张嗣同 发酵工程第八章 典型发酵过程的特性与工业控制1

4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体 系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。 如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主载体系统有生长优势，那么改变了的系统将 最终占优势，基因不稳定性就出现。 表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要 有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙 酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极 检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通 过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度 在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由 于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄 糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄 糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制 效应，达到很高的细胞浓度。
2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是 G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌 （excretion）到胞外。它的这一性质对生 产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题 妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产 生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯 草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定 性也比较差，所以在使用上有较大的限制，
人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基 因操作； 大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高 细胞浓度（50g/l）；
大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大 肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌 分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些 蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包 含体。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细 胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠 的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复 性。 大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热 冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活 性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋 白的降解速率几乎等于产生的速率。
五、重组大肠杆菌的高密度培养策略
关键点：高密度、高表达 菌密度的测定：光密度（OD值或A值）在 波长600～660 菌生长的障碍是
重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢
重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成 后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水 性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会 导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生长速率往往 远小于宿主菌。
但在大的反应器中含有非常多的细胞，总 会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液， 每毫升有109个细胞，总共就有1015个细 胞，那么在这个反应器中就含有109个无 质粒细胞。 质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响， 如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的 稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它 是相同质粒附着在一起形成一个单位。
3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
2、恒pH流加
大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。这是 由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨 积累的原因。因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH 流加。实验通过pH反馈控制系统流加葡萄糖， 使pH恒定，结果推迟了比生长速率的降低时间， 细胞密度是无流加的2倍。可以以葡萄糖代替酸 液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水 和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往 不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适 宜。
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物， 它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比 最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有 简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它 的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困 难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了 其他的酵母如甲醇营养型酵母等。 当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后 修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物 细胞组织培养来达到。
1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现 当 发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时，菌体湿 重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为 13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到4.0ppm/L 时菌体湿重为2.27g/L外源基因表达量为26.4%。 在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转 录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼 吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速 以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长 而且有利于外源蛋白产物的形成。
第八章
典型培养过程
传统微生物培养 重组菌培养 动物细胞培养 传统微生物培养前面已讲述很多，本章 着重在后两方面的介绍
第一节 一、概述
基因工程菌培养
基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非 蛋白质。 非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这 些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强 某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。 现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如 下：
3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱和 百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补 糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而 减少氧饱和百分数，引起读数下降。当读数下 降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减 少，氧的饱和百分数逐渐上升，从而达到供需 平衡。Konstantinov等进一步发展了这种方法， 用DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、 搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度， 从而获得高密度和高表达
高表达的障碍是： 外源基因的不稳定，造成表达的下降。
高生长速率与高表达之培养以分批培养为基础，吸取了连续培 养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制 作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷， 从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实 现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效 的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是 反馈补料培养。有几种反馈控制 控制基质浓度流加 恒pH流加 恒溶氧流加 控制比生长速率的葡萄糖流加
诱导时机对酶表达水平和活力的影响 生物量（A600） 酶活力 酶表达水平 0.015 6.0 15.0% 0.049 19.1 31.1% 0.160 72.5 41.5% 0.225 102.6 49.8% 0.295 165.0 57.7% 0.360 105.5 53.4% 0.410 62.4 44.5% 0.450 30.2 22.5% *L-天冬酰氨酶
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出 现分离丢失。质粒可分为高拷贝质粒（>20 拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细 胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机 制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝 质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。 对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一些 质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当 然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万 细胞分裂中一个）。
3、诱导时间对外源蛋白表达的影响
诱导时间：加入诱导剂后的培养时间 随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性， 合成速率下降，甚至产物被分解。 诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶
4、诱导时机对表达的影响
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在A600=0.295*10 时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶 蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌 体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗， 氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速 度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受 到影响。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列， 而且所有转录后处理与在整个动物中相同， 在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它 可提供最接近于天然副本的产物，此外多数 产物可以分泌到胞外。 但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋 白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的 最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。
4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
六、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鲤鱼生长激素基因工程菌
细胞因子、疫苗、酶
产品最主要的用于人的治疗，此外还有用 于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用 于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病 人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难 性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、 磷酸化后才有活性。 治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安 全，降低成本并不重要，由于这些产品大多 用量很小，价格高，附加值高。
2、质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但 质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细 胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发 生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源 蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基 中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来 的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的 质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳 定性。