铜绿假单胞菌检验

3. 结果报告
根据蓝色或绿色菌落的计数和确证性试验的
结果，计算每250mL水样中的铜绿假单胞菌数 量，结果以CFU/250mL计。 生融合而可能影响计数的精确度。
受到严重污染或培养时间过长时，菌落会产
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） ATCC 27853——阳性对照菌株 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） ATCC 25922——阴性对照菌株

平铺时应避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
2.2.3 检验程序
结果观察：

所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定 为铜绿假单胞菌。 所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落， 进行乙酰胺肉汤确证性试验。


将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、 乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证性试验。

1.1 生物学特性

无特殊营养要求，该菌在普通营养琼脂上生长良 好，琼脂通常会被染成蓝绿色或黄绿色。 该菌在血琼脂平板上生长为灰绿色或蓝绿色菌落， 并形成透明溶血环。 在营养肉汤中呈混浊生长，液面可长出菌膜，菌液 上层为蓝绿色。


1.1 生物学特性

生化反应： 1）氧化酶阳性； 2）液化明胶； 3）硝酸盐还原试验阳性； 4）吲哚阴性； 5）绿脓菌素试验阳性； 6）其它生化试验（糖利用试验、脱羧酶试验等等）。

－P：呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞 菌的菌落）。 －F： 显荧光的菌落数。 －R： 呈红褐色的菌落数。 －nF：进行产氨测试的显荧光菌落数。 －CF：产氨阳性的显荧光菌落数。 －nR：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测 试的红褐色菌落数。 －CR：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均 呈阳性的红褐色菌落数。

1.1 生物学特性
革兰氏阴性细长杆菌，大小为1.5～3.0×0.5μm， 菌体长短不一，呈球杆状或长丝状，成对或成短链 排列。菌体一端有一根鞭毛，运动活跃，无芽孢， 无荚膜。 专性需氧菌。最适温度为35℃，42℃生长，4℃不生 长。（所以一般情况下不能冷藏保存，需在室温下 于阴凉处保存） 可产生多种，主要为绿脓素，是一种水溶性色素， 但是也产生能溶于氯仿、蓝绿色、无荧光的吩嗪类 色素。
1.1 生物学特性

抵抗力： 较其他细菌强，对干燥、紫外线的抵抗力亦较强。 对多种抗生素：青霉素、链霉素、红霉素、卡那霉 素等耐药。 对多粘菌素、羧苄青霉素及先锋霉素等敏感。



1.2 临床症状
1.2.1 致病因素： 主要是内毒素、还有多种胞外酶、外毒素。 1.2.2 所致疾病： 分布广泛，许多正常人皮肤和粪便中均带有此菌。 医源性感染中由本菌引起者约占10％；烧伤和癌症 病房可高达30％。 该菌几乎可以感染人体的任何组织和部位。 主要引起化脓性感染，而发生菌血症。

2.2铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
金氏B（King’s
B）培养基
20.0g 10mL 1.5g 1.5g 15.0g 1000mL
成分：

蛋白胨 甘油 K2HPO4 MgSO4.7H2O 琼脂 蒸馏水
2.2铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
制法：
2.2铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
2.2.2 培养基（ CN琼脂 ）


成分：
明胶胨 胰蛋白胨 K2SO4 MgCl2 甘油 琼脂 蒸馏水 CN补充成份 溴化十六烷基三甲胺(cetrimide) 萘啶酮酸 16.0g 10.0g 10.0g 1.4g 10mL 15g～20g 1000mL 0.2g 0.015g
产氨试验＋
铜绿假单胞 菌阳性
铜绿假单胞 菌阳性
非铜绿假单 胞菌
菌数计算，报告结果
2.2.3 检验程序
推测性检验 水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向 上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL 水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤 将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板，然后 置于36℃±1℃培养24h～48h
2.2.3 检验程序
水 样
取250mL水样过滤
将滤膜移放在CN琼脂培养基上
于36℃±1℃、培养24h～48h
挑取可疑菌落分别计数
2.2.3 检验程序
蓝/绿色菌落 产荧光（非蓝 /绿色）菌落 红褐色菌落 产氨试验＋ 氧化酶＋ 荧光试验＋ 铜绿假单胞 菌阳性 其他形态菌 落或非如左 述各种反应 结果
2. 检验方法
2.1

铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
2.1.1 Water quality -- Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa -Method by membrane filtration （ ISO 16266:2006 ） 2.1.2 《饮用天然矿泉水检验方法》（GB/T8538－ 2008/ 4.54）铜绿假单胞菌检验
2.2铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
制法：
将明胶胨、胰蛋白胨、K2SO4 、MgCl2、琼脂溶解于 1000mL蒸馏水中。然后加入10mL甘油，加热煮溶并 高压蒸汽灭菌（121℃，15min）。 用孔径为0.22μm的微孔滤膜对CN补充成分进行过滤 除菌。 将无菌的CN补充成分添加到已灭菌好的基础培养基 中，调节pH为7.1±0.2，倾注平板，备用。

成分：
a) 溶液A： KH2PO4 MgSO4 乙酰胺 NaCl 蒸馏水 b) 溶液B： Na2MoO4·2H2O FeSO4·7H2O 水 1.0g 0.2g 2.0g 0.2g 900mL 0.5g 0.05g 100mL
2.2铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
制法：

加热溶解A组分，用HCl或NaOH调pH到7.0±0.5范围 内（当温度为25℃时）。然后将1mL溶液B加入到 900mL新鲜制备的溶液A中，用水定容到1000mL。分 装到试管中，每管5mL，盖好试管帽后，高压蒸汽灭 菌（121℃，15min）。
铜绿假单胞菌在CN培养基上生长的菌落形态
2.2.3 检验程序
在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤
CN琼脂上生长 的菌落形态 蓝色/绿色 产荧光（非蓝 /绿） 红褐色 其它形态 乙酰胺 肉汤 NTa ＋ ＋ NT 氧化酶 试验 NT NT ＋ NT 在金氏B培养 判定为铜绿 基上产生荧光 假单胞菌 NT NT ＋ NT 是 是 是 否
a备注：NT表示不用测试。
2.2.3 检验程序
确证性试验
（1）纯化 将可疑菌落划线接种于营养琼脂平板 （36℃±1℃，20h～24h ） （2）氧化酶试验 取2～3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里 的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量 的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10s内显深 蓝紫色的视为阳性反应。亦可使用氧化酶试纸。

加热溶解以上各组分，然后冷却至45℃～50℃，用 HCl或NaOH调节pH到7.2±0.2范围内（温度为25℃ 时）。最后将培养基分装到试管中，每管5mL，盖好 试管帽后，高压蒸汽灭菌（121℃，15min）。
2.2铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
乙酰胺肉汤

inosa）
广东省微生物研究所 广东省微生物分析检测中心 2015年3月
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
1.生物学特性、流行病学、临床症状
铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）又称绿脓杆菌，是 假单胞菌属中最常见的菌种。 通常从临床样品（伤口、烧伤和尿道感染）中分 离，可以引起化脓性感染，脓液通常呈“绿色”，因 此是“绿脓”异名的来历。 亦能从土壤和水体分离。
氧化酶试验（阳性）
2.2.3 检验程序
确证性试验
（3）金氏B（King’s B）培养基 将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养 物接种于金氏B培养基上，36℃±1℃，24h～5d。 每天在紫外灯（波长为360±20nm ）下检查其 是否产生荧光，将5d内能产生荧光的菌落记录为阳 性。
铜绿假单胞菌在金氏B培养基上生长的产荧光菌落
2.2.3 检验程序
确证性试验
（4）乙酰胺肉汤 将新鲜纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的 试管中，36℃±1℃，20h～24h。 向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检 查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红 色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。
3. 结果表示
菌落计数公式：N＝P＋F(CF/nF)＋R(CR/nR)

2.2铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
2.2.1 原理

微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为 0.22 μm 、0.45μm），滤膜能滤过大量水样，并 将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在 选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典 型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生 物菌落总数。