双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌（Lactobacillus）是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于人体的肠道、口腔、阴道等部位，对人体具有重要的生理功能和健康益处。
在实验室中，通过培养双歧杆菌，我们可以进一步研究它的特性、代谢途径、功能以及应用价值。
以下是一个关于双歧杆菌实验操作的示例，包括菌株的分离、培养、保存和鉴定等步骤。
1.菌株的分离和纯化从人体标本或商业产品中获得含有双歧杆菌的样品，例如：粪便、口腔漱口水、乳制品等。
将样品悬浮于无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）中，并进行10倍序列稀释。
将适量的悬浮液均匀涂布在含有适宜培养温度和营养成分的琼脂平板上。
经过孵育后，从单个菌落中刺取分离得到的单菌株。
2.菌株的培养将分离得到的单菌株接种到含有适宜培养基（如MRS培养基）的液体培养物中。
培养条件包括适宜的温度（通常在30-37℃之间）、PH值和氧气供应等。
静态培养通常在试管中进行，而摇床培养则需提供常规的摇床条件。
3.菌株的保存为了长期保存双歧杆菌菌株，常常采用冷冻保存和干燥保存。
其中，冷冻保存利用甘油或液氮冷冻对菌株进行保藏。
干燥保存是将菌株培养物在适当的保护剂（如蔗糖、蛋白质）的作用下，通过真空或喷雾冻干处理。
冷冻保存要求贮存于低温（-70℃至-80℃）环境中，而干燥保存则可在室温下进行。
4.菌株的鉴定确定菌株是双歧杆菌的一种，需要通过鉴定方法进行确认。
传统的鉴定方法包括菌落形态观察、革兰氏染色、形态学特征、生理和生化试验等。
另外，分子生物学技术也可以用于鉴定双歧杆菌，如PCR扩增特定的双歧杆菌基因片段或测序分析菌株的16SrRNA基因序列。
5.功能研究在鉴定菌株后，可以进一步研究双歧杆菌的功能特性和代谢途径。
例如，可以采用培养基成分和环境参数的调整来研究双歧杆菌的生长条件。
也可以评估双歧杆菌在产生保健益生素、抑制致病菌、增强免疫等方面的功能。
总结：通过以上的实验操作，可以实现对双歧杆菌菌株的分离、培养、保存和鉴定。
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【摘要】为丰富发酵剂及益生菌菌种资源,从内蒙古阿拉善盟采集7份新生婴儿粪便样品,在传统细菌分离方法的基础上,通过添加莫匹罗星锂盐和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)改良基础培养基,快速有效地分离获得双歧杆菌.结合全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种.结果共分离获得6株双歧杆菌,其中3株动物双歧杆菌,2株青春双歧杆菌,1株短双歧杆菌.试验验证甘油浓度为70%时冷冻保藏效果最佳.%In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources, faeces collected from sev-en infants(Alashan, Inner Mongolia) were investigated. On the basis of traditional bacterial separation method, Mupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium, to separate the bifidobacterium effectively. Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacteri-um. In total, six strains of bifidobacterium were obtained from infacts' faeces, among which three strains were Bifidobacterium lactis, two strains were Bifidobacterium adolescentis, and one strain was Bifidobacterium breve, and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70%glycerol.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)023【总页数】6页(P171-176)【关键词】双歧杆菌;全自动微生物分析系统;API20A试剂条;冷冻保藏【作者】乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【作者单位】内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500【正文语种】中文双歧杆菌是存在于人体肠道中的益生菌，在长期进化过程中与宿主形成了互惠共存的关系，具有改善肠道健康、增强免疫功能、防治便秘腹泻、缓解乳糖不耐、促进营养物质吸收、降三高和抗肿瘤等多种保健功能[1-4]。
双歧杆菌分离培养鉴定
1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36°C±1°C。
2.2气相色谱仪配FID检测器。
2.3冰箱：2C〜5C。
2.4天平：感量0.1g。
2.5无菌试管：18mm X180mm、15mm X100mm。
2.6无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200口L〜1000口L)及配套吸头。
2.7无菌锥形瓶：500mL、250mL。
2.8显微镜2培养基和试剂3.1BS培养基3.2PYG培养基3.3TPY培养基3.4NPNL培养基3.5X-GAL培养基3.6氟化钠：化学纯。
3.7碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。
3.8果糖-6-磷酸盐：化学纯。
3.9盐酸羟胺(HydroxyLamine-HCl)：化学纯。
3.10三氯乙酸(TCA):化学纯。
3.11三氯化铁(FeC13・6H2O)：化学纯。
3.12甲醇:分析纯。
3.13三氯甲烷：分析纯。
3.14硫酸：分析纯。
3.15冰乙酸：分析纯。
3.16乳酸：分析纯。
3.17乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1mol/L。
3.18乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3.19乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中,加水至刻度，标定，标定方法见附录B.2,此溶液浓度约为1mol/L。
3.20乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取lg双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。
双歧杆菌的分类鉴定
双歧杆菌的分类鉴定双歧杆菌是一种常见的乳酸细菌，具有很多种类，其分类鉴定过程是微生物学中一个重要的部分。
下面将按照流程分步骤阐述双歧杆菌的分类鉴定。
第一步：样本收集首先，需要从目标样品中收集双歧杆菌。
样品可以来自不同的来源，包括人体肠道、动物肠道、泥土、水样等。
在收集样品时，要严格按照规定的方法进行，避免污染和杂质的干扰。
第二步：预处理样品收集到的样品可能包含大量杂质和其他微生物。
因此，在进行分类鉴定之前，必须对样品进行预处理。
处理过程中，需要对样品进行消毒、滤液、大肠杆菌的去除等。
只有经过预处理后的样品才能进行后续的分类鉴定工作。
第三步：菌落分离通过培养，将目标微生物分离出单个菌落。
在分离时要保证菌落的纯度，尽可能地去除其他细菌的干扰。
为了提高鉴定的准确性，建议在分离时同时留取多个单克隆，每一个都应该经过相同的操作来验证。
第四步：生理生化特性判定生理生化特性是鉴定双歧杆菌的关键部分。
常见的生理生化特性包括菌种的形态特征、代谢途径、对培养基的需求等。
对菌落气味、颜色和形态等方面进行观察，测量它们的生长特性。
这一步是识别双歧杆菌是否出现新物种的关键所在。
第五步：分子生物学检测为了提高鉴定的准确性，建议在第四步生理生化特性判定后进行分子生物学检测。
这包括测序、PCR等操作。
通过这些操作可进一步鉴定目标细菌的种类、品种。
在这一步中借助了现代的科研技术，为双歧杆菌的分类鉴定提供了非常有力的支持和助力。
综上所述，双歧杆菌的分类鉴定涉及许多步骤，包括样品的收集和预处理、分离菌落、生理生化特性分析和分子生物学检测等。
这一过程需要技术经验和实验操作配合，具有较高的技术难度和风险性。
只有通过严格流程的操作和准确安排，才能确保双歧杆菌的分类鉴定具有科学性、合法性和完整性。
食品中双歧杆菌检验及鉴定方法研究
双歧杆菌是一种需要厌氧培养的革兰氏阳性杆 菌，是食品中典型的益生菌，具有调节肠道促消化、预 防腹泻、减少便秘、抗过敏、抗肿瘤及改善营养等特殊 生理功能，被作为一种活性菌添加到不同食品中。已 有研究表明，当食品中双歧杆菌含量在106 CFU/mL以 上时,才能发挥其应有的生理功效［1-2］遥双歧杆菌活菌 数量及菌株类别是判断食品质量好坏以及是否具有 保健功能的重要指标。市面上销售添加有双歧杆菌的 水果糖、发酵乳及保健食品的品种越来越多，厂家添 加活菌数量不一,有必要对这些含益生菌产品进行风 险监测与鉴定。自1899年法国学者Tissier从母乳营 养儿的粪便中分离出双歧杆菌开始，双歧杆菌已发现 有32个亚型［3］,其鉴定手段也从形态学描述鉴定发展 到分子进化树％本研究依据《食品安全国家标准食 品微生物学检验双歧杆菌检验》(GB 4789.34—2016) 对食品中双歧杆菌做活菌含量计数检验并鉴定,采用 生化鉴定API法、全自动细菌鉴定仪及分子生物学 Riboprinter核糖体分型法对食品中双歧杆菌的鉴定进 行比较研究。Riboprinter核糖体分型技术法，是使用限 制性内切酶(如EcoR I、PvuII、PstI等)消化目标菌基 因组产生基因片段，再把该片段经过电泳分离后转移
2结果与分析 2.1样品测定结果
如表1所示,发酵乳只有50%的产品计数结果达 到1.0x106CFU/g ,而发酵剂、奶粉、糖果和益生菌固体 饮料计数结果大多数能达到1.0伊106 CFU/go由此得 出,双歧杆菌在固体食品中的含量较稳定 ,在发酵乳 中含量不稳定,易受到保存时间、温度等条件的影响° 2.2形态分析
分型法能准确鉴定出双歧杆菌的种名，是这次研究中鉴定双歧杆菌的最佳方法。
关键词双歧杆菌；检验;鉴定
中图分类号TS207.3 文献标识码A
双歧杆菌保藏性能研究
《 品研究 与开发｝ ０２年 ６月第 ２ 卷第 ３期 食 ２０ ３ 由于可 食 性包 装 膜 能 有 效 地解 决 保 鲜 与环 境 的问题 ，因此 ，用可食性包 装代替 塑 料包装 已成 为 当前 包装 行业 的一太热 门技 术。 目前 ，世界 各 国都 在 争相 投入资金 ，加 紧开展这 方面 的研究工 作 。现 在， 已取得 了可喜 的成果 ， 国 “ 美 纳蒂克 ” 发研 制 开
７ ５
可食性包 装被开 发 研制 出来 ，可食性包 装 膜会有更
加广 阔的应用前 景 。 参 考 文 献
１ Ｇｏｎ ａ ｄ Ｎ Ｇｕｄ ｅ ｔＢ ｏ— ｐ ｃ ａ ｅ ｇ： ｔｃｈ ｌ ｇ ａ ｄ ｐ ｌ ｔｒ ｈ ｒ Ｂｉ ａｋ ｇ ｎ ｅ ｍｏ ｏ ｙ ｂ ｒ＞
ｐ ｒｉｓ。 ｇｒｃ ｌｕ ａ ｒｇｎ ｎ Ｆｏ ｄ Ｐａ ｋ ｇｎ ｎ ｅｅ ｖ — ｅ ｔｅ ｆａ ｉｕｔ ｒ ｌｏ ｉｉ Ｉ ｏ ｃ ａ ｉｇ ａ ｄ Ｖｒｓ ｒ ａ
食品中病原菌和微生物引起的食 品腐烂。可食性包
装膜 是一 种 目前 最有效 的 ＭＡＰ保 鲜技 术 ，且降低 包 装材料 的费用 ，投 资花费 远低于其 它保鲜 技术 的 花费 ， 信 在不久 的将来 ， 相 会有更 多 的 ， 能更好 的 性
ａ ｄ ｏ ｉ ｅ ｒｄｈｅＰ ｃ ａ ｉｇｍａｅ ｉｓ 【 ｖｅ Ｆ ｏ ｎ ／ ｒｂｏ ｇａ ａ ｌ ａｋ ｇｎ ｔｒ ｌ Ｒｅ ｉ ｄ ａ ｗ】 ｏ ｄＡｄ
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双歧杆菌的分离培养及鉴定
厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。
初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH8.0~8.5不生长。
其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。
双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。
该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。
该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
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杆菌是该类产品开发应用的基础。 不同细菌具有各自特有的酶系 统 ， 对各 种营养物 质的代谢能力也不尽相同， 通过生理生化 反 应 测试 区 分鉴别细菌的种属是细菌鉴定的最原始手段。全自动 微生物分析系统， 即是由传统检测鉴定技术 与现代 计 仪器自动鉴定的技术[6-7]。 目前， 梅里埃 Vitek 2 Compact 全自动微生物分析系统， 西门子 MicroScan Walk Away 96 plus 全自动微生物鉴定系统， 基 质辅 助 激 光 解 析 电 算机技术相结合，运用概率最大近似 值 模型 法 计算 ，
ization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS） 多方面， 在食品工业中的应用也正在兴起[8-11]。代敏等 采 用 常 规 生 化 鉴定 法 、 全自动微 生物分析系 统 鉴定 法 和 16S rDNA 序列 分析 法 对 120 株 奶 牛乳 腺 炎病 原菌 进行鉴定， 比较分析了 3 种鉴定方法的优缺点[12]。 研究
《可用于食 。在食品领域， 卫生部文件将其列入
及 《可 品的菌种名单》 、 《可用于保健食品的菌种名 单》 ，现今 市 场 上 已有 益生 用于婴幼儿食品的菌种名单》 益 生 菌 奶 粉 奶 片 等 多种品 菌 发酵 饮 料、 益生 菌酸 奶 、 类。在临床上， 双歧杆菌活菌制剂已经广 泛应用 于腹 泻和便秘等肠胃疾病的治疗 。双歧杆菌类 益 生 菌产 品日益得到消费者的追捧， 分离筛选一些 优 秀 的 双歧
品加工、 乳酸菌研究。
母智深 （1968—） 乳与乳制品 * 通信作者： ， 男， 教授， 博士， 研究方向： 加工、 食品微生物、 食品功能性成分。
en infants（Alashan， Inner Mongolia）were investigated. On the basis of traditional bacterial separation method，
双歧杆菌是存在于人体肠道 中 的益 生 菌， 在 长期 进化过程中与宿主形成了互惠共存的关系， 具 有 改善 防治便秘腹泻、 缓 解 乳糖不 肠道健康、 增强免疫功能、 耐、 促进 营养物质吸 收 、 降三 高 和 抗 肿瘤 等 多种 保 健 功能
作 者 简介： 乌云 （1988—） ， 女 （蒙古） ， 工程 师 ， 硕士 ， 研究方 向 ： 乳制 （201502056） 基金项目： 内蒙古科技项目
[5]
离飞行时 间 质 谱 仪 （matrix-assisted laser desorption/ion卫生防疫、 疾 病 控制 等 诸 开 始 普遍 应用 于 辅 助 医疗 、
摘 基础上， 通过添加莫匹罗星锂盐和 X-Gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） 改良基础培养基， 快速 有 效 地分 离 获 双歧杆菌， 2 株青春双歧杆菌， 1 株短双歧杆菌。 试验验证甘油浓度为 70 %时冷冻保藏效果最佳。 要： 为丰富发酵剂及益生菌菌种资源， 从内蒙古阿拉善盟采集 7 份新生婴儿粪便样品， 在传统细菌分离方法的
Abstract： In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources， faeces collected from sevMupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium， to separate the bifidobacterium effectively. um. In total，six strains of bifidobacterium were obtained from infacts' faeces，among which three strains were breve， and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70 % glycerol. preservation Bifidobacterium lactis ，two strains were Bifidobacterium adolescentis ，and one strain was Bifidobacterium Key words：Bifidobacterium；automatic microorganism analytical system；API20A reagent strip；freezing Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacteri-
生物工程
DOI： 10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.033
Food Research And Development
食品研究与开发
2017 年 12 月 第 38 卷第 23 期
171
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究
乌云， 刘红霞， 李洪亮， 母智深* （集团） （内蒙古蒙牛乳业 股份有限公司， 内蒙古 呼和浩特 011500）
结果共分离获得 6 株双歧杆菌， 得双歧杆菌。 结合全自动微生物分析系统和 API20A 试剂条鉴定菌种。 其中 3 株动物 关键词： 双歧杆菌； 全自动微生物分析系统； API20A试剂条； 冷冻保藏
Isolation，Identification of Bifidobacterium and Preserngolia Mengniu Dairy （Group）Co.， Ltd.， Huhhot 011500， Inner Mongolia， China） WU Yun， LIU Hong-xia， LI Hong-liang， MU Zhi-shen*