猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与ORFs3～7基因特性研究
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析
第29卷第1期2009年2月郑州牧业工程高等专科学校学报Jour nal of Zhengzho u Co lleg e of A nimal Husbandry Eng ineer ing V o l.29N o.1February 2009收稿日期:2006-12-15基金项目:河南省基础与前沿技术研究计划项目(072300430060),河南省重点科技攻关(072102130023),河南省高校科技创新人才支持计划作者简介:曹素芳(1973- ),女,四川武胜人,博士,副教授。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析曹素芳,王 岩,肖松云,唐桂芬(郑州牧业工程高等专科学校,河南郑州450011)摘要:采用RT -P CR 方法对疑似P RRS 阳性病料进行克隆和测序获得了O RF7基因片段。
序列分析结果表明获得的O RF7基因序列不存在缺失现象。
与美洲型代表毒株VR -2332的核苷酸序列的同源性为9113%,氨基酸同源性为9216%;与我国最早的PRR SV 分离株CH -la 相比,核苷酸同源性为9315%,氨基酸同源性为9216%;与我国高致病性P RRSV 毒株SD-Z Q 的核苷酸同源性最高为9811%,氨基酸只有两个不同,同源性为9813%;与本省的Hn-1/06毒株的核苷酸同源性为9713%,氨基酸同源性为9715%;与2004年分离的F J-2株与O RF7基因的核苷酸差异稍大为8514%,氨基酸同源性为8816%;与欧洲型分离株LV 株和N-34株ORF 7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为4111%和40%,氨基酸同源性为4711%和4716%。
表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。
关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;O RF7基因;变异中图分类号:S852165 文献标识码:A 文章编号:1008-3111(2009)01-0001-03Variation Analysis of Porcine Syndromeand Reproductive and Respiratory Virus ORF 7G eneCAO Su-fang,WANG Yan,XIAO So ng -yun,T ANG Gui-fen(Zhengzhou Co llege o f Animal Husbandry Eng ineering ,H enan Zheng zho u 450011,China)Abstract:T he O RF7genes of patho log ic materia l suspected PR RS w as amplified by R T -PCR 1T he product w as se -quenced after clo ning into pM D18-T v ecto r 1T he sequence was analysed by D NA M A N softw are and com par ed w ith those of V R-2332,CH -la,SD-ZQ ,H n-1/06,F J-2,L v and N -341it show ed that the nucleot ide sequence ho -molog y w ere 9113%,9315%,9811%,9713%,8514%,4111%and 40%respectiv ly 1And the deduced amino acide ho -molog y w ere 9216%,9315%,9813%,9715%,8816%,4711%and 4716%respectivly 1I t indicated that the iso late strain w as related to t he N or th Amer ican P RRSV genoty pe 1A mo ng them the nucleotide sequence and amino acide ho -molog y both wer e the hig hest comparing w ith highly pat ho genic po rcine r epr oductive and r espir ator y syndr ome vir us SD-ZQ strain 1Key words:Po rcine repro ductiv e and respirato ry syndr ome vires;O RF7gene;v ariat ion analy sis猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syn -drome,PRRS)的病原,主要引起母猪早产、流产等繁殖障碍,仔猪、育肥猪呼吸困难[1]。
猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析
猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析吴国平;刘冰心;郭川;曹敏杰;苏文金【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2006(011)003【摘要】根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了1对特异性引物P1/P2,用RT-PCR扩增了PRRSV福建毒株FJ-1和FJ-2的全长核衣壳蛋白基因(ORF7),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,提取阳性重组质粒进行序列测定与分析.结果表明:FJ-1和FJ-2毒株ORF7基因均为372 bp,编码123个氨基酸,与美洲型参考毒株VR-2332及欧洲型参考毒株LV的核苷酸同源性分别为95.16 %,94.35 %和61.40 %,60.65 %,其推导的氨基酸同源性分别为95.93 %,95.12 %和56.49 %,55.73 %. 研究表明,福建流行的FJ-1和FJ-2属于美洲型PRRSV毒株.【总页数】6页(P217-222)【作者】吴国平;刘冰心;郭川;曹敏杰;苏文金【作者单位】集美大学水产学院、水产生物技术研究所,福建,厦门,361021;厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021【正文语种】中文【中图分类】S852.65;Q78【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达[J], 梁望旺;徐涤平;熊忠良;刘泽文;杨克礼;伍锐;邓均华;段正赢;余爱冬;唐文娟2.杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒分离及其ORF6、ORF7基因的序列分析 [J], 李冰;卢赫;冯方周;丁壮3.11株猪繁殖与呼吸综合征病毒中国分离株NSP2、ORF5、ORF7基因的序列分析 [J], Li J;吴艳4.猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析 [J], 高云;杨汉春5.猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF7基因序列分析 [J], 樊振华; 刘文俊; 武守艳; 吴忻; 孟帆; 焦福林; 薛翼鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及dna疫苗的初步研究
从绿头鸭、珍珠鸡等的粪便中也分离出ＰＲＲＳＶ。
定期的向猪场中引进易感猪，导致猪群整体的免疫水平下降；猪舍的饲养密度过高，猪只流动过于频繁往往会加剧ＰＲＲＳＶ剧了ＰＲＲＳ的持续性感染状况。
因此，造成ＰＲＲＳ持续性感染的因素是多方面的。
而ＰＲＲＳ持续性感染的存在给我们防制ＰＲＲＳ带来了很大障碍，要扑灭ＰＲＲＳ必须采取综合性的防制措施。
２ＰＲＲＳＶ分子生物学研究２．１ＰＲＲＳＶ分子生物学特征概述ＰＲＲＳ属于尼多病毒目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ），与鼠乳酸脱氢酶升高症病毒（ＬＤＶ）、马动脉炎病毒（ＥＡＶ）矛ＩＩ猴出血热病毒（ＳＨＦＶ）Ｈ属于动脉炎病毒科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｄａｅ）［２０］ｏ根据抗原性的差异可将ＰＲＲＳＶ分为两个主要基因型，即以ＬＶ为代表的欧洲型和以ＶＲ一２３３２为代表的美洲型。
两个基因型全基因组序列差异性为４０％。
ＰＲＲＳＶ病毒粒子呈球形，具有囊膜结构，内有一个呈二十面体对称的核衣壳。
核衣壳直径为２５～３５ｎｍ，由Ｎ蛋白包裹基因组ＲＮＡ构成。
完整病毒粒子直径５５－６０ｎｍ。
病毒对有机溶剂如氯仿、乙醚等敏感。
完整ＰＲＲＳＶ病毒粒子没有血凝活性，不凝集猪、绵羊、山羊、牛、兔、豚鼠、鸡、鸭、鹅和人Ｏ型红细胞，但病毒用非离子除垢剂和脂溶剂（乙醚和吐温．８０等）处理后，则可凝集小鼠的红细胞，同时也丧失了感染性。
ＰＲＲＳＶ的热稳定性差，对温度和湿度比较敏感，５６。
Ｃ４５ｍｉｎ可以将其灭活。
ＰＲＲＳＶ在潮湿的环境具有具有较好的稳定性，而在干燥的条件下病毒迅速失去感染性。
ＰＲＲＳＶ在小于ｐＨ５或大于ｐＨ７的条件下，其感染力可下降９０％以上【２１｜。
ＰＲＲＳＶ另一个重要的生物学特性是对巨噬细胞（ＰＡＭ）的亲嗜性，ＰＡＭ是首选靶细胞，病毒对多种巨噬细胞具有亲噬性，包括猪肺泡巨噬细胞（ＰＡＭ）、外周血单核细胞、肺血管内巨噬细胞（ＰＩＭ）等。
接种ＰＡＭ后２４～７２ｈ可观察到特异的ＣＰＥ。
病毒在猪脾巨噬细胞、脑小胶质细胞以及传代细胞系ＭＡ一１０４、Ｍａｒｃ．１４５、ＣＬ２６２１和ＣＲＬｌｌｌ７等均可复制。
猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学研究进展
猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学研究进展作者：于忠良，温书香，安利民来源：《畜牧兽医科学》 2018年第1期摘要：本文主要对猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学特点进行详细叙述，以期为相关研究人员对此病毒有更深入的了解。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病；理化性质；基因组结构中图分类号：S858. 28文献标识码：BDOI：10. 3969/j．issn．2096-3637. 2018. 01. 0101猪繁殖与呼吸综合征病毒分类和结构猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)隶属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。
在电子显微镜下，猪繁殖与呼吸综合征病毒呈椭圆形或者类似球型。
病毒粒子的直径在48到83nm，核衣壳的直径在25到30nm，囊膜表面有纤突。
PRRSV病毒的遗传物质为单链RNA。
2猪繁殖与呼吸综合征病毒的理化性质1992年Benfield等人报道称猪繁殖与呼吸综合征病毒在氯化铯中的密度在1.13到1.19g/cm3。
PRRSV病毒对热源比较敏感，在高温条件下可以迅速死亡。
在低温条件下，较长时间也可以灭活。
如在37℃或者56℃不超过th均可以灭活。
PRRSV能够在血清中维持活力，在-70℃的条件下仍然保持感染性，在4℃的条件下至少存活1个月。
PRRSV在潮湿的环境中活性和感染力都比较强，而在干燥的环境中活性非常低，容易失活。
PRRSV是有囊莫病毒，根据相似相容原理，该病毒对有机溶剂比较敏感。
3猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组结构猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因组序列已经全部测完，根据不同地区分离到的PRRSV病毒核酸的序列差异，Allende等人在1999年将猪繁殖与呼吸综合征病毒分为2个基因型，即欧洲型和美洲型。
1995年，我国养猪场爆发流行猪繁殖与呼吸综合征病，经过测序发现我国流行株是美洲型。
2007童光志等人报道，在2006年我国爆发流行的猪繁殖与呼吸综合征病病毒仍然是美洲型。
PRRSV基因组病毒与其它动脉炎病毒科的病毒类似。
猪繁殖与呼吸综合征病毒不同毒株鉴别检测方法研究进展
动物生产的免疫档案，并对本地各类猪可能感染的疾病进行调查，做好猪的进行免疫接种工作。
3.2 做好药物保健工作，增强猪群抗病能力规模越大的养殖场越怕遇见大型的传染类疾病，即饲养人常提到的猪瘟。
猪瘟一旦发生想要消灭则太难，所以饲养人应防患于未然，首先做好相应的防疫接种工作，其次是要做好药物保健工作，进一步加强猪的抗病能力。
总之，规模猪场保育猪养殖管理过程，要结合具体工作实际，不断制定完善的养殖模式，以提高管理能力，进一步保证养殖经济效益。
摘要：本文就当前我国猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不同毒株鉴别检测方法的研究与应用进展进行综述，对提升我国猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的综合防控能力具有一定的参考价值。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；不同毒株；鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒具有欧洲型和美洲型两个基因型，欧洲型毒株一般不引起严重的临床症状，但易导致混合感染，美洲型毒株可引起严重的临床症状以及感染猪的大批量死亡。
自1995年开始美洲型P R R S V在我国开始流行，流行期间不断发生变异，2006年以J X A1毒株为代表的高致病性美洲型P R R S V 在我国开始流行，高致病性P R R S V的致病性方面发生了很大变化，引起来了猪群的大批量死亡，虽然短时间内即开发出了相应的商品化疫苗，但一直未能完全控制高致病性P R R S V 的流行，2013年以来，一种致病性介于经典株与高致病性毒株之间的美洲型P R R S V开始流行，由于该毒株与美国N A DC30毒株的同源性很高，因此被称为NADC30-like毒株，2011年我国又发现了欧洲型P R R S V感染的病例。
目前，我国PRRSV的流行毒株仍以美洲型为主，但经典株、高致病性株、NADC30-like毒株并存，同时欧洲型的感染时有发生，使PRRSV的鉴别诊断和防治难度加剧。
本文综述了PRRSV不同毒株鉴别检测方法的研究与应用进展，为提升我国PRRSV的综合防控能力提供参考。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起怀孕母猪发热、厌食、早产、晚期流产、死胎、弱仔和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪的呼吸系统症状和高病死率的接触性传染病。
该病于1987年首次在北美发现[1]，1991年欧洲发生本病,并在荷兰首次分离到PRRSV，命名为Lelystad病毒(LV) [2]；美国于1992年分离PRRSV，命名为VR-2332[3-4]；郭宝清等[5]于1996年首次从我国疑似PRRS病猪中分离到PRRSV，从而证实了该病毒在我国的存在。
本病可经水平和垂直两种方式传播，其流行已给养猪业造成了巨大的经济损失。
PRRSV是一种有囊膜的正股单链RNA病毒，与马动脉炎病毒（EAV）、鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV）和猴出血热病毒（SHFV）同属于最近分类的动脉炎病毒科(Arteriviridae)[6]。
PRRSV病毒基因组长约15kb，含8个开放阅读框架(ORFs)，LeCall等［7］研究表明，8个开放阅读框架中ORF7高度保守，即使是在体内传代也很少引起ORF7的核苷酸序列变异。
此外，ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）具有良好的免疫原性及反应原性[8-9]，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白。
因此，N蛋白常可作为诊断抗原来检测PRRSV。
本实验以ORF7基因为研究对象，应用分子克隆技术对ORF7基因进行扩增、构建原核表达载体、序列分析，为今后进一步深入研究该片段奠定基础。
1材料1.1病毒、细胞及载体PRRSV毒株（北京分离株）、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析张永富1,2,3，马国文1，刘月焕2，刘永宏2,4，李明刚3，张秋雨3，刘锋3(1.内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028000；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100089；3.北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司,北京100043；4.内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特010018)摘要：根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因序列，设计合成一对引物，应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF7基因（N基因）。
猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗研究的开题报告
猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗研究的开题报
告
1、项目背景
猪繁殖与呼吸综合征是一种由家猪繁殖呼吸道综合征病毒（PRRSV）引起的高传染性疾病，其症状包括呼吸困难、流涕、发热、疲劳等。
该疾病对猪的健康和养殖业
产生了重大影响，致使猪的生长速度减慢，肉质和产量受到影响，经济损失极大。
目前，传统的疫苗已经无法完全预防和控制PRRSV的感染，因此发展新型基因工程疫苗是解决这一问题的关键。
2、研究目的
本项目旨在研究猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗的制备、评估和应用，为预防和控制该疾病提供新的解决方案。
3、研究内容
（1）PRRSV毒株的筛选：根据不同地区PRRSV毒株的差异，筛选出适合我国地域的PRRSV毒株。
（2）疫苗构建：使用基因工程技术，将PRRSV毒株的变异抗原基因序列克隆至适宜的表达载体中，并经过多次酵母重组和转染，产生新型基因工程疫苗。
（3）疫苗评估：通过实验室和动物检测评估新型基因工程疫苗的免疫效果和安
全性。
（4）疫苗应用：在临床应用中进行疫苗免疫实验，并根据实验结果对其疗效和
投入效益进行分析。
4、预期成果
通过本项目的研究，将得到猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗的制备技术，为解决这一疾病给我国农业发展带来的困境提供技术支持。
此外，新型基因工程
疫苗的开发还将为家畜养殖业的信息化、智能化和产业升级提供新的理论和实践支持。
猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控机制研究的开题报告
猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控机制研究的开题报告标题：猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控机制研究研究背景和意义：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）是一种造成猪医学上重要疾病的病毒，其主要特点是严重影响了猪价值链的发展，导致了严重的经济损失。
PRRSV的生物学特性和致病机制，以及病毒-宿主相互作用机制研究一直是当前研究的热点和难点，其对于控制和预防PRRS疾病具有重要的理论和应用价值。
研究内容和目标：本研究项目通过综合运用定量PCR、免疫印迹、RNA测序和生物信息学分析等手段，重点研究PRRSV的转录调控机制，从而深入探究PRRSV感染过程中的宿主细胞反应和病毒感染逃逸机制。
旨在揭示PRRSV与宿主细胞相互作用的分子机制，为进一步阐明PRRSV的致病机理、防制和治疗提供重要的基础理论支撑。
研究方法和流程：1. 构建PRRSV-AY病毒株感染PAMs、Marc-145和CHO等不同细胞系。
2. 系统研究不同细胞系PRRSV感染蛋白表达、细胞凋亡等基本生物学特性，并利用RNA测序技术进行以侵染后3、6、12、24小时为时间点的转录组测序。
3. 利用生物信息学和统计学分析转录组测序数据，筛选出差异表达基因，利用KEGG等通路富集分析揭示PRRSV感染过程中的重要信号通路。
4. 利用免疫印迹、定量PCR等方法检测有代表性的转录组富集通路成员的表达水平，分析其受PRRSV感染影响的具体机制。
5. 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对感染过程中的典型基因敲除，验证其对PRRSV感染逃逸和宿主细胞免疫反应的影响。
预期结果：通过对PRRSV的转录调控机制进行深入研究，揭示病毒感染和宿主反应的分子机制，为进一步阐明PRRSV的致病机理和防治提供新的理论和应用基础。
同时，本研究也具有一定的参考价值，可为其他病毒的研究提供方法借鉴和理论支持。
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收稿日期:2006-03-01基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270990);江苏省高新技术资助项目(BG2002317);教育部优秀青年教师资助项目(20030307012)作者简介:李玉峰(1974-),男,助教,博士。
*通讯作者,E -mail:jiangp@nj 猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与ORFs3~7基因特性研究李玉峰,姜 平*,蔡宝祥,简中友 (南京农业大学动物医学院,江苏南京210095)摘要:从江苏某种猪场自北美引进的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体阳性临床健康仔猪血清中分离到1株病毒,经生物学特性测定、血清学试验、分子生物学鉴定、电镜观察及猪体致病性试验,鉴定为美洲型PRRSV 类弱毒株。
应用RT -PCR 技术对该分离株ORFs3~7结构蛋白基因进行扩增、克隆与cDNA 序列分析,结果表明该分离毒株的ORFs3~7基因序列与PRRSV -MLV 弱毒株的相应基因同源性均达99.0%以上,属美洲型毒株。
关键词:猪繁殖与呼吸综合征;弱毒株;结构蛋白;序列分析中图分类号:S852165 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2008)01-0005-04Isolation and genetic characterization of one attenuated strain R 98of porcine reproductive and respiratory syndrome virusLI Yu -feng,JIANG Ping *,C AI Bao -xiang,JIAN Zhong -you (College o f Animal Medicine,Nan jing Agriculture University ,Nanjing 210095,China)Abstract :A strain of vi rus was isolated from serum of health piglets with antibody to porcine reproductive and respiratory syn -drome virus(PRRSV),which were imported from North American.The isolated virus was identified as an attenuated American type virus of PRRSV through biological properties,serum assay,molecular biologic identification,electron microscopic appearance and pathogenicity for piglet.The structural protein genes ORFs3-7were amplified by RT -PCR and sequenced.The results showed that the seq uence of thi s isolate had high homology with that of PRRSV -MLV and which can amount to above 99%,demonstrating that R98may be evolved from attenuated strain of North American PRRSV. Key words :PRRS;attenuated strain;structural protein;sequence analysis *Corresponding author ,E -mail:jian gp @n 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是目前危害世界养猪业的重要病原之一,主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状。
该病毒属于动脉炎病毒科,动脉炎病毒属,基因组为单股正链RNA,含有9个开放式阅读框(ORFs)[1]。
其中ORFs2~7编码病毒的结构蛋白,ORFs2~5编码病毒的糖基化蛋白GP2~GP5,ORF6编码病毒的基质蛋白M,ORF7编码病毒的核衣壳蛋白N [2-3]。
由于该病毒属于RNA 病毒,因此在复制过程中存在高度的变异性。
Mur -taugh 等[4]比较了北美毒株ATCCVR -2332和欧洲毒株Lelystad 的ORFs2~7推导的氨基酸序列,这2个病毒ORFs2~7的氨基酸同源性为58%~78%[3]。
对从美国中西部分离的10株PRRSV 的ORFs2~7测序后进行核苷酸比较,同源性为92%~97.5%[5]。
PRRSV 存在高度变异,目前至少有数十种基因亚型。
针对该病毒的疫苗有活疫苗和灭活疫苗,但免疫效果还不十分理想。
通过人工方法进行选育弱毒疫苗的可行性不强,因此从自然界中筛选有针对性强、保护性好的弱毒株显得十分必要。
1 材料与方法1.1 细胞质粒和菌株 Marc -145细胞,由美国Io wa 州立大学惠赠;pcDNA3.1和DH5A 由本实验室保存。
1.2 主要试剂 Bam H I 、EcoR I 、MiniBEST Plasmid Purification Kit 和rTaq DNA 聚合酶等购自TaKaRa 公司,Oligo(dT)12-18、dNTPs 和M -MLV 购自Promega 公司,TRIZOL Reagent 购自Invitrogen 公司,凝胶回收试剂盒购于南京生兴生物公司,引物由大连宝生物工程公司合成。
1.3试验猪江苏某种猪场从加拿大引进的PRRSV 抗体阳性临床健康仔猪,用于病毒分离。
30日龄PRRSV阴性健康仔猪和怀孕70~80d PRRSV阴性健康母猪购自江苏某猪场。
1.4病毒分离与纯化按常规方法进行,将猪血清无菌处理后接种于Marc-145细胞单层,出现75%病变后收获病毒,然后取适当稀释倍数的病毒接种长满单层的Marc-145细胞进行噬斑纯化,连续纯化3次。
纯化后病毒的传代代次分别记为F2~F10。
1.5病毒生物学特性测定1.5.1耐酸碱性按常规方法,将分离的病毒液(DMEM营养液内),用HCl和NaOH溶液调整pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,4e处理1h,测定病毒滴度,判断耐酸碱性。
1.5.2耐热性按常规方法,将分离的病毒液(DMEM营养液内),分别放置于4、10、25、37、40和56e处理1h,测定病毒滴度,判断耐热性。
1.6TCID50测定用DMEM维持液将纯化后的第1~10代病毒作10倍梯度稀释,然后分别接种于长满Marc-145细胞单层的96孔细胞培养板,每个稀释度接种5个孔,每孔接种100L L。
同时设定两排孔加入维持液做对照。
5%C O2,37e静置培养5d,观察病变,按Read-Muench法,计算病毒TCID50。
1.7间接免疫荧光试验在长满Marc-145细胞的96孔细胞板上分别接种分离病毒,同时设定空白对照;在37e、5%C O2温育24~36h;弃去营养液,用PBS洗涤细胞,然后弃去PBS;加入150L L4e的冷丙酮(80%丙酮,20%双蒸水)到96孔细胞板的每1孔中,把细胞板放置4e30min;弃去丙酮,在室温下干燥96孔板;加入1B500稀释的美洲型PRRSV单克隆抗体JP24(美国D.A.Benfield和E.A.Nelson博士惠赠),每1个稀释度接种2个孔;50L L/孔,盖好盖子后,在湿盒内37e温育30min;在纸巾上倒置使细胞板变干,用200L L的PBS洗涤6次;加入50L L 的1B100稀释的FI TC标记羊抗鼠IgG到每1个孔中,在湿盒内37e温育30min;移去孔内液体,在纸巾上使细胞板干燥,用PBS洗涤4次;于荧光显微镜下观察。
1.8病毒中和试验采用固定抗体稀释病毒法,将PRRSV-R98毒株病毒液用无血清DMEM营养液作10倍梯度稀释,加入等量PRRSV血清抗体,同时设PRRSV阴性血清对照,混合后37e作用1h;分别接种于长满Marc-145细胞单层的96孔板,100L L/孔,每一稀释度4孔,37e5%C O2培养5d,每日检查CPE,测定病毒TCID50,并计算中和指数。
中和指数=中和组病毒TCID50/对照组病毒TCID50,当中和指数>50,即可判为阳性。
1.9病毒纯化与电镜观察按常规方法,将分离病毒液200mL,6000r/min离心30min,取上清液25000r/min离心2h,去上清,加入100uL生理盐水,4e过夜,充分溶解沉淀物,2000r/min离心5min,取上清。
用磷钨酸负染3min后,置于碳膜上于电子显微镜下观察。
1.10猪体致病试验选择6头30日龄PRRSV阴性健康仔猪,分成2组,每组3头。
第1组分别经肌肉注射和滴鼻接种分离病毒液(第10代,TCID50 106.8/m L)各1mL,第2组作为空白对照,隔离饲养,每日测量体温,观察试验猪精神和食欲,至第14天后扑杀,做病理剖检,肺脏、淋巴结、脾脏、心脏和胃肠道均未见异常,肺脏和淋巴结组织学检查也未见异常。
接种病毒后第1、2、3天和第1、2、3、4周,采集猪鼻塞、粪便样品和血液,并分离血清,-20e保存,用于检测PRRSV。
同时选择6头怀孕70~80d PRRSV阴性健康母猪,分成2组,每组3头。
第1组肌肉注射病毒液(第10代,TCID50106.8/mL)2mL,第2组作为空白对照,隔离饲养观察至分娩,接种后1~7d每日测量体温,分娩后观察产仔健康状况。
1.11结构蛋白基因的扩增、克隆与鉴定1.11.1引物设计参照GenBank上美洲标准毒株ATCC VR-2332(AF030244)基因序列利用Vector NT 7.0软件分别设计针对PRRSV GP3、GP4、GP5、M和N蛋白的引物,在引物的5c端加上BamH I和EcoR I 限制性内切酶位点,引物由大连宝生物工程公司合成,引物序列见表1。
1.11.2病毒感染细胞总RNA的提取提取方法参照Invitrogen公司TRIZOL Reagent试剂盒说明书进行,提取的总RNA-70e保存备用。
1.11.3RT-PCR按M-MLV鼠源反转录酶和r Taq DNA聚合酶的说明书分2步进行,先进行反转录后进行PCR反应。
PCR反应参数为:94e预变性3 min,94e变性45s,58e退火45s,72e延伸60s,共35个循环,最后72e延伸10min。