520人死于乳腺癌。
在发展中国家，乳腺癌患者约占全球总病例的一半，死亡病例约占全球总数的60%,并且在这些地区，乳腺癌是导致妇女患癌死亡的主要因素。
在中国，乳腺癌病例从2002年的126227例猛增到2008年169452例。
然而，目前有效的化学疗法伴随很强的副作用和剂量受限的毒副作用。
因此，能够干预癌症主要发展步骤（如血管新生）的药物正被广泛的用于人类癌症治疗。
槐耳清膏诱导人直肠癌HR8348细胞凋亡的实验研究
槐耳清膏诱导人直肠癌HR8348细胞凋亡的实验研究程若川;汤礼贵;兰丽琴;贾伟【期刊名称】《中国普外基础与临床杂志》【年(卷),期】2003(10)6【摘要】目的探讨槐耳清膏在体外对人直肠癌HR83 48细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用及其作用机理。
方法将处于对数生长期的HR83 48细胞用含槐耳清膏的培养基培养 3 6h ,用四氮唑蓝 (MTT )比色法检测吸光度 (OD)值 ,计算抑制率 ;用甲基绿派若宁染色法及TUNEL法检测细胞凋亡指数 ;用免疫组织化学方法检测bcl 2、bcl xl、bax、bak及 p5 3基因表达的情况。
结果槐耳清膏对HR83 48细胞的抑制率随浓度增加而上升 ,浓度为 4.0mg/ml时抑制率最大(71.1% ) ,与 5 FU组 (浓度为10 μg/ml)相比差异无显著性意义 (P>0 .0 5 )。
甲基绿派若宁染色法和TUNEL法均可见到典型的细胞凋亡、凋亡小体或出泡现象 ,凋亡指数随槐耳清膏浓度的增加而增加 ,当浓度达 4.0mg/ml时 ,凋亡指数迅速上升 ,甲基绿派若宁法为0 .162 0± 0 .0 12 8,TUNEL法为 0 .2 612± 0 .0 15 8,均大于5 FU组的凋亡指数(0 .0 780± 0 .0 0 95和0 .10 2 8± 0 .0 13 1) ,P<0 .0 5。
槐耳清膏组bcl 2、bcl xl、bak、p5 3蛋白表达较空白对照组明显增强(P<0 .0 5 ) ,而bax变化不明显 (P>0 .0 5 )。
槐耳清膏组bak/bcl 2和bak/bcl xl比值显著大于空白对照组。
结论槐耳清膏在体外对人直肠癌HR83 48细胞具有显著的抑制作用和凋亡诱导作用。
槐耳清膏?【总页数】4页(P568-571)【关键词】槐耳清膏;诱导;直肠癌;HR8348细胞;实验研究;细胞凋亡【作者】程若川;汤礼贵;兰丽琴;贾伟【作者单位】昆明医学院第一附属医院普通外科;浙江省苍南县第三人民医院普通外科;昆明医学院第一附属医院实验中心【正文语种】中文【中图分类】R735.37【相关文献】1.槐耳清膏体外诱导人肝癌细胞凋亡的实验研究 [J], 金小顺;耿小平;朱立新;许伦兵;熊奇如;侯辉;刘念2.槐耳清膏诱导人肺腺癌细胞A549凋亡的实验研究 [J], 黄涛;孔庆志;卢宏达;戴观书3.槐耳清膏诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的实验研究 [J], 吴志慧;蒋建伟;曹明溶;陈涛;张小鹰;吴风云4.槐耳清膏诱导人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231凋亡的研究 [J], 徐亮;张晟;张霖;牛瑞芳;张瑾5.槐耳清膏诱导人直肠癌HR8348细胞凋亡的实验研究 [J], 程若川;汤礼贵;兰丽琴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
槐耳颗粒治疗原发性肝癌的研究进展
甘肃医药2021年40卷第4期Gansu Medical Journal ，2021，Vol.40，No.4原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都居于肿瘤谱的第二位。
根据原发性肝癌诊疗规范，肝癌治疗方法包括手术切除、肝移植、经导管动脉化疗栓塞术、系统治疗、放疗等。
随着医学界对肝癌治疗观念上的转变，肝癌的治疗提倡在多学科联合诊治基础上，联合中医药进行全身性的综合治疗［1］。
槐耳颗粒具有活血化瘀、消肿散结之功效，现代中医理论认为其具有扶正固本的抗肿瘤作用，槐耳颗粒联合不同方法治疗原发性肝癌具有较好的临床疗效。
1槐耳颗粒的作用机制槐耳（Tramets tobiniophila Murr .）为生长在衰老的洋槐、槐树、青檀等树上的药用真菌，槐耳含有多种有机成分和10多种矿物质，主要成份为槐耳菌质，包括多糖、蛋白质、酮体、生物碱等，其活性成分为多糖蛋白（PS-T ），化学结构为6个杂多糖和18个氨基酸组成的蛋白质［1］。
市售槐耳相关制剂主要有槐耳颗粒和槐耳清膏，关于槐耳颗粒治疗肿瘤的相关文献报道较为常见。
槐耳颗粒的抗肿瘤作用主要包括以下几个方面，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭并诱导其凋亡、逆转肿瘤细胞的耐药性、抑制血管生成、增强机体免疫功能、阻断乙肝-肝细胞癌及增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等［2］。
虽然国内外诸多研究已明确凋亡是槐耳颗粒抑制肝癌细胞的一种机制，但对其诱导凋亡的具体途径、作用的靶点及凋亡调控机制等研究相对较少。
包海东［3］观察槐耳颗粒对肝癌细胞HepG2及Huh7的增殖和凋亡变化，检测槐耳颗粒对凋亡相关蛋白（Caspase 3、PARP 、Survivin 、Bcl-2家族蛋白）、MAPK 和AKT/m TOR 信号通路蛋白、自噬相关蛋白表达的影响。
研究表明，槐耳颗粒诱导肝癌细胞发生自噬，并抑制AKT/m TOR 信号通路和p38MAPK 信号通路起到了抑制自噬的作用，p38MAPK 显著影响Bcl-2家族蛋白及Survivin 表达，且Survivin 可能是其潜在的靶蛋白。
2001槐耳清膏诱导人肺腺癌细胞 A549 凋亡的实验研究
论著摘要基金项目:武汉市卫生局科研基金资助项目(2000 148)作者单位:430033武汉市第四医院槐耳清膏诱导人肺腺癌细胞A549凋亡的实验研究黄涛 孔庆志 卢宏达 戴观书槐耳清膏是药用真菌槐耳菌质的热水提取物,临床上证实有一定的抗癌效果。
为进一步探讨其抗癌机制,我们研究了槐耳清膏在体外诱导人肺腺癌细胞系A549凋亡的作用。
材料与方法 引进并培养人肺腺癌细胞系A549细胞株。
制备不同浓度的槐耳清膏PRMI 1640含药培养液与接种成功、呈对数生长的A549细胞共同培养24h 后,每6h 进行以下观察及测定(设阳性对照组羟基喜树碱100 g/ml,共同孵育10~12h 后进行测定)[1]。
(1)荧光染色:收集培养细胞,清洗并均匀涂片自然风干24h,置于0 05mg/L 的Hoechst33258及0 1mg/L 的硫柳汞的无钙、镁的磷酸缓冲染色液中作用40min,封片后荧光显微镜下观察、拍照、计数;(2)电子显微镜观察:同上收集细胞6 106,磷酸缓冲液(PBS)清洗,戊二醛固定,再经锇酸染色、缩水包埋、切片后透射电子显微镜观察照相记录;(3)流式细胞仪分析:同法收集、清洗、固定细胞2 106,离心后加入100 l 磷酸二氢钠/柠檬酸缓冲液室温震荡30min,在离心的细胞中加入含100mg/L 核糖核酸酶A(Rnase A)和25mg/L 碘化丙啶(PI)的染色液1ml 在暗处4 染色3h,用FACSort 流式细胞仪分析细胞周期。
实验数据通过SPSS For Windows 软件进行统计学分析。
结果 在Hoechst33258荧光染色下,清膏各浓度组24h后及羟基喜树碱组10~12h 后均可见到凋亡发生(图1,2)。
分别计数各组每5个高倍镜视野中的细胞总数及凋亡细胞数,计算凋亡比率可见:清膏不同浓度组均在36h 左右达凋亡高峰,其中3 0mg/ml 清膏组凋亡比率最高为36 2%;100g/ml 羟基喜树碱10~12h 左右达凋亡高峰,凋亡率为35 7%。
槐耳清膏对胃癌细胞NCI-N87自噬的影响
槐耳清膏对胃癌细胞NCI-N87自噬的影响廖传文;李洁兰;殷俊翔;胡淑琴;饶雪峰【摘要】目的观察槐耳清膏对人胃癌细胞NCI-N87细胞自噬的影响.方法以NCI-N87细胞为研究对象,用不同浓度的槐耳清膏(4、8、16、32mg/ml)分别处理细胞24h、48h、72h后,用CCK-8法检测NCI-N87细胞的增殖抑制率,用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞自噬小体含量,并通过RT-PCR和Western blot对自噬相关蛋白包括Beclin-1、LC3-II和PTEN的mRNA和蛋白水平进行检测.结果和对照组相比较,4mg/ml以上浓度的槐耳清膏对细胞的增殖、凋亡及细胞内自噬小体含量均有显著影响,并表现与浓度和时间的正相关性.RT-PCR和Western blot 结果显示,与对照组相比,Beclin-1、LC3II和PTEN明显升高.结论槐耳清膏可诱导胃癌细胞NCI-N87自噬.【期刊名称】《江西医药》【年(卷),期】2018(053)011【总页数】5页(P1232-1235,1258)【关键词】槐耳;自噬;胃癌【作者】廖传文;李洁兰;殷俊翔;胡淑琴;饶雪峰【作者单位】江西省人民医院普外科,南昌 330006;江西省吉水县人民医院,吉水331600;江西省人民医院普外科,南昌 330006;江西省人民医院普外科,南昌330006;江西省人民医院普外科,南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R735.2中药在抗肿瘤方面扮演着非常重要的作用[1]，槐耳提取物在中国有1600年的使用历史[2]，研究表明槐耳提取物在体外可抑制多种肿瘤细胞活性及增殖作用[3]。
自噬是一个保守的依赖溶酶体的降解途径，可降解长寿命蛋白质、细胞器和部分细胞质，并已被证明参与包括能量代谢、细胞器周转、生长调节和衰老等生理病理过程[4，5]。
近年来研究表明，自噬在肿瘤细胞生长、分化和抵抗药物治疗等方面扮演重要角色[6]。
槐耳是否能通过影响胃癌细胞自噬进而影响胃癌的发生发展，尚鲜有报道。
槐耳清膏能抑制裸鼠肺癌细胞的增殖活性
槐耳清膏能抑制裸鼠肺癌细胞的增殖活性童琳;常美佳;胡洁;周建;白春学【摘要】目的:探讨槐耳清膏对裸鼠异种肺癌移植瘤模型的抑瘤作用.方法:构建裸鼠异种肺癌移植瘤模型,给予该模型鼠槐耳清膏处理.将裸鼠随机分为实验组和对照组,分别给予槐耳清膏(剂量分别为1、3、5、7 g/kg)、0.9％NaCl溶液各0.2 mL 灌胃,每3 d给药1次,持续给药3周.观察裸鼠肿瘤体积的变化及裸鼠体质量变化,比较瘤体质量,显微镜观察移植瘤组织病理变化和Ki-67阳性细胞比率.结果:裸鼠接种肺癌细胞14 d后,接种部位均出现肿瘤生长.槐耳清膏1、3、5、7 g/kg剂量组抑瘤率分别为(1.73±12.99)％、(6.68±11.34)％、(46.24±9.17)％、(35.05±12.15)％.与对照组相比,槐耳清膏5 g/kg(P=0.0044)和7 g/kg(P=0.0215)剂量组抑瘤率显著升高.槐耳清膏5 g/kg体质量组瘤重较对照组有降低趋势,但差异无统计学意义.Ki-67免疫组化染色显示,与对照组相比,槐耳清膏3、5、7 g/kg 剂量组肿瘤细胞增殖率显著下降,其中7 g/kg组Ki-67阳性率最低(24.8％,P<0.001).结论:槐耳清膏能抑制裸鼠体内肺癌细胞的增殖活性,从而抑制肿瘤生长.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2019(026)002【总页数】4页(P205-208)【关键词】肺癌;槐耳;裸鼠;抑瘤率【作者】童琳;常美佳;胡洁;周建;白春学【作者单位】复旦大学附属中山医院呼吸科 ,上海市呼吸病研究所 ,上海 200032;复旦大学附属中山医院呼吸科 ,上海市呼吸病研究所 ,上海 200032;复旦大学附属中山医院呼吸科 ,上海市呼吸病研究所 ,上海 200032;复旦大学附属中山医院呼吸科 ,上海市呼吸病研究所 ,上海 200032;复旦大学附属中山医院呼吸科 ,上海市呼吸病研究所 ,上海 200032【正文语种】中文【中图分类】R734.2;R28近年来，随着对肺癌发病机制研究的进一步深入，新兴的治疗手段不断涌现，使得晚期肺癌患者的预后得到较大改善。
抑制肝癌细胞内质网应激可增强槐耳清膏的抗肿瘤作用
网络出版时间：2020-12-2903网络出版地址：https：////ncms//etail/34.1062.R.20201201.1222.002.htnii抑制肝癌细胞内质网应激可增强槐耳清膏的抗肿瘤作用林霄2孙国平2章菊12,刘加涛1摘要目的探讨4-苯基丁酸(4-PBA)抑制肝癌细胞内质网应激(ERS)对槐耳清膏抗肿瘤作用影响。
方法首先将肝癌细胞分为对照组与实验组,对照组(0me/mlC不作处理,实验组细胞用不同浓度的槐耳清膏(2、4、6、8m/m/进行处理,24h后用MTT法检测肝癌细胞活力，流式细胞术检测肝癌细胞凋亡率‘Western blot法测定肝癌细胞内凋亡蛋白Bcl-C和Bax的表达情况以及ERS相关蛋白GRP78、PERK和IRE1的水平;再将肝癌细胞分为4组，分别为con 组、4-PBA组、Huaier组和联合用药(4-CBA+Huaier)组,24 h后检测肝癌细胞ERS相关蛋白PERK和IRE1的表达水平、肝癌细胞活力、凋亡率以及细胞内Bcl-C和Bax的表达情况。
结果与Huaier组相比,4-PBA+Huaier组中肝癌细胞活力下降;4-PBA+Huaier组肝癌细胞株HepG2和Hep3B凋亡率为(1.12±16.98)%和(2.32±15.68)%,而Huaier组细胞凋亡率为(1.2±12.89)%和(2.58±10.67)%,差异有统计学意义(P<0.02)。
结论槐耳清膏与4-PBA联合使用可抑制肝癌细胞发生ERS,抑制肝癌细胞活力并使肝癌细胞凋亡增加，增强槐耳清膏的抗肿瘤作用。
关键词4-苯基丁酸;肝癌；内质网应激;槐耳清膏中图分类号R735.7文献标志码A文章编号1000-1492(2020)12-1822-06 doi：10.19405//cnki.issnl000-1092.2024.12.002肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，晚期肝癌病死率位列第三,5年生存率仅为14%⑴。
槐耳清膏对人肺腺癌A2细胞生物学行为影响及相关机制研究-程万宏
29第18卷 第3期 2016 年 3 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 18 No. 3 Mar .，2016槐耳清膏对人肺腺癌A2细胞生物学行为影响及相关机制研究程万宏，杨争秒（大连大学附属新华医院，辽宁 大连 116022）摘 要：目的：研究槐耳清膏对人肺腺癌A2细胞的增殖抑制作用及凋亡促进作用，并探讨其分子机制。
方法：MTT 法检测槐耳清膏对细胞增殖的抑制作用；流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响；Western blotting 测定Wnt-1和Survivin 蛋白表达的变化。
结果：槐耳清膏能显著抑制人肺腺癌A2细胞增殖、促进凋亡，P <0.05；下调靶基因蛋白表达水平。
结论：槐耳清膏可抑制人肺腺癌A2细胞增殖、促进细胞凋亡，其机制可能与下调Wnt-1和Survivin 表达有关。
关键词：人肺腺癌细胞株A2；Wnt-1蛋白；Survivin 蛋白；槐耳清膏中图分类号：R730.261，R734.2 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2016) 03- 0029- 03收稿日期：2015-09-10基金项目：大连市卫生局科研立项基金资助项目（WSJ/KJC-013-JL-56）作者简介：程万宏（1973-），男，辽宁抚顺人，副主任医师，博士，研究方向：肺癌综合治疗。
Study on Effects of Extract of Fungi of Huaier on Biological Behavior of HumanLung Adenocarcinoma Cell line A2 and Its Molecular Mechanisms CHENG Wanhong，YANG Zhengmiao（Xinhua Affiliated Hospital of Dalian Univercity，Dalian 116022，Liaoning，China）Abstract：Objective ：To evaluate the effects of Extract of Fungi of Huaier on the proliferation andapoptosis in human lung adenocarcinoma cell line A2 and its mechanisms. Methods ：MTT was used to detect the inhibition of cells growth. Flowcytometry method was used to detect the apoptosis. The changes of the expression of Wnt-1 and Survivin protein were analyzed by western blot. Results ：Compared with control group，Extract of Fungi of Huaier could inhibit the proliferation and induce the apoptosis of A2 cells，significantly （P <0.05）.Huaier could down-regulate the expression of Wnt-1 and Survivin protein. Conclusion ：Extract of Fungi of Huaier could suppress the proliferation and induce the apoptosis in human lung adenocarcinoma cell line A2. Its mechanisms may be through down-regulating the expression of Wnt-1 and Survivin.Keywords：A2 cell；Wnt-1 protein；Survivin protein；Extract of Fungi of Huaier 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，同时也是最主要的癌症致死原因之一。
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槐耳清膏体外诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡张光军，郑起，袁周，王志刚，黄新余(上海交通大学医学院附属第六人民医院，上海200233)摘要：［目的］研究槐耳清膏对人肝癌细胞MHCC97H凋亡的作用及其机制。
［方法］不同浓度槐耳清膏及5-Fu分别与人肝癌细胞MHCC97H共同培养，采用CCK-8法、FCM 及荧光显微镜检测细胞增殖与凋亡变化，细胞免疫组化检测Bax、Bcl-2及p53基因的表达。
［结果］槐耳清膏在体外可抑制MHCC97H细胞的增殖，诱导MHCC97H细胞产生早期凋亡，且作用具有剂量和时间依赖性。
荧光显微镜下细胞呈典型的早期凋亡形态学改变。
细胞免疫组化可见Bax及p53蛋白表达增强，而Bcl-2蛋白表达减少。
［结论］槐耳清膏能明显诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡，其机制可能与改变凋亡相关基因Bax、Bcl-2、p53的表达有关。
主题词：槐耳清膏；诱导；肝癌细胞；凋亡中图分类号：R735.7文献标识码：A文章编号：1671-170X（2010）04-0281-04 Trametes Robiniophila Murr Induced Apoptosis of Hepato-cellular Carcinoma Cell Line MHCC97HZHANG Guang-jun,ZHENG Qi,YUAN Zhou,et al.(Shanghai Sixth People’s Hospital,Shanghai School of Medicine,Jiaotong University,Shang-hai200233,China)Abstract:［Purpose］To investigate the effect and mechanism of Trametes robiniophila Murr induced apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H．［Methods］MHCC97H cells were incubated with different dose of Trametes robiniophila Murr or5-Fu．Cell growth and apoptosis were assessed by CCK-8,flow cytometr(FCM)and fluorescence microscopy．The change of Bax,Bcl-2and p53expression were detected by cell immunohisto-chemistry．［Results］The growth of MHCC97H cells was inhibited and the apoptosis was in-duced by Trametes robiniophila in vitro in a time/dose-dependent manner．Typical morpho-logical changes of early apoptosis could be observed by fluorescence microscopy．Cell im-munohistochemistry showed that the expression of Bax and p53was upregulated and expres-sion of Bcl-2was downregulated．［Conclusion］Trametes robiniophila Murr can markedly in-duce apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H.The mechanism might be related to the change of Bax,Bcl-2and p53expression．Subject words:Trametes robiniophila Murr;induce;hepatocellular carcinoma cells;apoptosis原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，疗效差，死亡率高。
绝大部分中晚期肝癌患者缺乏有效治疗措施。
对肝癌采取包括中药在内的综合治疗的疗效明显优于单一治疗。
槐耳是我国重要的药用抗肿瘤真菌，临床研究表明槐耳对原发性肝癌有独特的疗效，但具体机制尚未明确［1］。
本研究通过观察槐耳清膏体外对具有高转移潜能的人肝癌细胞株MHCC97H凋亡的作用，以探讨其对原发性肝癌的作用机制。
1材料与方法1.1细胞株具有高转移潜能的人肝癌细胞株MHCC97H （复旦大学肝癌研究所提供），传代培养于含10%胎牛血清的DMEN培养液中（37℃、5%CO2）；取对数生通讯作者：郑起收稿日期：2009-12-24；修回日期：2010-02-03Journal of Oncology ,2010,Vol.16,No.4表1各组MHCC97H 细胞吸光度值（A450）组别5-Fu槐耳清膏（mg/ml ）00.1151024h 48h 1.6468±0.1941*1.9142±0.1470△1.8468±0.20871.7982±0.13621.6853±0.1770*1.5326±0.0606*1.7672±0.0895*2.4646±0.1424△2.3128±0.2580△2.1728±0.2444*△2.0094±0.2582*1.7112±0.2200*72h 1.9488±0.1698*3.2378±0.1244△3.0382±0.0877△2.8452±0.1227△2.4527±1.3156*1.9388±0.1361**：与槐耳清膏0mg/ml 组比较，P ＜0.05；△：与5-Fu 组比较，P ＜0.05。
长期细胞用于实验。
1.2试剂与仪器槐耳清膏（江苏盖天力药业有限公司）溶于DMEN 培养液中，配成10mg/ml 、5mg/ml 、1mg/ml 、0.1mg/ml ，20μm 滤膜过滤除菌待用；DMEN 培养液（Gibco/Brl 公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；5-Fu （上海旭东海普药业有限公司）；CCK -8及Annexin V -FITC 细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物制品公司）；凋亡基因Bax 、Bcl -2、p53（上海泰中医疗设备有限公司）；VersaMax 连续波长酶标仪（美国分子仪器公司）；COULTER EPICS XL 流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；BX51TF 荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司）。
1.3实验分组A 组为10mg/ml 槐耳清膏，B 组为5mg/ml 槐耳清膏，C 组为1mg/ml 槐耳清膏，D 组为0.1mg/ml 槐耳清膏，E 组为10mg/L 5-Fu ，F 组为对照组DMEN 。
1.4CCK -8法观察槐耳清膏对MHCC97H 的生长抑制作用MHCC97H 细胞计数后制成1×108/L 细胞悬液，接种于96孔板，每孔加细胞悬液100μl ，培养过夜，按分组情况加入不同浓度的药物，每个浓度设5个复孔，每孔终体积200μl ，分别作用24、48、72h 后，每孔加入CCK -820μl ，继续培养4h 后于酶标仪上检测450nm 处吸光度值（A 值），计算细胞抑制率。
细胞抑制率=［1－（AX －A ）/(A0－A)］×100%，AX 为加药孔吸光度值，A 为空白组吸光度值，A0为对照组吸光度值。
CCK -8实验在不同时日重复3次。
1.5流式细胞仪检测MHCC97H 凋亡将1×105个细胞接种于6孔板中，培养24h 后，按分组情况加入药物，分别作用24、48、72h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集1×105~5×105细胞；加入500μl Binding Buffer 悬浮细胞；加入5μl Annexin V -FITC 混匀，加入5μl Propidium Iodide 混匀；室温、避光、反应5~15min 后上流式细胞仪进行检测。
实验重复3次。
1.6荧光显微镜观察MHCC97H 凋亡消毒好的盖玻片置于6孔板中，将1×105个细胞接种于6孔板，培养24h ；按分组情况加入药物作用48h ；PBS 洗2次；500μl Binding Buffer 中加入5μl Annexin V -FITC 和5μl Propidium Iodide ，混匀；将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖；将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察。
1.7细胞免疫组化检测凋亡基因Bax 、Bcl -2、p53表达盖玻片置于6孔板中，将1×105个细胞接种于6孔板，培养24h ；按分组情况加入药物，作用48h ；取出盖玻片，PBS 清洗后用4%的多聚甲醛固定30min ；0.3%Triton X -100孵育20min ；PBS 清洗后用3%H 2O 2室温孵育5~10min ；蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5min ；滴加1∶100稀释一抗50μl ，4℃冰箱过夜；PBS 冲洗后滴加生物素化二抗工作液IgG ，37℃孵育15min ；PBS 冲洗后DAB 显色，室温下控制10~15min ；PBS 冲洗后苏木素复染（检测p53此步省略），常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，50％明胶封片。
阴性对照用PBS 代替一抗。
1.8统计学处理各组数据用均数±标准差表示。
采用SPSS11.0软件行t 检验或方差分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1槐耳清膏对MHCC97H 的生长抑制作用CCK -8法结果显示（表1、图1）各组吸光度值均随时间的增加而增大，表明虽有槐耳清膏和5-Fu 的作用，细胞数仍在增加，但是随槐耳清膏浓度的增加，细胞的生长速度在降低。
槐耳清膏对MHCC97H 细胞的抑制作用与其剂量及作用时间呈正相关；高浓度槐耳清膏组（10mg/ml 和5mg/ml ）对MHCC97H 细胞的生长抑制作用明显高于未加任何药物的对照组（P ＜0.05），但与5-Fu 组比较无统计学差异，10mg/ml 和5mg/ml 浓度组72h 抑制率分别为42%和21%。
低浓度槐耳清膏组（1mg/ml 和0.1mg/ml ）对MHCC97H 细胞的抑制作用与对照组比较无统计学组别24h 48h 72h表2各组诱导MHCC97H 凋亡率（%）5-Fu槐耳清膏（mg/ml ）00.1151015.45±1.34△1.04±0.65*2.27±1.25△3.78±1.22△7.96±1.09*18.67±1.14*38.87±1.62△5.46±0.64*7.61±1.18△21.37±1.28*△31.93±1.76*42.20±2.09*51.68±2.27△8.95±1.07*24.18±1.42*△35.88±1.58*△36.37±1.47*△69.50±2.81*△*：与槐耳清膏0mg/ml 组比较，P ＜0.05；△：与5-Fu 组比较，P ＜0.05。