气单胞菌初筛鉴定培养基的研究_刘彤

气单胞菌初筛鉴定培养基的研究哈尔滨市道外区卫生防疫站(哈尔滨150026)　刘　彤　刁映红　张　波　张　萍　杨东霞　杨暑伏提　要　气单胞菌是人和鱼、青蛙等冷血动物的重要致病菌。

为提高对该菌的检测水平,研制出一种气单胞菌初筛鉴定琼脂(AP A),经213株临床分离的气单胞菌和81株相关菌的应用研究,结果表明气单胞菌在A PA培养基显现独特的生化反应模式,对气单胞菌鉴定的准确率达98.12%,与肠杆菌科、弧菌科中临床常见的细菌能做出属的鉴别。

该培养基组成合理,性能特异稳定,结果容易判断,为气单胞菌的初步鉴定和快速检验提供了可靠的方法。

关键词　气单胞菌　初筛鉴定　培养基气单胞菌在自然界分布广,主要存在河水、污水中及鱼、青蛙、蛇的体腔。

随着细菌鉴定技术的进步,发现该菌可产生溶血素、细胞毒、坏死毒和肠毒素,是冷血动物及豚鼠、水貂的致病菌〔1～3〕,也是人败血症、脑膜炎等化脓性感染及腹泻、食物中毒的重要致病菌〔2～5〕。

因此,快速、准确地对气单胞菌进行鉴定,对该菌所致临床感染的早期防治具有重要意义。

目前,我国已建立了较系统的检验方法〔2〕,但尚无一种特异性强的初筛鉴定培养基,直接影响气单胞菌的检出率和延长了确认鉴定时间。

为此,参照有关文献〔6〕,研制出气单胞菌初筛鉴定琼脂(A PA),经中国科学院微生物研究所做技术鉴定,辽宁省卫生防疫站等单位考核应用,一致认为该培养基对气单胞菌有特异的生化反应模式,与肠杆菌科、弧菌科的相关菌可做出属的鉴别。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　菌株　气单胞菌213株,其他相关菌81株,均由腹泻粪便、脓汁、鱼及池水中分离。

气单胞菌及相关菌标准菌株28株来自中国科学院微生物研究所。

1.1.2　培养基　SS琼脂、麦康开琼脂购自上海市卫生防疫站,数值鉴定系列生化由哈尔滨市卫生防疫站提供,T SI等生化试剂由单位制备。

气单胞菌初筛鉴定琼脂(A PA):月示胨5g、酵母浸膏3g、蛋白胨9g、色氨酸1g、L-鸟氨酸5g、甘露醇1g、肌醇10g、硫代硫酸钠0.4g、柠檬酸铁铵0.5g、琼脂3g。

以上成分混合,加蒸馏水1000ml,加热溶化,调整pH至6.7,加溴甲酚紫0.02g,分装小试管,每管4ml,胶塞封口,121℃高压灭菌12min,置4℃冰箱保存备用。

1.2　方法1.2.1　接种　将收集的气单胞菌和相关菌,用营养琼脂纯化培养后,挑取典型菌落,接种A P A,37℃培养18～24h;临床标本用SS或麦康开分离,挑取可疑菌落接种A PA,培养18～24h。

观察接种菌A PA表层、底层的颜色变化及动力、硫化氢,最后加K ov acs试剂,观察吲哚反应。

1.2.2　数值鉴定　按文献操作和判定结果〔7〕。

2　结果2.1　A PA的特异反应　气单胞菌和相关菌的标准菌株接种A PA,气单胞菌在AP A出现表层紫色(碱性)、底层黄色(酸性)、动力阳性、吲哚阳性、硫化氢阴性的生化反应模式,它与肠杆菌科、弧菌科中相关菌鉴别特征见表1。

表1　气单胞菌及相关菌的标准菌株在APA培养基上的反应特征菌种株数表层底层硫化氢动力吲哚嗜水气单胞菌7K A-++肺炎克雷伯氏菌2A A---小肠结肠炎耶尔森氏菌1K N---弗氏柠檬酸杆菌a2K A++-阴沟肠杆菌2N N-+-大肠艾希氏菌3K K-++粘质沙雷氏菌2N N-+-普通变形菌a1R K+++摩氏摩根氏菌1R K-++猪霍乱沙门氏菌a1K K++-类志贺邻单胞菌3K K-++霍乱弧菌2K K-++铜绿假单胞菌b1K K-+- 注:K:紫色,A:黄色,R:褐红色,N:淡紫到浅黄,+:阳性,-:阴性,a:硫化氢产生量大时,呈黑色,其反应易被掩盖,b:近原培养基颜色,动力在表面层观察,(下同)。

2.2　A P A的稳定性　各批培养基分别用嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠艾希氏菌、阴沟肠杆菌、普通变形菌测定对鸟氨酸、动力、硫化氢、吲哚、肌醇、甘露醇的反应。

结果表明各批培养基反应性能稳定,4℃保存3个月无异常反应出现。

2.3　临床菌株鉴定　共实验和考核气单胞菌213株,符合气单胞菌反应模式的209株,符合率为98.12%。

其中已确认鉴定的61株,符合气单胞菌反应模式的60株,占98.36%,另1株为鸟氨酸阳性的气单胞菌;由SS或麦康开初分离,挑取可疑菌落接种A P A,符合气单胞菌反应模式的152株,经数值鉴定为气单胞菌的149株,符合率97.37%。

另3株(占2.63%)经鉴定为大肠艾希氏菌。

气单胞菌与临床上常见的肠杆菌科中的11个菌属弧菌科的2个菌属及铜绿假单胞菌在AP A的反应结果见表2。

3　讨论气单胞菌是弧菌科的一个属。

该属含8个种〔8〕,即嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、杀鲑气单胞菌(无动力,含4个亚种)、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌、嗜泉气单胞菌和维罗那气单胞菌。

近年,国外学者又提出了尺骨气单胞菌、简氏气单胞菌和异常嗜糖气单胞菌3个新种。

其中以嗜水气单胞菌为优势菌,其次是温和气单胞菌,其他几个种少见。

除维罗那气单胞菌为鸟氨酸阳性外,其他的种为鸟氨酸阴性、发酵甘露醇、不发酵肌醇。

鉴于气单胞菌这种生化特征,参照文献〔6〕研制出气单胞菌初筛鉴定琼脂,观察该培养基表层和底层的颜色变化可以判定鸟氨酸、甘露醇、肌醇的反应。

培养基中含有蛋白胨、色氨酸,可观察吲哚反应。

含有月示胨、肉浸膏和指示系统的硫代硫酸钠、柠檬酸铁铵测定硫化氢。

采取半固体琼脂观察细菌的运动性。

标准菌株测试结果表明气单胞菌在AP A的反应为表面紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性、吲哚阳性的反应模式。

共检查气单胞菌213株,符合该反应模式209株,占98.12%,其中吲哚试验的阳性率为89.52%。

另4株经鉴定3株为大肠艾希氏菌,1株为鸟氨酸阳性的气单胞菌,可见A PA 培养基对气单胞菌具有的鉴定作用。

表2　临床分离的气单胞菌及相关菌在APA培养基的反应结果菌名株数(294)表层底层硫化氢动力吲哚注嗜水气单胞菌58K A-++(54/58)其中1株反应不符,经鉴定(已知菌株)为鸟氨酸阳性气单胞菌嗜水气单胞菌152K A-++(134/152)其中3株鉴定为大肠艾希氏菌(APA初筛菌株)温和气单胞菌2K A-++简氏气单胞菌1K A-++肺炎克雷伯氏菌3A A---小肠结肠炎耶尔森氏菌1K N---37℃培养,动力阴性大肠艾希氏菌18K K-++大肠艾希氏菌5K A-++福氏志贺氏菌8K A---紫色仅出现在表面宋内氏志贺氏菌1K N---奇异变形菌3R K+++硫化氢量大时,均变黑彭氏变形菌1R K-++斯氏普罗威登斯菌2R K-+-摩氏摩根式菌1R K-++粘质沙雷氏菌1N N-+-居泉沙雷氏菌1K N-+-鼠伤寒沙门氏菌2K K++-硫化氢量大时,均变黑乙型副伤寒沙门氏菌1K K++-硫化氢量大时,均变黑伤寒沙门氏菌1K A++-硫化氢量少产气肠杆菌2K N-+-成团肠杆菌4K A-++(3/4)弗氏柠檬酸杆菌2K A++-硫化氢量大时,均变黑霍乱弧菌7K K-++副溶血弧菌4K K-++生长不良解藻酸弧菌1K K-++生长不良河弧菌3K A-+-生长不良类志贺邻单胞菌5K K-++铜绿假单胞菌4K K-++其颜色近原培养基(非发酵菌) 注:(　)内分子指阳性数,分母为试验数。

A PA培养基对肠杆菌科常见的11个菌属17个种有明显的鉴别作用,仅有少部分大肠艾希氏菌、成团肠杆菌与气单胞菌反应一致,可通过氧化酶试验加以区别。

伤寒沙门氏菌和弗氏柠檬酸杆菌、福氏志贺氏菌在AP A的表层、底层与气单胞菌一致,可通过硫化氢、吲哚、动力加以区别。

福氏志贺氏菌在A PA表层的紫色很弱,仅出现在其表面。

A PA培养基可鉴别、排除弧菌属中常见的菌霍乱弧菌。

由于含盐量少,副溶血弧菌等的各项反应不够明显。

对少见的河弧菌,其反应性与气单胞菌不易区别,可通过耐盐试验加以鉴别。

该培养基可鉴别类志贺邻单胞菌,对铜绿假单胞菌等非发酵革兰氏阴性杆菌有鉴别作用,这类菌在AP A的表面和底层均呈紫色或淡紫色,其动力仅在表层可以观察到。

肠杆菌科中的变形菌、沙门氏菌等由于产生大量硫化氢,整个培养基变为黑色,其表层、底层的颜色变化不易分清,而气单胞菌在A P A上一般不产生硫化氢,或在表层产生少量硫化氢,两者也很容易鉴别。

(本研究承蒙哈尔滨市卫生防疫站徐迪诚主任医师指导、中国科学院微生物研究所作技术鉴定,辽宁省卫生防疫站、哈铁中心医院、黑龙江省农场总局医院、哈尔滨市太平区卫生防疫站考核应用,在此一并致谢!)参考文献1.　Balous A.M anu al of Clinical M icrobiolog y(5th ed.)Americal Soci-ety for M icrobiology.W as hington.D.C.1991:369催化吸光光度法测定人发中铁的研究包头医学院预防医学系(包头014010)李玉明　高红萍　刘　漪提　要　F e(Ⅲ)在稀硫酸介质中,能催化过氧化氢氧化甲基红的褪色反应〔1〕。

本文采取固定时间、恒定水浴温度,非催化反应和催化反应溶液的吸光值之差$A(A0-A)与F e(Ⅲ)浓度在0～04L g/25ml范围内呈良好的线性关系,由此可建立测定生物样品中微量铁的新方法。

本法的灵敏度为2.0×10-11g/ml。

关键词　铁(Ⅲ)　催化反应　吸光光度法Study on Spcctrophotomctric Detcrmination of Iron in Hair by Catalytic Rcation　L i Y uming;Gao H ongp ing;L iu Y i.,D e-p artment of P reventiv e M edicine,Baotou M ed ical college(Bao-tou014010)Fe(Ⅲ)in H2SO4medium ca n catalyze the decot or izing r e-actio n w hich results fr om the o x ida tio n of M ethy l r ed by hy-dr og en pero xide.In fix ed time and temper atur e,the differ ence of t he spectro metr ic values(A-A)bet ween the cataly tic r ect ion and the non-cat aly tic r eact ion have satisfact or y linsea r r elat ion w ith the concentrat ion o f Fe(Ⅲ)w ihtin the r angeo f0～0.4g/ 25ml.T he new met ho d has been applied to the det er minat ion of micr o amount iro n in biolo gical samples.T he sensitivit y of the metho d is2.0×10-11g/m l.Key words　Ir on(Ⅲ)　Catalytic Reactio n;Spectro pho-tomet ric M ethod铁是人体的一种必需微量元素,发中铁的含量可以反映人体内铁的营养状况。