HuH-7 人肝癌细胞
GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的研究的开题报告
GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的
研究的开题报告
标题：GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的研究
背景介绍：Glypican-3（GPC3）是一种Glypican家族的膜结合型糖蛋白，在人类肝癌组织及10个肝癌细胞株中高度表达，目前认为是一种肝癌特异性抗原。
GPC3在肝癌的发生和发展中发挥着重要的作用，包括在肝癌细胞增殖、侵袭和氧化应激中的调节作用。
因此，GPC3成为肝癌诊断和治疗的一个重要靶点。
本研究旨在探讨GPC3在肝癌Huh-7细胞中的生物学功能和作用机制。
研究方法：本研究将采用基因转染技术过表达GPC3基因，以正常Huh-7细胞为对照组，通过Western blot和RT-PCR检测GPC3的表达水平。
利用MTT法和Clone Formation实验检测GPC3对Huh-7细胞增殖和生长的影响。
采用Transwell实验探讨GPC3对Huh-7细胞侵袭和迁移的影响。
并利用流式细胞术检测GPC3对Huh-7细胞氧化应激的调节作用。
预期结果：经过GPC3过表达、实验后，预计可以显著提高Huh-7细胞的增殖和生长能力；增强Huh-7细胞的侵袭和迁移能力，并且能抑制氧化应激反应。
这些结果将有助于深入研究GPC3在肝癌细胞中的作用机制，为肝癌的治疗提供新的思路和靶点。
塞来昔布对人肝癌细胞增殖抑制及放疗增敏作用
塞来昔布对人肝癌细胞增殖抑制及放疗增敏作用王中焕;楚建军;张福正;沈玲;杨雪【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2012(27)1【摘要】Objective To investigate the function of celecoxib on human hepatocellular carcinoma cell huh-7 proliferation inhibition and radiotherapy sensitization. Methods In human liver carcinoma cell line huh-7 as the research object, using celecoxib and high-energy ray as a means of intervention, the function of celecoxib on cell proliferation inhibition was observed in different concentration and action time by MTT,and the apoptosis and cell cycle effect of celecoxib combined with radiotherapy on hepatoma cells were evaluated by using flow cytometric technique. Results ComPared with control group, the absorption value decreased significantly with the increase of celecoxib concentration and exposure time. Celecoxib on liver cancer radiotherapy sen-sitization effect is obvious. Compared with the control group,drug group increased the proportion of G0/Gj phase cells,reduced the proportion of S phase cells,G2/M had no obvious meaning; G2/M phase cells increased in the radiotherapy group; the combination group increased the proportion of Go/G1 phase cells, S phase cells reduced, Cell proliferation was inhibited. Conclusion Celecoxib can improve the human hepatoma cell line huh-7 sensitivity to the role of radiotherapy, its role may be through theinduction of apoptosis, cell cycle phase distribution changes to achieve.%目的探讨塞来昔布对肝癌细胞huh-7增殖抑制及放疗增敏作用.方法以人肝癌细胞株huh-7为研究对象,以塞来昔布和高能射线作为干预手段,采用四唑氮蓝还原法(MTT),检测不同浓度塞来昔布和作用不同时间对huh-7细胞的增殖抑制作用,采用流式细胞技术,检测塞来昔布联合放疗对huh-7细胞凋亡和周期的影响.结果 MTT 显示塞来昔布对人肝癌细胞huh-7生长有显著抑制作用,且呈时间和剂量依赖性;塞来昔布对肝癌放疗具有明显增敏作用.与对照组比较,药物组G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,G2/M变化无明显意义;照射组G2/M期细胞比例升高,联合组G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少.结论塞来昔布能提高人肝癌细胞株huh-7放疗敏感性作用,其作用可能是通过诱导细胞凋亡、改变细胞周期时相分布来实现的.【总页数】3页(P15-17)【作者】王中焕;楚建军;张福正;沈玲;杨雪【作者单位】214000,徐州医学院;214000,苏州大学第四临床医学院肿瘤科;214000,苏州大学第四临床医学院肿瘤科;214000,苏州大学第四临床医学院肿瘤科;214000,苏州大学第四临床医学院肿瘤科【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】1.黄芩苷对人肝癌细胞增殖抑制及放疗增敏作用 [J], 邹航;2.雷公藤内酯醇对人肺癌细胞增殖抑制及放疗增敏作用 [J], 邹航;赵永祥;3.塞来昔布对人鼻咽癌 CNE －2细胞放疗的增敏作用 [J], 李超;成浩;肖华光;王倩4.塞来昔布对肝癌细胞放疗增敏作用研究 [J], 王国栋;党亚正5.塞来昔布放疗增敏作用在食管癌放化疗中应用的不良反应 [J], 吕国晓;张大海;马海锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞的作用及机制研究
保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞的作用及机制研究阿南达;苏依拉其木格;包景荣;苏秀兰【摘要】目的探讨保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用及机制,为临床应用与推广提供科学的理论及实验数据.方法体外培养人肝癌Huh-7细胞,实验分为四组:对照组(生理盐水)、保肝蒙药Ⅰ号组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组、保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组.分别采用MTT法、流式细胞术和Q-PCR技术观察药物干涉后对肝癌细胞增殖的抑制作用,对肝癌细胞凋亡、细胞周期阻滞和相关基因表达的影响.结果5-Fu组、保肝蒙药Ⅰ号(4mg/mL)组和保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组对Huh-7肝癌细胞增殖抑制率分别达到67.70％、73.67％和75.35％.保肝蒙药Ⅰ号组单独作用于Huh-7肝癌细胞以及保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组联合作用,细胞的凋亡率均显示增加(P＜0.05).与对照组比较,保肝蒙药Ⅰ号组和5-Fu组分别作用于Huh-7肝癌细胞后显示细胞GgG1期比率明显增加(P＜0.05);然而,保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组作用于Huh-7肝癌细胞后显示细胞S期比率明显增加(P＜0.05).保肝蒙药Ⅰ号组对凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达具有调控作用,能上调细胞色素C的表达.结论保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞增殖有显著的抑制作用,其机制与细胞周期阻滞及影响肿瘤细胞凋亡相关基因的表达相关.研究成果将对阐明临床应用的保肝蒙药Ⅰ号治疗肝癌的机制及推广应用有重要意义.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2015(012)035【总页数】5页(P26-30)【关键词】保肝蒙药Ⅰ号;肝癌Huh-7细胞;5-氟尿嘧啶【作者】阿南达;苏依拉其木格;包景荣;苏秀兰【作者单位】内蒙古自治区鄂尔多斯市伊金霍洛旗蒙医院蒙医肝胆内科,内蒙古鄂尔多斯017200;内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心,内蒙古呼和浩特010050;内蒙古国际蒙医医院制剂中心,内蒙古呼和浩特010020;内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心,内蒙古呼和浩特010050【正文语种】中文【中图分类】R965;R979.1蒙医药作为传统医学已经在临床疾病的预防与治疗中显示出其独特的作用。
2-2013二甲双胍体外诱导人肝癌Huh-7细胞凋亡及其作用机制
吸出并弃去孔内培养液，每孔加入１５０山二甲基亚 砜，避光轻微振荡５ ｍｉｎ，结晶充分溶解，酶联免疫检 测仪检测５７０ ｎｍ处的各孔吸光度（Ａ）值。以只加 全细胞培养液不加细胞的空白对照孔调零，以加入 与实验组相同的培养液但未给予药物处理的组为对 照组。根据Ａ值计算细胞存活率，细胞存活率＝（１一 实验孔Ａ值／对照孔Ａ值）×１００％。 ３．流式细胞仪检测细胞凋亡：将细胞接种于６ 孑Ｌ培养板，每组设３个复孔。二甲双胍、氟尿嘧啶 （５一Ｆｕ）、顺铂（ＤＤＰ）干预４８ ｈ后，以不含乙二胺四 乙酸的胰酶消化并收集各组细胞。磷酸盐缓冲液
ｆｒｒＥＮ ｗａｓ
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔＩｌｅ Ｈｕｈ－７ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ２５ ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ ｍｅｔｒｏｍｍｉｎ ｆｏｒ ４８ ｈｒｓ．Ｍｅｆｆｏｒｍｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｌｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｍｅｆｆｏｒｍｉｎ ａｌｓｏ
【主题词】二甲双胍；肝肿瘤；细胞凋亡；细胞增殖；Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ；ＣＤｌ３３
Ｍｅｆｆｏｒｍｉｎ
ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｈｕｈ－７ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ｔｉｎｇ，ＷＵ Ｇｕｏ－ｙａｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ｄｒｕｇ ｍｅｆｆｏｒｍｉｎ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｈｕｈ－７ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈｕｈ－７ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅ山ｏｔｉｓ
氢分子对肝癌细胞Huh7 的影响
生物技术进展２０２０年㊀第１０卷㊀第４期㊀４００~４０８ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２０￣０３￣０５ꎻ接受日期:２０２０￣０４￣１５㊀基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(３１５００８２８)ꎮ㊀联系方式:商蕾Ｅ￣ｍａｉｌ:ｓｈａｎｇｌｅｉ＠ｅｍａｉｌｓ.ｂｊｕｔ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ∗通信作者马雪梅Ｅ￣ｍａｉｌ:ｘｍｍａ＠ｂｊｕｔ.ｅｄｕ.ｃｎ氢分子对肝癌细胞Ｈｕｈ７的影响商蕾ꎬ㊀李佳腊ꎬ㊀苏泽华ꎬ㊀谢飞ꎬ㊀马雪梅∗北京工业大学生命科学与生物工程学院ꎬ北京１００１２４摘㊀要:氢分子对癌症等疾病具有良好的治疗或改善效果ꎬ并且获得简单㊁使用简便且无副作用ꎮ为了明确氢分子对肝癌细胞Ｈｕｈ７的影响ꎬ从细胞活性㊁细胞周期和凋亡㊁细胞成瘤能力㊁细胞迁移侵袭等方面研究了氢分子对肝癌细胞Ｈｕｈ７的作用效果ꎮ细胞活性检测(ＣＣＫ￣８法)结果表明ꎬ氢分子对Ｈｕｈ７细胞活性具有明显的抑制效果ꎮ细胞成瘤能力实验中ꎬ克隆球实验显示ꎬ含氢培养基组(Ｈ)细胞成球数目有所减少ꎬ同时克隆球直径大小显著降低(Ｐ<０.０００１)ꎻ平板克隆实验显示ꎬＨ组细胞克隆的数量也显著减少(Ｐ<０.００１)ꎬ说明氢分子可以抑制Ｈｕｈ７细胞的干性ꎮ氢分子对Ｈｕｈ７细胞周期的影响也较为明显ꎬ且具有促凋亡的作用和抑制细胞迁移与浸润的效果ꎮ同时ꎬ氢分子对细胞内中间丝波形蛋白的表达也具有抑制作用ꎮ研究表明ꎬ氢分子降低了Ｈｕｈ７细胞的活性和增殖能力ꎬ减弱了Ｈｕｈ７细胞的干性ꎬ同时抑制了细胞侵袭及迁移的能力ꎬ降低了细胞波形蛋白的表达ꎬ为氢分子用于肝癌防治提供了一定的实验基础ꎮ关键词:氢分子ꎻ肝癌ꎻ肿瘤防治ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２０.００２４ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＨｙｄｒｏｇｅｎｏｎＬｉｖｅｒＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓＨｕｈ７ＳＨＡＮＧＬｅｉꎬＬＩＪｉａｌａꎬＳＵＺｅｈｕａꎬＸＩＥＦｅｉꎬＭＡＸｕｅｍｅｉ∗ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１００１２４ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎｏｎｖａｒｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈａｓｃａｎｃｅｒａｒｅｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ.Ｉｔｉｓｓｉｍｐｌｅｔｏｏｂｔａｉｎꎬｅａｓｙｔｏｕｓｅａｎｄｆｒｅｅｏｆｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｓ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎｏｎｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌＨｕｈ７ꎬｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎｏｎＨｕｈ７ｃｅｌｌｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｓｐｅｃｔｓｏｆｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙꎬｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓꎬｃｅｌｌｎｅｏｐｌａｓｍｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔ(ＣＣＫ￣８ｍｅｔｈｏｄ)ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎｈａｄｏｂｖｉｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎＨｕｈ７ｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｎｅｏｐｌａｓｍｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬｔｈｅｃｌｏｎｅｂａｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｇｌｏｂｕｌｅｓｉｎｔｈｅｈｙｄｒｏｇｅｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍｅｄｉｕｍｇｒｏｕｐ(Ｈ)ｄｅｃｒｅａｓｅｄꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｃｌｏｎｅｂａｌｌｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ(Ｐ<０.０００１).ＴｈｅｐｌａｔｅｃｌｏｎｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｃｌｏｎｅｓｉｎｇｒｏｕｐＨａｌｓｏｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ(Ｐ<０ ００１)ꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｄｒｙｎｅｓｓｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎａｌｓｏｈａｄｏｂｖｉｏｕｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎＨｕｈ７ｃｅｌｌｃｙｃｌｅꎬａｎｄｈａｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｒｏｍｏｔｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ.Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅꎬｈｙｄｒｏｇｅｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓｃｏｕｌｄａｌｓｏｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖｉｍｅｎｔｉｎｉｎｃｅｌｌｓ.ＳｔｕｄｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈｙｄｒｏｇｅｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓꎬｗｅａｋｅｎｅｄｔｈｅｄｒｙｎｅｓｓｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓꎬｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙꎬａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｖｉｍｅｎｔｉｎꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄａｃｅｒｔａｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎꎻｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒꎻｃａｎｃｅｒｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ㊀㊀肝癌是最常见的恶性肿瘤之一ꎬ据２０１８年的世界卫生组织发布的世界癌症报告称ꎬ目前肝癌的患病人数在全球男性中排名第五ꎬ女性中排名第九ꎬ死亡人数全球排名分别为第二和第六[１]ꎮ常见的致病因素有:乙型肝炎病毒㊁丙型肝炎病毒㊁肝硬化㊁酒精性肝炎㊁非酒精性脂肪肝炎㊁肝炎病毒感染㊁黄曲霉素污染的食物等[２￣８]ꎬ其中大约７５％的肝癌病例是由乙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒导致的肝硬化引发的[９]ꎮ在肝㊁肺㊁结肠和胃等４种恶性肿瘤中[１０]ꎬ我国每年约有１３万患者. All Rights Reserved.死于肝癌ꎬ占全世界肝癌病死总人数的４５％ꎬ且每年新发４６万人ꎬ占全世界的５５％ꎬ属于肝癌多发和高发国家[１１]ꎮ这跟我国是肝炎高发病率的国家密切相关[９]ꎮ国际肝癌疾病研究协会数据显示ꎬ肝癌的病死高发人群逐渐向青壮年偏移[１２￣１３]ꎮ且因肝癌具有多复发㊁转移性强和耐药等特点ꎬ使得临床治疗中多种治疗方式对于肝癌的治疗效果均不理想ꎬ且肝癌患者的预后及恢复效果也极差[１４]ꎮ因此ꎬ减少肝癌的转移和复发是目前的研究重点ꎮ作为自然界最简单的分子ꎬ氢分子长期以来被人们认为是一种生理惰性气体ꎬ而近十几年来ꎬ氢分子医学领域发展十分迅速ꎬ并在各种疾病中展现出多种生物学效应ꎬ包括缓解创伤炎症㊁控制代谢疾病㊁缓解有机磷农药引起的神经毒性以及抑制肿瘤生成等[１５]ꎮ氢分子发挥生物学作用的机理尚无定论ꎬ其可能通过选择性清除毒性自由基来抑制氧化应激反应ꎬ也可能通过作用于生物酶或调节细胞内信号分子来发挥作用[１６￣２０]ꎮＬｉ等[２１]研究肾细胞癌时发现ꎬ氢分子可防治次氮基三乙酸铁诱导的肾脏毒性和致癌性ꎮ研究显示ꎬ饮用富氢水可以显著降低组织中丙二醛(ｍａｌｏｎｄ￣ｉａｌｄｅｈｙｄｅꎬＭＤＡ)和过氧化亚硝酸盐的含量ꎬ从而降低氧化应激水平㊁缓解炎症反应ꎬ进而减弱次氮基三乙酸铁诱导的大鼠肾毒性ꎬ减轻大鼠的肾脏损伤并抑制其肿瘤早期发展ꎬ证明富氢水能够通过抗氧化和抗炎症作用达到对次氮基三乙酸铁诱导的肾毒性和致癌性的防治效果[２１]ꎮ此外ꎬ氢分子还能减轻恶性肿瘤治疗所引发的副作用ꎮ如Ｋａｎｇ等[２２]的研究表明ꎬ通过让放疗期间的肝癌患者饮用６周富氢水ꎬ可以显著降低肝癌患者血液中活性氧代谢产物并维持了血液中的氧化电势ꎬ提高患者的生活质量ꎬ提示氢分子能通过减少辐射诱导的氧化应激反应ꎬ来减少放射治疗的副作用ꎮ目前ꎬ氢气的介入方法主要集中在以下方面:呼吸氢气㊁富氢水饮用㊁富氢生理盐水注射㊁氢气浴㊁氢气滴眼液以及肠道氢气介入等等ꎬ分别应用于不同疾病的治疗或动物/细胞模型的研究[２３]ꎮ本研究采用含氢培养基对人肝癌细胞Ｈｕｈ７进行处理ꎬ使用ＣＣＫ￣８法检测细胞增殖活性ꎬ流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况ꎬ悬浮培养克隆球和平板克隆实验检测细胞成球能力和细胞干性ꎬ细胞划痕实验和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室实验分别检测细胞迁移和侵袭的能力ꎬ细胞免疫荧光实验检测波形蛋白的表达情况ꎬ从而研究氢分子对肝癌细胞Ｈｕｈ７的影响ꎬ以期增加肝癌病人的生存率㊁提高患者的生活质量ꎬ并为氢分子对肝癌疾病的预防和治疗提供实验依据和理论基础ꎮ１㊀材料与方法１㊀实验材料人肝癌细胞Ｈｕｈ７细胞株由北京大学第三医院惠赠ꎮＣＣＫ￣８购于东仁化学科技(上海)有限公司ꎻ富氢水发生器购于上海潓美医疗科技有限公司ꎻＲＰＭＩ￣１６４０培养基㊁ＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基㊁青链霉素(１００ˑ)㊁胎牛血清(ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍꎬＦＢＳ)㊁Ｂ２７无血清添加剂㊁碱性成纤维细胞生长因子(ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒꎬｂＦＧＦ)㊁表皮生长因子(ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒꎬＥＧＦ)㊁０.２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ￣ＥＤＴＡ购于美国Ｇｉｂｃｏ公司ꎻ细胞周期检测试剂盒和凋亡检测试剂盒购于美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司ꎻＭａｔｒｉｇｅｌ基质胶购于美国ＢＤ公司ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀含氢培养基的制备㊀将氢气发生器接出的硅胶管放入含培养基的５０ｍＬ离心管中ꎬ在离心管的盖子上剪出１个比硅胶管稍大一些的小孔ꎬ保证能让小管插入至底部ꎬ并且在硅胶管中间接入１个０.２２μｍ的过滤器使气体进入培养基时过滤掉细菌等ꎻ打开制氢机开始产生氢气ꎬ会看到培养基里的硅胶管有气泡冒出ꎬ持续通入氢气约１ｈꎬ保持氢气达到饱和后进行下一步使用ꎮ１.２.２㊀细胞培养㊀细胞培养的过程一般有细胞复苏㊁培养㊁传代和冻存４个部分ꎬ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ实验分为２组:含氢培养基组(Ｈ)和对照组(Ｃꎬ即不通氢气的培养基)ꎮ１.２.３㊀细胞计数方法㊀采用常用的台盼蓝染料浸染细胞方法进行细胞计数ꎬ通过活细胞的细胞膜具有选择通透性这一特点来区分ꎮ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ１.２.４㊀细胞活性测定(ＣＣＫ￣８法)㊀ＣＣＫ￣８法是较为常用的用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细胞数目的一种方法ꎬ具有高灵敏度ꎬ无放射性的特点ꎮ本研究利用该方法检测在４５０ｎｍ处的吸收峰来判断细胞活性情况ꎬ以确定氢分子对１０４商蕾ꎬ等:氢分子对肝癌细胞Ｈｕｈ７的影响. All Rights Reserved.Ｈｕｈ７细胞活性的影响ꎮ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ１.２.５㊀细胞周期检测㊀收集对数生长期的细胞并计数ꎬ调至细胞浓度１ˑ１０５ｃｅｌｌｓ ｍＬ－１ꎬ在六孔板中每孔接种２０万细胞ꎮ置于培养箱中培养２４ｈꎬ然后根据实验分组用移液器吸去孔板中的培养基ꎬ每孔替换普通培养基或含氢培养基ꎬ继续培养２４ｈꎮ取出六孔板ꎬ收集细胞用７０％冰乙醇固定ꎬ４ħ静置过夜ꎮ第２天取出固定后的细胞ꎬ用ＰＢＳ洗去固定液ꎬ加入２００μＬ细胞周期检测试剂ꎬ室温避光孵育２０ｍｉｎ后ꎬ上机进行流式检测ꎮ１.２.６㊀细胞凋亡检测㊀收集对数生长期的细胞并计数ꎬ调至细胞浓度１ˑ１０５ｃｅｌｌｓ ｍＬ－１ꎬ在六孔板中每孔接种２０万细胞ꎮ置于培养箱中培养２４ｈꎬ然后根据实验分组用移液器吸去孔板中的培养基ꎬ每孔替换普通培养基或含氢培养基ꎬ继续培养２４ｈꎮ取出六孔板ꎬ收集细胞ꎬ用１％ＦＢＳ的ＰＢＳ清洗２遍ꎬ离心后用１％ＦＢＳ的ＰＢＳ重悬ꎬ然后加入１００μＬ细胞凋亡检测试剂ꎬ室温避光孵育２０ｍｉｎ后ꎬ上机进行流式检测ꎮ１.２.７㊀细胞克隆球形成实验㊀采用Ｈｕｈ７细胞进行细胞克隆球形成实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ通过克隆球的形成效率ꎬ来研究氢分子对Ｈｕｈ７细胞克隆球形成的影响ꎮ１.２.８㊀细胞平板克隆实验㊀采用Ｈｕｈ７细胞进行细胞平板克隆实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ通过观察细胞形成克隆的能力ꎬ来研究氢分子对Ｈｕｈ７细胞的成瘤率的影响ꎮ１.２.９㊀细胞划痕实验㊀采用Ｈｕｈ７细胞进行细胞划痕实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ通过观察细胞迁移的情况ꎬ来研究氢分子对Ｈｕｈ７细胞迁移能力的影响ꎮ１.２.１０㊀细胞侵袭实验㊀采用Ｈｕｈ７细胞进行细胞侵袭实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ通过观察细胞侵袭的情况ꎬ来研究氢分子对Ｈｕｈ７细胞侵袭能力的影响ꎮ１.２.１１㊀细胞免疫荧光㊀采用Ｈｕｈ７细胞进行细胞免疫荧光实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[２４]的研究ꎮ通过观察波形蛋白的表达情况ꎬ来研究氢分子对Ｈｕｈ７细胞中波形蛋白表达的影响ꎮ１.３㊀统计学分析本研究采用统计软件ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６.０１版本分析所有数据资料ꎮ在符合正态性和方差齐性的前提下ꎬ以均数ʃ标准差(ＭʃＳ)进行统计学描述ꎻ统计推断则采用ｔ检验(ｔ￣ｔｅｓｔ)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀富氢培养基的制备为了研究氢分子在体外对肝癌细胞系的作用ꎬ首先需要制备含有一定氢气浓度的细胞培养基ꎮ利用氢气发生器ꎬ将其产生的氢气通过硅胶管接入ＲＰＭＩ￣１６４０培养基中ꎬ１ｈ后使用氢电极对培养基中的氢浓度进行检测ꎬ检测过程中培养基保持稳定不晃动ꎬ这可以使氢气不会因人为原因快速逸出ꎮ如图１所示ꎬ含氢培养基组(Ｈ)的氢浓度与对照组(Ｃ)相比ꎬＣ组的氢气浓度是远远低于Ｈ组的ꎮ在０ｍｉｎ左右时检测到含氢培养基的氢浓度最高为１.６ｍｇ Ｌ－１ꎬ由于氢气在水中的溶解度极低ꎬ因此Ｃ组中培养基的氢浓度保持不变ꎬ只有０.０２ｍｇ Ｌ－１ꎮ同时图中显示ꎬ０~６０ｍｉｎ内培养基中的氢浓度变化不大ꎬ表明氢浓度已经达到饱和ꎬ并且在相对较长的时间内保持较高的浓度ꎮ该结果表明使用氢气发生器可以制备含氢培养基ꎬ并在一定的时间内保持有效浓度ꎮ图１㊀细胞培养基中氢浓度变化Ｆｉｇ.１㊀Ｈｙｄｒｏｇｅｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ２.２㊀氢分子对肝癌细胞活性的影响按分组采用不同培养基处理Ｈｕｈ７细胞不同时间ꎬ用ＣＣＫ￣８法检测氢分子对Ｈｕｈ７细胞的活性的影响ꎬ通过在４５０ｎｍ吸收峰处定时检测ꎬ可反映出Ｈｕｈ７细胞在不同处理条件下的增殖水平２０４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.和生长状态ꎮ本研究监测了Ｈｕｈ７细胞在１２０ｈ内的生长情况ꎬ结果如下图２所示ꎮ与Ｃ组相比ꎬ氢分子处理Ｈｕｈ７细胞后ꎬ细胞在前２４ｈ内的生长没有明显变化ꎬ２４ｈ后Ｈ组细胞增殖速率明显低于Ｃ组ꎬ在７２ｈ和１２０ｈ具有显著性差异(Ｐ<０.０５)ꎻ在１２０ｈ内ꎬ细胞的总体增长速率小于Ｃ组ꎬ且细胞活性始终低于Ｃ组ꎮ结果表明ꎬ氢分子能够在一定程度上抑制Ｈｕｈ７细胞的生长ꎬ降低细胞的活性ꎬ且氢分子在抑制细胞活性的同时对细胞本身没有明显的毒性作用ꎮ注:∗ Ｈ组与Ｃ组间的差异在Ｐ<０.０５水平上具有统计学意义ꎮ图２㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞系细胞活性的影响Ｆｉｇ.２㊀ＧｒｏｗｔｈｒａｔｅｃｈａｎｇｅｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄ２.３㊀氢分子对肝癌细胞系细胞周期的影响细胞周期反映了细胞从上一次分裂结束至下一次分裂开始的过程ꎬ细胞周期异常是肿瘤细胞的重要特性之一ꎮ在正常细胞中ꎬ细胞周期受多种信号通路调控ꎬ细胞有序的生长㊁进行ＤＮＡ复制及分裂等活动[２５]ꎮ这一过程涉及的机制可确保细胞的正常生长ꎬ若机制出现错误ꎬ细胞的凋亡通路便会被激活ꎬ并调控细胞程序性死亡ꎮ在肿瘤中ꎬ由于基因突变等原因ꎬ细胞周期调控出现异常ꎬ最终导致肿瘤细胞增殖失控ꎬ细胞ＤＮＡ大量复制ꎬ细胞不断分裂ꎬ增殖速度加快ꎮ已知ＣＣＫ￣８法检测结果表明氢分子能够抑制肝癌细胞的活性ꎬ因此ꎬ为了进一步探讨氢分子对肝癌细胞增殖水平的影响ꎬ本实验按分组采用不同培养基处理Ｈｕｈ７细胞２４ｈꎬ通过流式细胞术来检测细胞周期情况ꎬ探讨氢分子对肿瘤细胞周期的影响ꎮ如图３所示ꎬ细胞周期Ｇ０/Ｇ１期为ＤＮＡ合成前期ꎬ在此期间主要合成ＤＮＡ复制所需的ＲＮＡ和核糖体ꎻＳ期为ＤＮＡ合成期ꎬ在此期间ＤＮＡ大量复制ꎻＧ２/Ｍ期为ＤＮＡ合成后期ꎬ是有丝分裂的准备期ꎬ此时ＤＮＡ终止合成ꎬ为细胞有丝分裂做好准备ꎮ氢分子处理后ꎬＨｕｈ７细胞的Ｇ０/Ｇ１期细胞数显著减少(Ｐ<０.０１)ꎻＳ期细胞数增加ꎬ虽无显著性差异ꎬ但是柱状图呈现了上升的Ａ:流式细胞仪周期结果图ꎻＢ:氢分子对Ｈｕｈ７细胞周期的影响ꎻ∗∗ Ｈ组与Ｃ组间的差异在Ｐ<０.０１水平上具有统计学意义ꎮ图３㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞周期的影响Ｆｉｇ.３㊀ＣｅｌｌｃｙｃｌｅｃｈａｎｇｅｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄｆｏｒ２４ｈ３０４商蕾ꎬ等:氢分子对肝癌细胞Ｈｕｈ７的影响. All Rights Reserved.趋势ꎻＧ２/Ｍ期细胞数显著增加(Ｐ<０.０１)ꎮ说明氢分子处理Ｈｕｈ７细胞后ꎬ引起了细胞Ｇ２/Ｍ期阻滞ꎬ导致进入Ｇ０/Ｇ１期的细胞减少ꎬ进而影响了细胞的增殖ꎮ结合ＣＣＫ￣８法检测结果来看ꎬ流式细胞术检测得到的细胞周期结果与其相对应ꎬ说明氢分子可能是通过影响细胞周期从而抑制肿瘤细胞的增殖ꎮ２.４㊀氢分子对肝癌细胞系细胞凋亡的影响细胞凋亡即细胞程序性死亡ꎬ是细胞自主进行的死亡过程ꎬ肿瘤细胞由于基因突变等原因ꎬ通常具有一定的抗凋亡机制ꎮ为了进一步验证氢分子对肝癌细胞凋亡水平的影响ꎬ本实验按分组采用普通培养基和含氢培养基处理Ｈｕｈ７细胞２４ｈꎬ通过流式细胞术检测Ｈｕｈ７细胞不同凋亡时期的变化ꎬ来探讨氢分子对Ｈｕｈ７细胞凋亡的影响ꎮ图４表示氢分子对Ｈｕｈ７细胞凋亡的影响ꎮ与Ｃ组相比ꎬ氢分子处理后ꎬＨｕｈ７正常细胞数显著增加(Ｐ<０.０００１)ꎬ早期凋亡细胞数基本没有变化ꎬ晚期凋亡细胞数显著增加(Ｐ<０.０５)ꎬ坏死细胞数显著减少(Ｐ<０.０００１)ꎬ说明氢分子处理对Ｈｕｈ７细胞的主要作用可能是促进其晚期凋亡ꎮ凋亡实验结果表明ꎬ氢分子处理后ꎬ能够在晚期凋亡阶段促进肝癌细胞的凋亡水平ꎬ从而抑制肿瘤细胞的增殖ꎮＡ:流式细胞仪凋亡结果图ꎻＢ:氢分子对Ｈｕｈ７细胞凋亡的影响ꎻ∗和∗∗∗∗分别表示Ｈ组与Ｃ组间的差异在Ｐ<０.０５和Ｐ<０.０００１水平上具有统计学意义ꎮ图４㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞凋亡的影响Ｆｉｇ.４㊀ＣｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｃｈａｎｇｅｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄｆｏｒ２４ｈ２.５㊀氢分子对细胞悬浮克隆球形成的影响通过统计克隆球形成数目即可对肝癌细胞样本及不同处理对其自我更新能力的影响进行分析ꎮ克隆球的形成率间接反映细胞系中干细胞的比例ꎮ按分组采用不含血清的普通培养基和含氢培养基培养悬浮克隆球ꎬ来研究氢分子对Ｈｕｈ７细胞克隆球形成的影响ꎮ图５表示氢分子对Ｈｕｈ７细胞克隆球形成的影响ꎮＨｕｈ７细胞虽然能形成克隆球ꎬ但克隆球数量较少ꎬ与Ｃ组相比ꎬＨ组的克隆球数量虽然有所减少ꎬ但没有显著性差异ꎻ与Ｃ组相比ꎬＨ组的克隆球直径显著变小(Ｐ<０.０００１)ꎮ表明氢分子可以抑制Ｈｕｈ７细胞形成克隆球的数量和大小ꎬ进而说明氢分子对肝癌细胞的干性有一定的抑制作用ꎮ４０４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:克隆球显微镜拍照(４０ˑ)ꎻＢ:克隆球形成数目及平均直径ꎻ∗∗∗∗ Ｈ组与Ｃ组间的差异在Ｐ<０.０００１水平上具有统计学意义ꎮ图５㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞悬浮克隆球形成的影响Ｆｉｇ.５㊀ＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇｂａｌｌｃｈａｎｇｅｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄ２.６㊀氢分子对肝癌细胞系单克隆形成的影响按分组采用不同培养基培养细胞ꎬ观察Ｈｕｈ７细胞形成克隆能力ꎬ以检验氢分子对Ｈｕｈ７细胞形成克隆的影响ꎬ探讨氢分子对肝癌细胞成瘤率的影响ꎮ结果如图６所示ꎬ加入氢分子后ꎬＨｕｈ７细胞的克隆形成数显著减少(Ｐ<０.００１)ꎮ实验结Ａ:细胞平板克隆染色图ꎬ染色深浅与细胞形成的克隆数量成正比ꎻＢ:细胞形成克隆的计数图ꎻ∗∗∗表示Ｈ组与Ｃ组间的差异在Ｐ<０.００１水平上具有统计学意义ꎮ图６㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞克隆形成的影响Ｆｉｇ.６㊀ＣｌｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄ果表明氢分子能够显著抑制Ｈｕｈ７细胞在体外形成细胞克隆群ꎬ并且抑制肿瘤细胞的活性及无限增殖的能力ꎬ对癌症的进展具有一定的抑制作用ꎮ２.７㊀氢分子对肝癌细胞系迁移的影响肝癌难以治愈的重要原因就是其复发和易转移的特性ꎬ而肝癌的转移与肿瘤细胞的迁移能力密切关联ꎮ因此ꎬ采用划痕实验ꎬ按分组加入普通培养基和含氢培养基处理Ｈｕｈ７细胞ꎬ观察细胞迁移的情况ꎬ从而探讨氢分子对Ｈｕｈ７细胞迁移能力的影响ꎮ图７表示氢分子对Ｈｕｈ７细胞迁移能力的影响ꎮ经过２４ｈ的继续培养ꎬ细胞开始向中间移动ꎬＨｕｈ７细胞Ｃ组移动较快ꎬ加入含氢培养基后ꎬ细胞迁移能力显著降低(Ｐ<０.０１)ꎮ结果表明氢分子处理后ꎬＨｕｈ７细胞的迁移能力受到明显抑制ꎬ表明氢分子对肝癌的转移具有一定的抑制作用ꎮ２.８㊀氢分子对肝癌细胞系浸润的影响通过迁移实验可以得知ꎬ氢分子能够抑制肝癌细胞形变移动ꎮＴｒａｎｓｗｅｌｌ实验中ꎬ细胞若要模拟肿瘤细胞的侵袭作用既需要将胞外基质Ｍａｔｒｉｇｅｌ通过自身分解酶类降解ꎬ又需要形变穿过小于自身体积的膜孔ꎮ因此ꎬ通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室模拟肿瘤细胞在体内侵袭转移的过程ꎬ进一步验证加入氢分子对Ｈｕｈ７细胞的侵袭能力的影响ꎬ同时观察细胞侵袭的情况ꎮ５０４商蕾ꎬ等:氢分子对肝癌细胞Ｈｕｈ７的影响. All Rights Reserved.图８表示氢分子对Ｈｕｈ７细胞的侵袭结果ꎬ图Ａ中染色越深说明细胞穿过基底膜的数量越多ꎮ染色结果显示ꎬ在普通培养基中的肝癌细胞Ａ:细胞划痕显微拍照ꎻＢ:细胞迁移率ꎻ∗∗表示Ｈ组与Ｃ组间的差异在Ｐ<０.０１水平上具有统计学意义ꎮ图７㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞迁移的影响Ｆｉｇ.７㊀ＣｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄＡ:细胞显微拍照ꎻＢ:细胞穿过小室计数图ꎻ∗∗∗∗表示Ｈ组与Ｃ组间的差异在Ｐ<０.０００１水平上具有统计学意义ꎮ图８㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞侵袭的影响Ｆｉｇ.８㊀ＣｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆＨｕｈ７ａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄ侵袭能力较强ꎬ而含氢培养基中的细胞侵袭能力明显降低ꎮ细胞计数结果表明ꎬＨ组的Ｈｕｈ７细胞穿孔细胞数较Ｃ组显著减少(Ｐ<０.０００１)ꎬ侵袭抑制效果非常明显ꎮ该实验结果表明ꎬ氢分子可能抑制Ｈｕｈ７细胞的侵袭能力ꎬ对肝癌的转移具有一定的抑制效果ꎮ该实验结果与细胞划痕实验相一致ꎬ说明氢分子能够抑制肝癌细胞的运动能力ꎬ从而抑制肿瘤的转移ꎮ２.９㊀氢分子对肝癌细胞系中波形蛋白表达的影响波形蛋白(ｖｉｍｅｎｔｉｎ)作为细胞中间丝的一种ꎬ其动态性质对细胞的灵活性非常重要ꎬ波形蛋白分布情况为从细胞核到细胞膜放射状分布ꎬ在维持和调节细胞功能中有着重要作用ꎬ负责维持细胞骨架的完整性[２６]ꎮ波形蛋白参与肿瘤细胞的分化㊁侵袭㊁转移和细胞凋亡等过程ꎬ多数研究表明波形蛋白表达与肿瘤的迁移和侵袭能力成正相关[２７]ꎮ因此ꎬ通过细胞免疫荧光实验来研究氢分子对Ｈｕｈ７细胞波形蛋白表达变化的影响ꎮ如图９所示ꎬ经氢分子处理后ꎬＨｕｈ７细胞明显皱缩ꎬ部分细胞坏死并呈现梭形ꎬ波形蛋白的表达量较Ｃ组明显下降ꎮ该实验表明ꎬ氢分子可能通过降低细胞中间丝波形蛋白的表达ꎬ继而影响Ｈｕｈ７细胞的粘附和形态ꎮ图９㊀氢分子对Ｈｕｈ７细胞波形蛋白的影响Ｆｉｇ.９㊀ＶｉｍｅｎｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＨ２ｔｒｅａｔｅｄ３㊀讨论目前ꎬ肝癌多采用药物治疗的方法ꎬ但仅能延长患者近５年的生存期ꎬ给患者的生活与家庭造成极大的痛苦和经济负担ꎮ因此ꎬ从社会公共卫生角度考虑ꎬ寻找有疗效㊁价格低的药物对癌症的预防和治疗至关重要ꎮ氢分子作为新型抗氧化６０４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.剂ꎬ在多种疾病类型中取得良好的效果ꎬ并且较易获得ꎬ价格低廉[２８]ꎮ现有研究证明ꎬ氢分子对一些肿瘤具有一定的治疗效果ꎬ如卵巢癌㊁大肠癌等[２９￣３０]ꎬ因此ꎬ本研究应用肝癌细胞模型ꎬ在细胞水平探究氢分子对肝癌的治疗作用ꎮ本研究选择了人肝癌Ｈｕｈ７细胞作为体外研究目标ꎬ该细胞被广泛用于肝癌的生长㊁恶性表型㊁抗肝癌药物的药理药代和药物机理等研究ꎮ本研究结果显示ꎬ氢分子可以改变Ｈｕｈ７细胞的细胞形态ꎬ抑制细胞在体外的增殖水平及肿瘤干细胞自我更新能力㊁无限增殖能力ꎬ降低细胞迁移和高度侵袭能力ꎬ并影响细胞周期ꎬ促进细胞凋亡ꎬ这些结果说明氢分子能够抑制肿瘤的生长和肝癌细胞的转移ꎬ并对肝癌的发生发展具有一定的防治作用ꎮ与常规的临床治疗手段相比ꎬ氢分子结构简单ꎬ制备安全经济ꎬ并且其安全无毒副作用的特点给未来研究带来很多便利[２８]ꎬ也为患者提供了更好的生活质量ꎮ然而ꎬ本次研究只采用了体外细胞的实验结果ꎬ氢分子对肝癌的防治作用在体内的影响仍有待研究ꎬ下一步准备建立动物模型实验ꎬ进一步探究在肝癌的动物模型中ꎬ氢分子对肿瘤的影响ꎬ是否与体外结果相一致ꎬ可以达到抑制肿瘤生长和转移的效果ꎮ目前ꎬ除了含氢培养基处理细胞ꎬ动物供给呼吸也是一种方式ꎬ还有注射富氢生理盐水㊁氢气浴㊁氢气滴眼液以及肠道氢气介入等方式ꎬ目前都有相关研究[２３]ꎬ氢分子给药的多样化为实验研究和患者生活都带来了效率ꎮ综上所述ꎬ氢气已经成为多种疾病治疗中非常有希望的选择ꎬ氢气的经济性与安全性也成为肿瘤治疗良好的辅助性手段ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＣＨＥＮＷＱꎬＨＥＪꎬＳＵＮＫＸꎬｅｔａｌ..ＣａｎｃｅｒｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎＣｈｉｎａꎬ２０１４[Ｊ].Ｃｈｉｎ.Ｊ.ＣａｎｃｅｒＲｅｓ.ꎬ２０１８ꎬ３０(１):１－１２.[２]㊀ＰＡＳＱＵＩＮＥＬＬＩＡＥꎬＲＥＩＮＨＡＲＴＢＪꎬＳＬＡＣＫＦꎬｅｔａｌ..Ｃｏｎ￣ｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｔｅｍｐｏｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｅｔ￣７ｈｅｔ￣ｅｒｏｃｈｒｏｎｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＲＮＡ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２０００ꎬ４０８(６８０８):８６－８９.[３]㊀ＬＥＷＩＳＢＰꎬＢＵＲＧＥＣＢꎬＢＡＲＴＥＬＤＰ.Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｅｅｄｐａｉ￣ｒｉｎｇꎬｏｆｔｅｎｆｌａｎｋｅｄｂｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｓꎬｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｔｈｏｕｓａｎｄｓｏｆｈｕｍａｎｇｅｎｅｓａｒｅｍｉｃｒｏＲＮＡｔａｒｇｅｔｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２００５ꎬ１２０(１):１５－２０.[４]㊀ＲＯＤＲＩＧＵＥＺＡ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｍｉｃｒｏＲＮＡｈｏｓｔｇｅｎｅｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｕｎｉｔｓ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ.ꎬ２００４ꎬ１４(１０ａ):１９０２－１９１０.[５]㊀ＣＨＥＮＪＬꎬＬＩＮＸꎬＺＨＯＵＱꎬｅｔａｌ..ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＨＢＶＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈａｎｔｉｖｉｒａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｕｔｃｏｍｅｓｉｎｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｅａｒｌｙ￣ｓｔａｇｅＨＢＶ￣ｒｅｌａｔｅｄｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇｃｕｒａｔｉｖｅｒｅｓｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｈｉｎ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒꎬ２０１６ꎬ３５(５):２３６－２４９.[６]㊀ＥＬ￣ＳＥＲＡＧＨＢꎬＫＡＮＷＡＬＦꎬＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮＰꎬｅｔａｌ..ＲｉｓｋｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａａｆｔｅｒｓｕｓｔａｉｎｅｄｖｉｒｏｌｏｇｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｖｅｔｅｒａｎｓｗｉｔｈＨＣＶ￣ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ６４(１):１３０－１３７.[７]㊀ＢＲＵＩＸＪꎬＳＨＥＲＭＡＮＭ.Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉ￣ｎｏｍａ:ａｎｕｐｄａｔｅ[Ｊ].Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ５３(３):１０２０－１０２２. 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All Rights Reserved.[２１]㊀ＬＩＦＹꎬＺＨＵＳＸꎬＷＡＮＧＺＰꎬｅｔａｌ..Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏ￣ｇｅｎ￣ｒｉｃｈｗａｔｅｒｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｆｅｒｒｉｃｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔａｔｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｅａｒｌｙｔｕｍｏｒｐｒｏｍｏｔｉｏｎａｌｅｖｅｎｔｓｉｎｒａｔｓ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍ.Ｔｏｘｉｃｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ６１:２４８－２５４.[２２]㊀ＫＡＮＧＫＭꎬＫＡＮＧＹＮꎬＣＨＯＩＩＢꎬｅｔａｌ..Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｒｉｎｋｉｎｇｈｙｄｒｏｇｅｎ￣ｒｉｃｈｗａｔｅｒｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｌｉｆｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｌｉｖｅｒｔｕｍｏｒｓ[Ｊ].Ｍｅｄ.ＧａｓＲｅｓ.ꎬ２０１１ꎬ１(１):１１[２０２０－０７－０２].ｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１１８６/２０４５－９９１２－１－１１.[２３]㊀ＯＳＴＯＪＩＣＳＭ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｄｒｏｇｅｎ:ａｎｉｎｅｒｔｇａｓｔｕｒｎｓｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].Ａｎｎ.Ｍｅｄ.ꎬ２０１５ꎬ４７(４):３０１－３０４. [２４]㊀商蕾ꎬ李佳腊ꎬ苏泽华ꎬ等.氢分子对宫颈癌细胞ＨｅＬａ的影响[Ｊ].生物技术进展ꎬ２０１８ꎬ８(４):３０２－３１０. 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甲胎蛋白与Caspases3在Huh7肝癌细胞中共表达的意义
ｒ ｋｎｃｍ ｕ ｉ ｓｓ ｄ （ ＩＣ ） Ｊ ．ｉ ｔｏｉ，００ ５ （ ） ｉ ｏ ｍ ｎｔ ｔ ｙ ＣＲ Ｓ ［ ］ Ｄａ ｏ ｇ ２ １ ，３ ３ ； ｓｉ ｉ ｕ ｅ ｅ ｂ ｌ ａ
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素、 内皮 素 释 放增 加 。本 研 究 发 现 Ｃ Ａ Ｐ Ｐ治 疗 ３ 月 后 ， 试 个 受 者 的 Ｉ Ｉ Ｈ Ａ ｃ较 对 照 组 水 平 有 降 低 趋 势 ， 糖 ｎａＪ ． ｎ Ｍｅ ，０７３６ １５ ． ｌ ｐａ ｅ［］Ｎ Ｅ ｄＪ ｄ２ ０ ，５ ：７ １ ｅ ｐ
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能 由 于其 伴 随 的 自主 神 经 病 变 以 及 微 血 管 病 变 在 Ｏ Ａ Ｓ的 ＳＨ
自噬在人肝癌细胞Huh7对仑伐替尼耐药中的调节作用
自噬在人肝癌细胞Huh 7对仑伐替尼耐药中的调节作用Δ陈大红＊，吴亚菲，刁文婧，杨蕙华，毛鹏娟，李琴 #（上海交通大学医学院附属第一人民医院临床药学科，上海 200080）中图分类号 R 965；R 735.7 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2024）08-0961-06DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2024.08.11摘要 目的 研究自噬在人肝癌细胞Huh 7对仑伐替尼耐药中的调节作用。
方法 以人肝癌细胞Huh 7为对象，采用低浓度逐渐递增联合长期给药的方式构建仑伐替尼耐药细胞模型Huh 7-LR ，以CCK-8实验和流式细胞术检测亲本细胞Huh 7及耐药细胞Huh 7-LR 对仑伐替尼的敏感性，以Western blot 实验和GFP-mCherry-LC 3质粒转染实验分别检测细胞中自噬效应蛋白Beclin-1、自噬接头蛋白sequestosome 1（又名p 62）、微管相关蛋白1轻链3（LC 3）的表达水平和细胞自噬水平。
通过饥饿诱导构建自噬激活细胞模型，以Western blot 实验和GFP-mCherry-LC 3质粒转染实验分别检测细胞中p 62蛋白表达水平和细胞自噬水平，以流式细胞术检测自噬激活对仑伐替尼敏感性的影响。
结果 与亲本细胞相比，Huh 7-LR 细胞的耐药指数为6.2，其p 62蛋白的表达水平显著升高，凋亡率、Beclin-1蛋白的表达水平和LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ比值均显著降低（P ＜0.05或P ＜0.01），自噬水平有所下降。
自噬激活可显著升高Huh 7-LR 细胞中p 62蛋白的表达水平（P ＜0.05）和自噬水平，并显著升高其凋亡率（P ＜0.05）。
结论 自噬参与了仑伐替尼耐药，激活自噬可一定程度逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药。
关键词 自噬；仑伐替尼；肝癌细胞；耐药Regulatory effect of autophagy on the resistance of human liver cancer cell Huh 7 to lenvatinibCHEN Dahong ，WU Yafei ，DIAO Wenjing ，YANG Huihua ，MAO Pengjuan ，LI Qin （Dept. of Clinical Pharmacy ， Shanghai General Hospital ， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine ， Shanghai 200080， China ）ABSTRACTOBJECTIVE To investigate the regulatory effect of autophagy on the resistance of human liver cancer cell Huh 7 tolenvatinib. METHODS Using human liver cancer cell Huh 7 as subject ， the lenvatinib-resist cell model （Huh 7-LR ） was generated by the low-dose gradient method combined with long-term administration. The sensitivity of parental cell Huh 7 and drug-resistant cell Huh 7-LR to lenvatinib was detected by using CCK-8 assay and flow cytometry. Western blot assay and GFP-mCherry-LC 3 plasmid transfection were performed to detect the expression levels of autophagic protein Beclin-1， autophagic adapter protein sequestosome 1 （p 62）， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC 3） and autophagic level. Furthermore ， an autophagy activation model was constructed by cell starvation ， the protein expression of p 62 and autophagy level were detected by using Western blot assay and GFP-mCherry-LC 3 plasmid transfection ， and the effect of autophagy activation on the sensitivity of Huh 7-LR cells to lenvatinib was detected by flow cytometry. RESULTS Compared with parental cells ， the drug resistance index of Huh 7-LR cells was 6.2； protein expression of p 62 was increased significantly ， while apoptotic rate ， protein expression of Beclin-1 and LC 3Ⅱ/ LC 3Ⅰ ratio were all reduced significantly （P ＜0.05 or P ＜0.01）； the level of autophagy was decreased to some extent. Autophagy activation could significantly increase the protein expression of p 62 in Huh 7-LR cells （P ＜0.05） and autophagy level ， and significantly increase its apoptotic rate （P ＜0.05）. CONCLUSIONS Autophagy is involved in lenvatinib resistance ， and activating autophagy can reverse the resistance of liver cancer cells to lenvatinib to some extent.KEYWORDSautophagy ； lenvatinib ； liver cancer cell ； drug resistance2020年全球肝癌确诊病例超90万，死亡病例达83万，是全球范围内第六大常见癌症和第三大常见癌症死亡原因[1]。
葫芦素B诱导细胞铁死亡抑制肝癌Huh-7细胞增殖的机制
网络出版时间：２０２３－０３－２０１６：３３：２７ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０３１９．２３５１．０１６．ｈｔｍｌ葫芦素Ｂ诱导细胞铁死亡抑制肝癌Ｈｕｈ ７细胞增殖的机制洪 婷，王依蕾，曾海荣，袁 易（上海中医药大学附属普陀医院，上海 ２０００６２）收稿日期：２０２２－０９－２１，修回日期：２０２３－０１－０９基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１７０３８８０）；上海市普陀区卫生系统科技创新项目（Ｎｏｐｔｋｗｗｓ２０２２０４）；上海市药学会（Ｎｏ２０２１ ＹＹ ０９）作者简介：洪 婷（１９９１－），女，硕士生，研究方向：肿瘤药理学，Ｅｍａｉｌ：１３８１８８９５９４２＠１６３．ｃｏｍ；袁 易（１９７２－），女，硕士，主任药师，副教授，硕士生导师，研究方向：药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｙｕａｎｙｉ０６２５＠１６３．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２１０３０７０文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０４－０６３８－０８中国图书分类号：Ｒ２８４ １；Ｒ３２９ ２８；Ｒ５９１ １；Ｒ７３５ ７０２ ２摘要：目的 研究葫芦素Ｂ（ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｉｎＢ，ＣｕＢ）对肝癌Ｈｕｈ ７细胞增殖的影响及其作用机制。
方法 ＣＣＫ ８法检测不同浓度ＣｕＢ对Ｈｕｈ ７细胞的存活率；葫芦素Ｂ（０ ５、１、２μｍｏｌ·Ｌ－１）作用于Ｈｕｈ ７细胞２４ｈ，ＥｄＵ染色检测细胞增殖；ＤＣＦＨ ＤＡ，Ｃ１１ ＢＯＤＩＰＹ和ＦｅＲｈｏｎｏｘ １荧光探针分别检测细胞内活性氧水平，细胞内脂质过氧化水平和细胞内Ｆｅ２＋浓度；谷胱甘肽（ＧＳＨ）试剂盒和丙二醛（ＭＤＡ）试剂盒分别检测细胞内ＧＳＨ和ＭＤＡ水平；Ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ和Ｗｅｓｔ ｅｒｎｂｌｏｔ分别检测ＳＬＣ７Ａ１１、ＧＰＸ４、ＳＬＣ４０Ａ１、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｎｒｆ２、ＨＯ １的ｍＲＮＡ水平和蛋白表达情况；免疫共沉淀法检测ＧＰＸ４蛋白的泛素化。
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HuH-7 人肝癌细胞
Catalogue No.: C165
Product Format: a T25 flask
Culture Properties：贴壁
Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗
Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%
Application:Cells and cancer research
NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY.
Components
Operation steps for cell culture
1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞；
2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶
浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化；
（细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。
细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。
混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。
）
3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀；
4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基
重悬37度培养箱继续培养；
传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。
Cell cryopreservation
1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择）
2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。
Tips：
1.细胞经过运输后，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现
象。
贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。
加5ml PBS重悬细胞，再900-1000rpm(约150g)离心3min，用新鲜的完全培养基重悬接种到新的培养瓶。
第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS 多洗几次。
2.细胞生长不均时，可以将细胞消化吹散后加入新的培养基重新接种或传代。
3.细胞生长缓慢时，可以选择提高血清浓度培养（最高不超过20%），也可以根据细
胞生长状态，选择传代细胞到新的培养瓶中继续培养。
4.不同细胞贴壁性差异比较大，所以消化时间差别较大，20s-10min均有可能，具体
以细胞消化到相互分离但未脱落，并可以轻轻吹下为准，严禁消化到细胞完全漂浮。
客户消化过度导致细胞死亡、漂浮、生长缓慢，不提供免费售后服务。
5.干冰发货均为两支，客户先复苏一支，若复苏失败及时联系我方并在我方指导下复
苏第二支。
若客户同时复苏两支均状态不佳，我方不提供免费售后服务。
6.细胞状态正常时，应尽快冻存细胞保种，冻存后应随机抽取一支检测冻存效果。
我
方不对客户冻存细胞导致死亡负责，客户冻存细胞死亡不提供免费售后服务。
Notice：
客户收到细胞有任何疑问请及时致电我们，细胞收到后1周内没有任何电话，或其他形式回访，默认为细胞质量没问题，之后出了任何问题不给予免费售后。
细胞免费售后只提供一次，若重发后再次培养死亡不再免费补发，细胞收货时已经死亡或密度不足的除外。