人肝癌细胞 hepG2贴壁培养
顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究
顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究细胞凋亡作为生物细胞对内外信号刺激的一种反应，在正常细胞的发育过程中精确调控细胞的死亡过程。
肿瘤的发生与正常的细胞凋亡过程被抑制，破坏了细胞增殖与凋亡之间的平衡有一定关系。
顺铂因其可抑制癌细胞的DNA复制过程，抑制癌细胞分裂，而被广泛应用于临床治疗肿瘤。
我们观察了顺铂对肝癌细胞株HepG2凋亡的诱导作用，从而探讨其作用机制。
1 材料与方法1.1、药品和试剂：RPMI-1640培养基（购自Gibco公司），胎牛血清（coring公司），顺铂（Gibco公司），Annexin-V/PI试剂（Invitrogen公司）。
倒置显微镜（尼康TS100F）流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。
1.2 方法1.2.1 细胞系及培养：人肝癌HepG2细胞株引自大连医科大学中心实验室。
用含10%胎牛牛血清、100 u/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液, 在37 ℃、5% CO2 条件下作常规悬浮培养，每2-3天换液传代培养。
1.2.2 细胞培养及药物处理：取对数生长期细胞，细胞用0.25%胰蛋白酶消化后,配成5×105/L的细胞悬液分别接种于24孔板中培养，24 h细胞贴壁后，弃上清。
实验组分别加入浓度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL的顺铂处理细胞，对照组不加药，另设空白对照组（只有培养基，无细胞），每组设置复孔，全湿条件下，37℃、5% CO2 培养箱中培养。
1.2.3 细胞形态学观察：取对数生长期细胞, 以每孔5×105个接种于6孔板中,24 h细胞贴壁后，弃上清。
分别加入不同浓度顺铂处理细胞，每6 h于倒置显微镜下观察活体细胞形态。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡：实验组，对照组和空白对照组细胞培养24h，48h后用0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗两次，调整细胞浓度至106/mL，取100μl细胞悬液，加入5μl Annexin－V/FITC 10μl及浓度为50μg/mL的PI液10μl，室温避光孵育15分钟后，加入PBS液400μl，用流式细胞仪进行流式细胞术定量检测。
CCK-8细胞数
CCK-8试剂参考实验数据细胞种类接种细胞数量培养板培养基名称培养基CCK-8 建议加入CCK-8 体积试剂量试剂后培养时间1 A549（人肺癌）贴壁2000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔3-4 hr.2 AGS 贴壁10000/孔96 F12 100μl/孔10μl/孔 2 hr.3 ASTC-a－1 贴壁50000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 3.5 hr.4 B16 贴壁1000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 4 hr.5 Balb/c 3T3 贴壁10000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 4 hr.6 Bcap-37（人乳腺癌）贴壁100000/孔96 RPMI1640 180μl/孔10μl/孔 3 hr.7 BEL-7404（人肝癌）贴壁5000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 2 hr.8 BGC-823(人低分化胃腺癌) 贴壁80000/孔96 DMEM 180μl/孔10μl/孔 3 hr.9 CTLL-2 悬浮16000/孔96 RPMI1640 200μl/孔10μl/孔 3 hr.10 EaHY926 贴壁5*104/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 2 hr.11 ECV304 贴壁20000/孔96 DMEM 150μl/孔10μl/孔 4 hr.12 HaCaT 贴壁10000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 4 hr.13 HAEC 贴壁10000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 4 hr.14 HEK-293 贴壁5000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 2 hr.15 HepG2（人肝细胞癌）贴壁1000/孔96 DMEM,10%FCS 100μl/孔10μl/孔 2 hr.16 Hela（人宫颈癌）贴壁2000-25000/孔96 MEM,10%FCS,L-glutamine 100μl/孔10μl/孔 2 hr.17 Ho-8910（人卵巢癌）贴壁80000/孔96 DMEM 180μl/孔10μl/孔 3 hr.18 HL60（人原髓细胞白血病）悬浮2000-25000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 3 hr.19 HLF 贴壁10000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔1hr.20 HS 766T(人胰腺癌细胞）贴壁10000/孔96 RPMI1640 200μl/孔10μl/孔 3 hr.21 Huh7 贴壁10000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 5 hr.22 HUVEC 贴壁2000/孔20 M199、RPMI1640 200μl/孔10μl/孔 4 hr.23 K562 悬浮40000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 6 hr.24 L1210（小鼠淋巴白血病）悬浮200000/孔96 RPMI1640 180μl/孔10μl/孔3.5 hr.25 L929 贴壁2×104个/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔4hr.26 MCF-7（人乳腺腺癌）贴壁10000/孔96 RPMI1640+10%小牛血清100μl/孔10μl/孔2-3 hr.27 MN9D 贴壁5000/孔96 DMEM/F12(1:1) 100μl/孔10μl/孔 4 hr.28 NRK（大鼠肾细胞）贴壁5000/孔96 DMEM+10%小牛血清L-glutamine 100μl/孔10μl/孔4hr.29 P815 悬浮10000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 3 hr.30 QBC939 贴壁5000/孔96 RPMI1640+10TBS 100μl/孔10μl/孔 4 hr31 Raji（人Burkitt's淋巴瘤）悬浮100000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 5 hr.32 RAW264.7(小鼠巨噬细胞) 贴壁20000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔2hr.33 SD大鼠脾淋巴细胞悬浮3×105~4 ×105/孔96 RPMI1640＋10％BSA 200μl/孔10μl/孔 4 hr.34 SGC-996 贴壁 1.5×105/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔2hr.35 SH-SY5Y 悬浮12000/孔96 DMEM 200μl/孔10μl/孔 3 hr.36 SK 贴壁8×104/孔24 DMEM 500μl/孔50μl/孔 3 hr.37 SMC 贴壁2×104个/孔96 DMEM 200μl/孔10μl/孔 4 hr.38 SMMC-7721（人肝癌）贴壁1000/孔96 DMEM,10%FCS 100μl/孔10μl/孔2 hr.39 SPC－A1(肺腺癌) 贴壁3000/孔96 RPMI1640 80μl/孔10μl/孔 3 hr.40 sw480 贴壁1000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 2 hr.41 T-24(人膀胱变移细胞癌) 贴壁80000/孔96 DMEM 180μl/孔10μl/孔 3 hr.42 Tca8113 贴壁1x107/孔96 RPMI1640 100μl/孔8μl/孔 4 hr.43 T淋巴细胞悬浮1*104—1*106个/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 2 hr.44 V ero E6 贴壁30000/孔96 RPMI1640(10%FBS) 100μl/孔10μl/孔 2 hr.45 Wish细胞（人羊膜细胞）贴壁30000/孔96 5% BCS MEM 100μl/孔10μl/孔 2 hr.46 786-0 贴壁8×104/孔24 RPMI1640 500μl/孔10μl/孔 4 hr.47 7901 贴壁15000-20000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 4 hr.48 成纤维细胞贴壁1500/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 3 hr.49 大鼠系膜细胞贴壁10000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔 2 hr.50 黑色素瘤B-16 贴壁5000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 2.5 hr.51 结肠癌Caco-2细胞贴壁10000/孔96 DMEM 200μl/孔10μl/孔 3 hr.52 乳鼠心肌细胞贴壁10000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔0.5-3hr.53 人成骨细胞贴壁5000/孔96 DMEM-LG成骨细胞诱导培养液100μl/孔10μl/孔 3 hr.54 人外周血淋巴细胞悬浮5×104/孔96 100μl/孔10μl/孔 4 hr.55 人支气管上皮细胞贴壁2000/孔96 LHC-8无血清培养基100μl/孔10μl/孔4 hr.56 神经母细胞瘤贴壁10000/孔96 MEM 100μl/孔10μl/孔 2 hr.57 肾小球系膜细胞贴壁1000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔1hr.58 树突状细胞悬浮106/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 4.5 hr.59 兔软骨细胞贴壁1000/孔96 DMEM 100μl/孔10μl/孔3-4 hr.60 小鼠B16黑色素瘤细胞贴壁2000/孔96 RPMI1640 150μl/孔10μl/孔 3 hr.61 小鼠脾脏T淋巴细胞悬浮 1.5×105 /孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 4 hr.62 牙周韧带细胞贴壁4000/孔96 DMEM 200μl/孔20μl/孔2hr.63 原代大鼠肝脏细胞贴壁30000/孔96 DMEM/F12 1：1 100μl/孔10μl/孔3-4 hr.64 原代胃癌细胞贴壁10000/孔96 RPMI1640 100μl/孔10μl/孔 4 hr.。
塞来昔布联合索拉非尼对人肝癌HepG2细胞迁移与侵袭能力的影响
临床医学研究与实践2021年3月第6卷第7期肝癌细胞侵袭与转移是肝癌患者预后差的重要原因，抑制肝癌细胞的侵袭与转移是肝癌防治的重要策略。
索拉非尼为当前肝癌治疗的一线药物，但高剂量下不良反应限制了其在临床上的应用，将索拉非尼与其他抗肿瘤药联合用药成为肿瘤防治的方向之一[1]。
文献报道，选择性环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）抑制剂塞来昔布可通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡等机制增强索拉非尼的抗肝癌作用[2-3]，塞来昔布能否增强索拉非尼对肝癌细胞侵袭与转移的抑制作用及相关机制尚不清楚。
本研究以人肝癌HepG2细胞为模型，评价塞来昔布与索拉非尼联用防治肝癌细胞侵袭与转移的效果，并探讨联合用药对E-钙粘蛋白（E-cadherin ）、COX-2、Notch1、Snail 等蛋白表达的影响，为索拉非尼治疗肝癌的用药方案提供理论基础。
1材料与方法1.1材料1.1.1细胞系。
人肝癌HepG2细胞购自江苏凯基生物技术股份有限公司。
1.1.2药品和试剂。
塞来昔布（s126106）、索拉非尼（s739702）购自selleck 公司；DMEM 培养基（11965-084）、胎牛血清（2017490C ）购自Gibco 公司；E-cadherin （GR3209210-7）、COX -2（GR222252-20）、Notch1（GR3236292-1）、Snail （GR3245013-1）均购自abcam 公司；Matrigel （354248）胶购自Corning 公司；四甲基偶氮唑盐（MTT,KGA311）、青霉素/链霉素溶液（KGY002）、0.25%胰酶（含EDTA ，KGY001）、DOI :10.19347/ki.2096-1413.202107002基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（No.2018WS182）。
作者简介：苗久旺（1979-），男，汉族，河南商丘人，副教授，博士。
人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗和逆转模型中FoxO1 mRNA和蛋白表达水平及其意义
人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗和逆转模型中FoxO1mRNA和蛋白表达水平及其意义孙静;魏虎来【摘要】目的:探讨人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗(IR)模型(HepG2/IR)和逆转模型(HepG2/IR-PH)中叉头状转录因子O1(FoxO1)的mRNA和蛋白表达水平,阐明该基因参与IR的作用机制.方法:选择人源肝癌HepG2细胞 ,采用终浓度1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol·L-1胰岛素诱导24、48和72 h,对照组细胞不加胰岛素,用葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖水平,计算各组细胞的葡萄糖消耗量,以确定IR模型建立的最佳诱导条件;采用终浓度为0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000 mmol·L-1盐酸吡咯列酮(PH)诱导HepG2建立逆转抵抗模型,同时设立对照组,MTT法检测细胞增殖活性,确定PH的最佳逆转浓度;利用Real-time PCR法和Western blotting法检测各组细胞FoxO1 mRNA和蛋白表达水平.结果:1×10-7 m ol·L-1胰岛素作用36 h,葡萄糖消耗量减少45.84%,发生明显的IR,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).与对照组比较,1.25 mmol·L-1PH逆转抵抗24 h,细胞增殖活性无明显变化(P>0.05).人源肝癌HepG2细胞发生IR时,与对照组比较,FoxO1 mRNA和蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01);IR模型逆转后,与对照组比较,FoxO1 mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05).JP2结论:人源肝癌HepG2细胞IR与FoxO1 mRNA的表达有关联性,FoxO1 mRNA表达水平检测有可能作为胰岛素增敏剂的药效评估指标,降低FoxO1 mRNA表达水平可作为2型糖尿病治疗的新靶点.%Objective: To study the expression levels of forkhead transcription factor(FoxO1) mRNA and protein in the insulin resistance (IR) HepG2 cells model (HepG2/IR) and IR reversal HepG2 cells model (HepG2/IR-PH), andto explore its mechanism in IR.Methods:The HepG2/IR was induced with different doses of insulin (1×10-10, 1×10-9, 1×10-8, 1×10-7, 1×10-6 and 1×10-5 mol·L-1) for different time(24, 36 and 48 h)in the HepG2 cells.The cells in control group were not treated with insulin.The glucose levels in supernant were determined by glucose oxidase method, and the glucose consumption in HepG2 in various groups were calculated to confirm the optimum induction conditions of HepG2/IR.The HepG2/IR-PH was induced with different doses of pioglitazone hydrochloride (PH) (0.156, 0.313, 0.625, 1.250, 2.500, 5.000, 10.000 and 20.000 mmol·L-1) in the HepG2 cells, and control group was set up at the same time. The proliferation activities of cells were observed by MTT assay to confirm the optimum reversal concentration of PH.The FoxO1 mRNA and protein expression levels were detected by Real-time PCR and Western blotting methods.Results: The glucose consumption decreased by 45.84% in HepG2/IR after treated with 1×10-7 mol·L-1 insulin for 36 h, and there was significant difference compared with control group(P<0.05), the proliferation activity of cells had no change in the HepG2/IR-PH after treated with 1.25 mmol·L-1 PH for 24 h(P>0.05).Compared with control group, the expression levels of FoxO1 mRNA and protein in HepG2/IR were significantlyincreased(P<0.01);compared with control group, the expression levels of FoxO1 mRNA and protein in HepG2/IR-PH had no significant differences(P>0.05).Conclusion:The IR of HepG2/IR is associated with the FoxO1 mRNA expression.The detection of FoxO1 mRNA seems to be an indicator to evaluate the efficacy of insulin sensitizer, and inhibiting theexpression of FoxO1 mRNA may be developed as a potential therapy for type 2 diabetes.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(043)004【总页数】6页(P709-714)【关键词】人源肝癌HepG2细胞;胰岛素抵抗;胰岛素抵抗逆转;叉头状转录因子O1基因【作者】孙静;魏虎来【作者单位】兰州大学第二医院内分泌代谢科,甘肃兰州730000;兰州大学基础医学院医学实验中心,甘肃兰州730000【正文语种】中文【中图分类】R587.1胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是指机体、器官、组织或细胞对胰岛素的敏感性和反应性降低，糖代谢紊乱的慢性病理过程，是引发2型糖尿病的主要原因之一[1]。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
白芨水提物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响
白芨水提物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响令狐浪;李成龙;姚晓东【摘要】目的:研究白芨水提物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响.方法:使用水提醇沉法提取白芨粗多糖,同时保留有机小分子物质部分;采用CCK8试剂检测不同浓度的两部分提取物对HepG2细胞存活率及生长曲线的影响;倒置显微镜观察提取物对HepG2细胞形态的影响,以及soft agar法检测提取物对HepG2细胞克隆形成的影响.结果:与对照组相比,白芨水提物均能降低HepG2细胞的存活率和增殖能力,并与浓度呈正相关,其中多糖和有机小分子物质的半数抑制浓度(IC50)分别为65.99μg/mL和52.62μg/mL;此外,白芨水提物作用后改变了细胞形态,并能抑制HepG2细胞的克隆形成能力.结论:白芨水提物中的多糖和有机小分子物质均能抑制HepG2细胞的增殖作用.【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2018(027)023【总页数】4页(P29-32)【关键词】白芨;水提物;HepG2细胞;细胞增殖【作者】令狐浪;李成龙;姚晓东【作者单位】遵义医学院药学院, 贵州遵义 563006;遵义医学院药学院, 贵州遵义563006;遵义医学院药学院, 贵州遵义 563006【正文语种】中文【中图分类】R963白芨是一种珍稀名贵中药材，为兰科植物白芨(Bletilla striata)的干燥块茎，其味苦、甘、涩，归肝、肺、胃经，具有收敛止血、消肿生肌等功效[1]，野生品主产于贵州、四川和湖南等地，已被列为国家濒危珍稀植物保护名录[2]。
药理学研究表明，白芨具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和促进伤口愈合等作用[3]。
近年来，白芨在抗肿瘤方面时有报道[4-6]，其主要活性成分为大量含有的多糖类物质。
白芨中的主要化学成分有多糖类、菲类、联菲类、联苄类、甾体和三萜类等物质。
菲类化合物是目前报道从白芨块茎中分离得到的较多的一类化学成分，该类化合物芳环上的取代基主要有羟基、甲氧基和对羟苄基，是白芨中的主要活性成分，联菲类化合物主要有白芨联菲A、B、C和白芨联菲醇A、B、C[7-9]。
Hep-2细胞的传代培养
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一 细胞“一代”
段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中， 段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中， 细胞倍增3～ 次 细胞倍增 ～6次。
二、材料和试剂
1、细胞： Hep-2 细胞 、细胞： 2、试剂： PBS、VTP、DMEM营养液（含10％ 、试剂： 营养液（ 、 、 营养液 ％ 小牛血清） 小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜、CO2培养箱、培 、仪器和器材：倒置显微镜、 培养箱、 养瓶、吸管、 养瓶、吸管、废液缸等
细胞培养技术（实验篇）
安徽医科大学微生物学教研室
2007年12月3日 合肥
实验四 Hep-成单层汇合以后，由于细胞密度过大, 体外培养的细胞形成单层汇合以后，由于细胞密度过大, 生存空间不足而引起营养枯竭，将影响细胞的继续生长， 生存空间不足而引起营养枯竭，将影响细胞的继续生长， 此时需将培养的细胞分散，从容器中取出， 1:2或 此时需将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培 以上的比率转移到另外的容器中进行培养， 养。 传代培养可获得大量的同种细胞，并维持细胞种的延续, 传代培养可获得大量的同种细胞，并维持细胞种的延续, 同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
四、结果
置于37℃培养的细胞， 置于37℃培养的细胞，次日开始需逐日进行观 37℃培养的细胞 察，主要观察： 主要观察：
（1）培养物是否被污染 （2）细胞生长状况 （3）如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征 如细胞已生长，
Hep-2细胞
×100
五、注意事项
严格的无菌操作 适度消化 每天观察细胞形态，生长致密时即可传代。 每天观察细胞形态，生长致密时即可传代。 如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施。 如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施。
NU7026对人肝癌细胞HepG2生物学行为的影响
[收稿日期]㊀2020-11-27[修回日期]㊀2021-02-11[基金项目]㊀湖南省教育厅科学研究重点项目(19A429)[作者简介]㊀李娟,硕士研究生,研究方向为放射医学,E-mail 为lijuan9508@㊂通信作者黄波,博士,硕士研究生导师,副教授,研究方向为放射医学,E-mail 为huangbo0930@㊂㊃基础医学㊃DOI :10.15972/ki.43-1509/r.2021.03.011NU7026对人肝癌细胞HepG2生物学行为的影响李娟,颜宇龙,万丹婷,李蕊,周美艳,周洁,黄波(南华大学公共卫生学院,湖南省衡阳市421001)[关键词]㊀NU7026;㊀肝癌;㊀HepG2细胞;㊀增殖;㊀迁移[摘㊀要]㊀目的㊀探讨NU7026对HepG2细胞的影响,为治疗肝癌提供理论基础㊂方法㊀用NU7026作用HepG2细胞,将实验分为空白组㊁对照组和NU7026组㊂CCK8实验检测NU7026对肝癌HepG2细胞存活率的影响㊂生长曲线实验和克隆实验检测HepG2细胞增殖能力,划痕实验检测HepG2细胞迁移能力,流式细胞术检测HepG2细胞凋亡和周期㊂结果㊀与0μmol /L 组和DMSO 组比较,15μmol /L 和20μmol /L NU7026作用于HepG2细胞,细胞存活率明显下降(P <0.05);与DMSO 组相比,10μmol /L NU7026作用于HepG2细胞24㊁48㊁72h 后,细胞存活率下降(P <0.05);10μmol /L NU7026作用HepG2细胞,细胞增殖能力和迁移能力下降(P <0.05),细胞凋亡率增加(P <0.05),细胞周期无明显改变㊂结论㊀NU7026能抑制HepG2细胞增殖能力和迁移能力可能与促进细胞凋亡有关㊂[中图分类号]㊀R735.7[文献标识码]㊀AEffect of NU 7026on the biological behavior of human hepatocarcinoma cell HepG 2LI Juan,YAN Yulong,WAN Danting,LI Rui,ZHOU Meiyan,ZHOU Jie,HUANG Bo (School of Public Health ,University of South China ,Hengyang ,Hunan 421001,China )[KEY WORDS ]㊀NU7026;㊀liver cancer;㊀HepG2cell;㊀proliferation;㊀migration [ABSTRACT ]㊀㊀Aim ㊀To explore the effect of NU7026on HepG2cells,and provide a theoretical basis for the treat-ment of liver cancer.㊀㊀Methods ㊀HepG2cells were treated with NU7026,and the experiment was divided into the blank group,the control group and the NU7026group.㊀The CCK8assay was used to detect the effect of NU7026on the survival rate of HepG2cells.㊀The growth curve assay and clone formation assay were used to detect the proliferation ability of HepG2cells,and the scratch assay was used to detect the migration ability of HepG2cells.㊀Finally the cellular apopto-sis and cell cycle were tested by flow cytometry.㊀㊀Results ㊀Compared with the 0μmol /L group and the DMSO group,after 15μmol /L and 20μmol /L NU7026treated on HepG2cells,the cell survival rate was significantly decreased (P <0.05);Compared with the DMSO group,after treating HepG2cells with 10μmol /L NU7026for 24,48,and 72hours,the cell survival rate was significantly decreased (P <0.05);After 10μmol /L NU7026treated HepG2cells,the cell prolif-eration and migration ability decreased (P <0.05),the apoptosis rate was significantly increased (P <0.05),but the cell cycle did not change significantly.㊀㊀Conclusion ㊀NU7026can inhibit the proliferation and migration of HepG2cells,which may be related to the promotion of cell apoptosis.㊀㊀肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,2015年中国肝癌发病人数为37.0万人,发病率为26.92/10万,死亡人数32.6万,死亡率23.72/10万[1]㊂原发性肝癌发病隐匿,病程短,发展迅速,当前主要治疗手段有手术切除㊁放射治疗㊁药物治疗㊁肝移植等㊂但肝癌易复发㊁易转移,预后差,且对放化疗具有抵抗性,寻求治疗肝癌的药物具有重要意义㊂原发性肝癌中最常见的肝癌组织类型是肝细胞癌[2]㊂本文探讨了NU7026抑制DNA-PKcs 对肝癌细胞的增殖㊁迁移能力的影响,为治疗肝癌提供理论依据㊂1㊀材料和方法1.1㊀材料㊀㊀肝癌细胞(HepG2)由军事科学医学院周平坤研究员惠赠㊂HepG2细胞在含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM培养基(Gibco),37ħ㊁5%CO2培养箱中培养㊂NU7026(LY293646,C17H15NO3)购于MCE公司,纯度为99.95%㊂细胞凋亡试剂盒㊁细胞周期试剂盒购于南京凯基公司㊂1.2㊀CCK8实验取处于指数生长期的HepG2细胞,用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液接种于96孔板中,加入适量的细胞悬液(约7000~8000个/孔),待细胞贴壁后,分别用5㊁10㊁15㊁20μmol/L NU7026进行处理,设3个复孔,继续培养24㊁48㊁72h,每孔加入10μL CCK8溶液,孵育1h,用酶联免疫检测仪测定450nm波长处的光密度值(OD),计算细胞存活率㊂细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白孔OD值)/(空白组OD值-空白孔OD值)ˑ100%㊂1.3㊀生长曲线实验按2ˑ104个/孔细胞接种于6孔细胞培养板, 10μmol/L NU7026处理细胞每组设3个复孔,每隔24h计数1次,连续计数3天,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标绘制生长曲线图㊂1.4㊀克隆实验将细胞接种于6cm细胞培养皿,10μmol/L NU7026处理细胞,10天后弃掉培养基,PBS洗2遍,加入固定液3mL,固定30min;再加入3mL Gi-emsa染色30min,最后用流水缓慢冲洗,晾干㊂计数含50个细胞以上的克隆数,克隆形成率(%)=克隆数/[实验组接种细胞数ˑ(对照组克隆数/对照组接种细胞数)]ˑ100%㊂1.5㊀划痕实验将细胞接种在6孔细胞培养板中,细胞贴壁后用200μL无菌的枪头尖端在每孔相同位置做线性划痕,再用PBS轻轻冲洗2~3遍,10μmol/L NU7026处理细胞,分别在0㊁24㊁48㊁72h后于显微镜下拍照观察划痕,采用Image J软件观察计算细胞划痕面积,面积愈合率(%)=(0h划痕面积-培养后划痕面积)/0h划痕面积ˑ100%㊂1.6㊀细胞凋亡与细胞周期试验将细胞接种于6孔细胞培养板,10μmol/L NU7026处理细胞,按照说明书步骤进行,1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况㊂取适量HepG2细胞接种于6cm细胞培养皿中,用10μmol/LNU7026处理0㊁4㊁8㊁12㊁24h后收样㊂按照说明书步骤进行,用流式细胞仪检测细胞周期㊂1.7㊀统计学分析采用SPSS18.0进行统计分析,数据以xʃs表示,多组间用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性㊂2㊀结㊀果2.1㊀不同浓度NU7026对HepG2细胞活性的影响随着NU7026浓度的增加,HepG2细胞存活率下降㊂与0μmol/L组和DMSO组比较,15μmol/L 和20μmol/L NU7026作用HepG2细胞后,细胞存活率下降(P<0.05;图1);10μmol/L NU7026作用HepG2细胞24㊁48㊁72h后,与DMSO组细胞存活率比较,差异有显著性(P<0.05),与0μmol/L 组细胞存活率比较,差异无显著性(P>0.05);查阅文献[3]及根据前期研究[4],本研究中10μmol/L NU7026对HepG2细胞没有明显的毒性作用,故选择10μmol/L NU7026进行后续实验㊂将实验分为空白组㊁对照组(0.1%DMSO)和NU7026组(10μmol/L NU7026)㊂图1㊀CCK8检测不同浓度NU7026对HepG2细胞活性的影响a为P<0.05,与0μmol/L组比较;b为P<0.05,与DMSO组比较㊂2.2㊀各组HepG2细胞增殖能力比较NU7026作用HepG2细胞72h后,NU7026组细胞数明显低于对照组(P<0.05;图2);NU7026组细胞克隆数少于对照组,克隆形成率明显降低(P< 0.05;图2)㊂图2㊀各组HepG2细胞增殖能力的比较A 为培养10天后克隆实验细胞分布图(Giemsa 染色)和柱状图;B 为细胞生长曲线图㊂a 为P <0.05,与空白组比较;b 为P <0.05,与对照组比较㊂2.3㊀各组HepG2细胞迁移能力NU7026作用细胞24h 后,与对照组相比,面积愈合率无明显差异(P >0.05);NU7026作用细胞48h后,划痕面积比对照组稍大,面积愈合率无明显差异(P >0.05);但在作用72h 后,NU7026组划痕面积大于对照组,面积愈合率明显降低(P <0.05;图3)㊂图3㊀各组HepG2细胞迁移能力比较A 为细胞划痕实验迁移(200ˑ);B 为细胞划痕愈合率折线图㊂a 为P <0.05,与空白组比较;b 为P <0.05,与对照组比较㊂2.4㊀各组HepG2细胞的凋亡与周期NU7026作用HepG2细胞24㊁48㊁72h 后,细胞凋亡率增加(P <0.05;图4)㊂随着NU7026作用时间增加,HepG2细胞凋亡率逐渐增加㊂NU7026作用HepG2细胞12h 后,出现了轻微的G2/M 阻滞现象,但细胞周期未出现明显改变(图5)㊂3㊀讨㊀论肝癌在全球恶性肿瘤发病谱中排第六,其中中国肝癌新发病例数将近占全球发病的一半[5]㊂DNA-PKcs 是一种相对分子质量约为470kDa 的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与共济失调毛细血管扩张症基因(Ataxia telangiectasia mutated,ATM)㊁RAD3相关蛋白(Ataxia telangiectasiaand Rad3-related protein,ATR)同属于磷酸酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶(PIKK)家族㊂DNA-PKcs 和ATM 在DNA 双链断裂修复中起着重要的作用,ATR 主要参与DNA 单链断裂修复㊂DNA-PKcs 不仅参与淋巴细胞的V(D)J 重组和类别转换重组,保护染色体末端,而且DNA-PKcs 响应胰岛素信号传导,促进肝脏中碳水化合物转化为脂肪酸[6-7]㊂DNA-PKcs 抑制剂有渥曼青霉素㊁NU7441㊁NU7026㊁IC 化合物等㊂NU7026对DNA-PKcs 抑制性特异度高,能有效抑制DNA-PKcs Ser2056磷酸化[4]㊂本研究通过生长曲线实验和克隆实验检测图4㊀各组HepG2细胞凋亡比较A 为细胞凋亡图;B 为细胞凋亡率柱状图㊂a 为P <0.05,与空白组比较;b 为P <0.05,与对照组比较㊂图5㊀各组HepG2细胞周期的比较A 为流式细胞术检测细胞周期图;B 为细胞周期占比图㊂细胞增殖能力,表明NU7026抑制DNA-PKcs 将降低HepG2细胞增殖能力,与其他研究结果相一致㊂用siRNA 介导肝癌HepG2细胞中DNA-PKcs 沉默,细胞增殖速度减慢,且高表达DNA-PKcs 可通过AKT /GSK3/c-myc 信号通路调节肝癌细胞增殖[8]㊂同样用siDNA-PKcs 转染肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu 后,细胞增殖能力降低,可能抑制DNA-PKcs 后胸腺嘧啶合成酶(TS)表达下降,从而抑制DNA 合成,细胞增殖生长变慢[9]㊂但也有研究表明NU7441抑制DNA-PKcs 促进肺成纤维细胞中SSEA4+间充质祖细胞增殖[10]㊂沉默DNA-PKcs 不仅抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖,而且也抑制细胞迁移和侵袭[11]㊂本文结果显示抑制DNA-PKcs 能降低HepG2细胞迁移能力㊂有研究表明将沉默DNA-PKcs 的HepG2细胞移植到裸鼠中,其肿瘤生成率明显降低[8]㊂DNA-PKcs通过RhoA/ROCk2通路调节基质金属蛋白酶-2和磷酸化肌球蛋白轻链2表达,促进体内外骨肉瘤细胞迁移和侵袭[12]㊂也有研究发现ITGA5和SDC4基因与DNA-PKcs可能对细胞迁移侵袭运动具有互相调节作用[13]㊂本研究用NU7026抑制DNA-PKcs24㊁48㊁72h, HepG2细胞凋亡增加,与其他研究结果一致㊂有研究表明沉默DNA-PKcs后,通过线粒体凋亡途径促进肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu凋亡[14]㊂也有研究表明沉默DNA-PKcs后,有丝分裂细胞纺锤体异常,胞质分裂失败,有丝分裂延长等,最终导致细胞有丝分裂灾变而凋亡[15]㊂用TDR将HeLa细胞同步化至G1期后释放,沉默DNA-PKcs的HeLa细胞在6h出现明显的G2/M期阻滞,表明抑制DNA-PKcs会引起G2/M期阻滞[16]㊂用nocodazole同步化细胞后释放,抑制HeLa细胞DNA-PKcs,H3-pS10阳性细胞增加,表明细胞阻滞在有丝分裂期[17]㊂也有研究表明沉默MG-63细胞DNA-PKcs48h,细胞周期无明显改变[11]㊂在本研究中NU7026抑制DNA-PKcs对HepG2细胞周期无明显改变,可能是因为细胞DNA 损伤不严重,DNA修复时间较短,细胞能较快地通过周期检查点,故未出现明显G2/M期阻滞㊂综上所述,NU7026能抑制HepG2细胞增殖能力和迁移能力,其机制可能与促进细胞凋亡有关㊂[参考文献][1]郑荣寿,孙可欣,张思维,等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2019,41(1):19-28.[2]龙晓兰,张万勇,吴勇军,等.Cofilin-1与肝癌细胞迁移侵袭能力的相关性研究[J].中南医学科学杂志, 2019,47(6):571-575.[3]AMREIN L,LOIGNON M,GOULET A C,et al.Chloram-bucil cytotoxicity in malignant B lymphocytes is synergisti-cally increased by2-(morpholin-4-yl)-benzo[h]chomen-4-one(NU7026)-mediated inhibition of DNA double-strand break repair via inhibition of DNA-dependent protein kinase [J].J Pharmacol Exp Ther,2007,321(3):848-855.[4]黄波,龙颖,唐艳,等.NU7026对肝癌细胞放射增敏作用及机制研究[J].辐射研究与辐射工艺学报,2013, 31(6):11-15.[5]安澜,曾红梅,郑荣寿,等.2015年中国肝癌流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2019,41(10):721-727.[6]SOULAS-SPRAUEL P,RIVERA-MUNOZ P,MALIVERT L,et al.V(D)J and immunoglobulin class switch recom-binations:a paradigm to study the regulation of DNA end-joining[J].Oncogene,2007,26(56):7780-7791. [7]CHUNG J H.The role of DNA-PK in aging and energy me-tabolism[J].FEBS J,2018,285(11):1959-1972.[8]黄越承,周平坤,蔡建明,等.肝癌及不同发育阶段小鼠肝组织中DNA-PKcs的表达及其对细胞增殖作用的研究[J].第二军医大学学报,2009,30(11): 1217-1220.[9]李大玉,余春波,束波,等.DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu增殖及机制的研究[J].贵州医药, 2016,40(2):131-134.[10]HABIEL D M,HOHMANN M S,ESPINDOLA M S,et al.DNA-PKcs modulates progenitor cell proliferation and fi-broblast senescence in idiopathic pulmonary fibrosis[J].BMC Pulm Med,2019,19(1):165.[11]JIN P Y,LU H J,TANG Y,et al.The effect of DNA-PKcs gene silencing on proliferation,migration,invasion and apoptosis,and in vivo tumorigenicity of human osteo-sarcoma MG-63cells[J].Biomed Pharmacother,2017, 96:1324-1334.[12]李卡.DNA-PKcs对CD133阳性骨肉瘤细胞顺铂耐药性和骨肉瘤转移的作用及机制研究[D].济南:山东大学,2017:1-190.[13]宋志全.电离辐射对DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs及其结合RNA作用的研究[D].北京:北京市军事科学院,2019:1-72.[14]余春波,李大玉,范芳,等.线粒体凋亡途径在DNA-PKcs抑制肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu凋亡中的作用研究[J].遵义医学院学报,2019,42(3):260-264.[15]SHANG Z F,HUANG B,XU Q Z,et al.Inactivation ofDNA-dependent protein kinase leads to spindle disruption and mitotic catastrophe with attenuated checkpoint protein 2phosphorylation in response to DNA damage[J].Cancer Res,2010,70(9):3657-3666. [16]AN J,HUANG Y C,XU Q Z,et al.DNA-PKcs plays adominant role in the regulation of H2AX phosphorylation in response to DNA damage and cell cycle progression [J].BMC Mol Biol,2010,11:18.[17]HUANG B,SHANG Z F,LI B,et al.DNA-PKcs associ-ates with PLK1and is involved in proper chromosome seg-regation and cytokinesis[J].J Cell Biochem,2014,115(6):1077-1088.(此文编辑㊀蒋湘莲)。
扶正抑瘤方干预肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的实验研究
主 动脉 取血 ，０ ０ｒｍ 离 心 １ ｎ 分 离 血清 ，． ３０ ｐ ５ｍｉ ， ０２ ２
ａ 抽 滤除 菌 ，６ ｍ ５ ℃灭活 ３ ｉ ，２ ｑ保存 备用 。 ０ｍ ｎ 一 ０Ｃ １４２ 人 肝 癌 细 胞 株 Ｈ ｐ ２的培 养 及 含 药 血 清 ．． ｅＧ 的干 预 方 法 采 用 含 有 １ ｏｍＬ Ｌ胎 牛 血 清 ， × ｏ ／ ｌ
ｍ 的 Ｍ ｒ２ Ｌ 继 续 培养 ４ｈ 弃上 清 ， 入 ｌ ｏ Ｌ Ｔ ０ ， ， 加 ｏ
福 建 中 医 学 院 学 报 ２ １ 年 ８月 第 ２ 卷 ００ Ｏ
第 ４ 期
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＦ ｊ ｎ Ｕｎｖ ｒ ｔ ｆ ｏ ｒ ａ ｏ ｕｉ ｉｅｓ ｙ ｏ ａ ｉ ＴＣＭ ｇ ｓ ２ １ ， ０ ４ Ａｕ ｕ ｔ ０ ０ ２ （ ）
・
实验研 究 ・
扶 正 抑瘤 方 干预 肝 癌 细胞 株 Ｈ ｐ ｅ Ｇ２增 殖 和凋 亡 的实 验研 究
值 明 显 降 低 （ ＜０ ０ ） Ｓ期 细胞 含 量 明显 减 少 （ ＜０Ｏ ） Ａ ｎ ｘｎ Ｖ＋Ｐ 一 Ｐ ．５ ， Ｐ ．１ ， ｎ ｅ ｉ ／ Ｉ 区域 和 Ａ ｎ ｘ ／ Ｉ ｎ ｅ ｉ Ｖ Ｐ 区 ｎ
域 细胞 含 量 不 同程 度 增 多 （ ＜Ｏ０ Ｐ ．５或 Ｐ ．１ ， ＜００ ） 以高 剂 量 舍 药 血 清 组 作 用 最 为 明 显 。
抑 瘤 方含 药 血 清 通 过 干 扰 肝 癌 细胞 株 ＨｅＧ２Ｓ 的合 成 有 效 抑 制 肝 癌 细胞 的 生 长 ， ｐ 期 同时 诱 导 肝 癌 细 胞 株 ＨｅＧ ｐ ２的早 期 和 晚期 凋 亡 ， 除 增 殖过 度 的肝 癌 细 胞 。 清
二十二碳六烯酸联合5氟尿嘧啶对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用
二十二碳六烯酸联合5氟尿嘧啶对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用李群珍;邓红;张茂祥;庄树彤;伍茵;何劲松;蓝伟红【摘要】目的研究DHA联合5-FU对肝癌细胞在抑制细胞增殖、诱导凋亡的影响。
方法用Annexin-V-PE/PI荧光双标记法、Hoechst33258染色及JC-1线粒体膜电位检测法检测DHA、5-FU两药单用和联用对肝癌细胞HepG2增殖的影响。
结果联合处理组细胞凋亡率较单独使用5-FU组或单独使用DHA均明显增加。
Hoechst33258染色显示，5-FU联合DHA组细胞中出现明显的凋亡核表现，细胞凋亡率较单独采用5-FU及对照组细胞显著增高。
JC-1线粒体膜电位检测结果显示，联合组细胞线粒体膜电位较单独使用5-FU组显著降低。
结论 DHA联合5-FU对肝癌细胞的增殖抑制、诱导凋亡具有协同作用。
【期刊名称】《现代消化及介入诊疗》【年(卷),期】2013(000)004【总页数】3页(P243-245)【关键词】二十二碳六烯酸;5-氟尿嘧啶;肝癌;凋亡【作者】李群珍;邓红;张茂祥;庄树彤;伍茵;何劲松;蓝伟红【作者单位】518035 广东省深圳市第二人民医院;510515 南方医科大学公共卫生与热带医学院营养与卫生学系;518035 广东省深圳市第二人民医院;518035 广东省深圳市第二人民医院;518035 广东省深圳市第二人民医院;518035 广东省深圳市第二人民医院;518035 广东省深圳市第二人民医院【正文语种】中文二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）是人体必需脂肪酸，主要从深海鱼油中获得[1]。
近年来多项流行病学及基础研究发现，DHA不仅对多种恶性肿瘤具有抑制作用，而且还能增强化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的疗效[2]。
本研究以肝癌细胞株HepG2为主要对象，通过形态学方法比较DHA、5-FU两药单用和联用对肝癌细胞HepG2增殖的影响。
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北京索莱宝科技有限公司
人肝癌细胞hepG2贴壁培养
细胞名称：人肝癌细胞；hepG2
形态特性：上皮样
生长特性：贴壁生长
培养条件：MEM-NEAA，20%FBS
冻存条件：细胞冻存液
特征特性：该细胞系来自15岁男性白人的组织。
形态为上皮形，模式染色体数为55，在免疫抑制小鼠中不致瘤。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
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