高效液相色谱测定生鲜乳及乳制品中三聚氰胺的方法研究
高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺
高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。
三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。
本文参考了以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重现性以及回收率均符合国家标准。
1 实验部分1.1 仪器与试剂LC1600高效液相色谱仪（含UV1600紫外-可见检测器1台，P1600高压恒流泵1台，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。
1.2 标准品溶液配制精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。
根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。
1.3 样品前处理称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀后超声提取15min。
取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC 测定溶液。
1.4 色谱条件：色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm)流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸）流速：1.0ml/min波长：240nm温度：40℃进样量：20μl2 实验结果2.1 精密度实验取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面积RSD为0.57％。
高效液相色谱测定牛奶中的三聚氰胺
高效液相色谱测定牛奶中的三聚氰胺的成功案例
摘要：建立了浊点萃取法（CPE）对牛奶样品进行净化和浓缩后用高效液相色谱（HPLC）检测的方法。
本实验采用酸（CCl3COOH）结合非离子型表面活性剂Triton X-100对牛奶进行破乳，以非离子表面活性剂聚乙二醇600（PEG 600）作为萃取剂，研究牛奶中三聚氰胺的萃取行为。
实验确定的破乳方法和CPE方法的优化条件：Triton X-100的浓度为 2 %（W/V），CCl3COOH的浓度为2 %（W/V），100 ℃水浴加热10 min；PEG 600的浓度为13 %（W/V），Na2CO3和Na2SO4的浓度分别为0.5 %（W/V）和26 %（W/V），平衡温度70 ℃，平衡时间30 min。
在上述实验条件下，牛奶样品的加标回收率80 %以上，相对标准偏差为2.1 % ，定量限为0.9 μg/kg，小于国家规定的定量限(2.5 μg/kg)。
该方法简便、快速、灵敏度高、污染少。
关键词：三聚氰胺；浊点萃取；表面活性剂；高效液相色谱
1.仪器配置
2.色谱图
1三聚氰胺的标准色谱图
2加标牛奶样品色谱图
3.方法使用范围
南京科捷分析仪器应用研究所研发本方法——高效液相色谱法，主要用于乳制品中三聚氰胺的检测，具有灵敏度高，操做简单等特点。
此方法显示图谱清晰明了，结果准确，可广泛用于对乳制品的质量监控等领域。
高效液相色谱法检测奶制品中的三聚氰胺
高效液相色谱法检测奶制品中的三聚氰胺一、实验目的1、掌握反相离子对色谱法测定奶制品中三聚氰胺的原理和方法。
2、了解复杂样品进行色谱分析时前处理的方法和必要性。
二、实验原理三聚氰胺是一种常见的化工原料，有毒，若人体大量摄入，将引起泌尿系统结石等疾病。
2008年9月，三鹿奶粉事件发生后，三聚氰胺的危害被深入广泛的认识，同时食品安全问题也更加受到重视与关注。
反相高效液相色谱（RP-HPLC ）具有分离效率高，分析速度快，灵敏度高等优点，而且仪器较简单、工作条件要求较低，在有机物的分离与测定中有极为广泛的应用。
但三聚氰胺是强极性物质，在反相色谱柱上保留能力很弱，难以达到分离的目的。
三聚氰胺具有弱碱性，在酸性溶液中能形成阳离子。
若在流动相中加入与具有两亲作用的阴离子，则可与三聚氰胺形成具有疏水作用的离子对，从而使保留能力明显增强，达到与干扰组分分离的目的，这就称作离子对色谱。
测定阳离子一般采用烷基磺酸盐作为离子对试剂，测定阴离子一般采用烷基胺类作为离子对试剂。
奶制品的组成较复杂，一般含有大量的蛋白质和脂肪类物质，若不经过预先的分离处理，不仅干扰三聚氰胺的检出，还会对色谱柱造成一定的损伤，因此对待测样进行分离，纯化等预处理是十分重要的。
加入重金属离子可使蛋白质变性、凝聚，从而沉淀分离。
脂类和高级脂肪酸可在酸性条件下通过乙酸乙酯、乙醚、氯仿等的萃取除去。
反相离子对色谱测定三聚氰胺的定量下限约为0.1mg·L -1。
对于更低浓度的试样，需要使用灵敏度更高的色谱-质谱联用技术。
但由于仪器昂贵，维护较复杂，色谱-质谱联用技术的应用受到了限制。
通过阳离子交换树脂可使溶液中的三聚氰胺得到富集，从而有效的改善检出限。
近年来发展的固相微萃取技术将净化除杂和分离富集等步骤简化合并，使色谱分析试样前处理的效率有了显著的提高。
三、试剂与仪器试剂：PbAc （AR ） 0.2 mol·L -1（乙酸酸化），乙酸乙酯（AR ），乙酸（AR ），甲醇（AR ），氨水（AR ），732型强酸性离子交换树脂（40~60日）色谱流动相：A 、乙腈（色谱纯）；B 、KH 2PO 4（GR ） 0.05 mol·L -1；C 、H 3PO 4（GR ） 0.5 mol·L -1；D 、十二烷基磺酸钠（AR ） 0.2 mol·L -1仪器：P230型高效液相色谱仪，配UV 检测器；ODS C-18 色谱柱标样：三聚氰胺（纯度大于99.5%），用水配制成1.001g L -⋅标准储备液，4℃保存。
固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶中的三聚氰胺
用 高效 液 相 色谱 法 测 定 ． 结 果 表 明 ， 三 聚 氰 胺 的标 准 曲 线 为 ｙ － ４ ４ ７ ７ １ ． ２ ｘ ＋ ４ ５ ６ ３ ． ８ ，相 关 系数 ｒ － － ０ ． ９ ９ ９ ５ ，检 测 限 为 ０ ． ０ ５ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ 。 回收率 ） ０ ９ ７ ． ６ ％ 一１ ０ ０ ． ４ ％。该 方法操 作 简单 ，精 密度和 回收率 高，可 满足 奶粉 中三聚氰胺 的准确 定性和 定量
１ ． ５ 样 品的制备
称取新 鲜牛 乳５ ｇ ，加 入２ ０ ｍ１ ０ ． １ ％三氯
乙酸提 取液 ，充 分 混匀 ，加入 ５ ｍ１ ２ ％乙酸铅 溶液 ，均质 ｆ ２ ｍｉ ｎ ） 或超声２ ０ ｍｉ ｎ ，Ｉ Ｏ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ／ ｍｉ ｎ 离心 １ ０ ｍｉ ｎ ，取上清液 ５ ｍｌ 过混合 型 阳离子 交换 小柱 （ Ｐ Ｃ Ｘ ） 。待样 液完全 流 出后 分 别用３ ｍｌ 甲醇 和３ ｍｌ 水活 化 固相萃取 柱 ，取 上述 提取液 ５ ｍｌ 过 固相萃 取柱 ，使提 取液 以不低 于 １ ｍｌ ／ ｍｉ ｎ 的流速通
（ Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ ） ［ 、液相色谱 一质谱法（ ＨＰ Ｌ Ｃ． ＭＳ ） ｔ 、气相 色谱 一
质谱法（ ＧＣ ． ＭＳ ） ｔ 】 、毛 细管 电泳法 （ ｃ Ｅ ） 、胶体 金免 疫层 析法 和酶 联免 疫法 等 。２ ０ ０ ８年 １ ０月 ， 国 家 标 准
液 并将小柱抽干 。用５ ｍ １ ５ ％氨化 甲醇（ ｖ ／ ｖ ，５ ｍ ｌ 氨水＋ ９ ５ ｍ ｌ
蛋白质，每１ ０ ０ ｇ 牛奶中添加Ｏ ． １ ｇ 三聚氰胺 ，就能提 高０ ． ４ ％ 蛋白质 ，因此三聚氰胺 也被 人称为” 蛋 白精” 。 三 聚氰胺 被摄 入人 体 内遇到 胃酸 时会 溶解 ，但 是排 到尿 中会 再次结 合形 成结 晶 ，可能堵 塞 肾小 管 ，随着结 晶在 体 内含量 的增 多，如 果不 能排 除 ，积累 到一 定的程 度 后形成 结石 ，给肾功 能 带来极 大 的损害 甚 至肾衰竭 而 死亡 。蛋 白精给奶制 品业带来 了巨大 的冲击 。卫生部等 ５ 部 门关于三聚氰 胺在食 品中 的限量值 的公 告（ 卫 生部公 告
实验一 原料乳与乳制品中三聚氰胺的HPLC检测
实验一原料乳与乳制品中三聚氰胺的HPLC检测一、实验目的掌握HPLC检测乳及其制品中三聚氰胺含量的原理与方法。
’二、实验原理样品中的三聚氰胺经三氯乙酸一乙腈提取，阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。
三、仪器与试材1．仪器与器材高效液相色谱仪岛津LC-20AT(带有紫外检测器)、离心机、超声波水浴、固相萃取装置、氮气吹干仪、涡旋混合器等。
2．试剂除特别说明外，实验所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。
(1)常规试剂及其他：甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、氨水(25％～28％)、三氯乙酸、柠檬酸、辛烷磺酸钠(色谱纯)、定性滤纸、海砂[化学纯，粒度为0．65～0．85m m，二氧化硅(Si O2含量为99％]、0.2μm 微孔滤膜、氮气(纯度≥99．999％)。
(2)常规溶液：甲醇水溶液(1+1，体积比)、三氯乙酸溶液(1％)、5％氨水一甲醇(1+19，体积比)、离子对试剂缓冲液(取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L)。
(3)阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯一二乙烯基苯高聚物，60mg，3mL，或相当者。
使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。
(4)三聚氰胺标准储备液(1mg／mL)：称取100．0mg三聚氰胺标准品(纯度大于99．0％)于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，于4℃避光保存。
3．实验材料4～5种液态奶、奶粉、酸奶、冰激凌或奶糖，各50g。
四、实验步骤1．样品提取(1)称取2．00g样品于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以4000r／min离心10min。
(2)上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，以三氯乙酸溶液定容至25mL。
(3)取5mL滤液，加入5m L水混匀后用作净化液。
高效液相色谱法测定乳制品中的三聚氰胺
高效液相色谱法测定液态奶中三聚氰胺的含量1（华南师范大学化学与环境学院，广州510006）2（华南师范大学化学与环境学院分析化学研究所，广州510006）摘要为建立液态奶中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法，通过超声提取，离心，有机滤膜净化，结合高效液相色谱进行样品测定。
色谱柱：依利特C18液相色谱柱（4.6×150mm，5 µm）。
流动相：A液：离子对试剂缓冲液（0.9508g辛烷磺酸钠+1.0640g柠檬酸，配成1L溶液）；B液：甲醇；色谱条件：70%A+30%B。
流速：1.0mL/min。
柱温：40℃。
波长：239 nm。
进样量：2μL。
结果表明：三聚氰胺标准曲线为y=58093x+1060.1，相关系数R2=0.9986，在0.0156~1.0mg/mL范围内线性关系良好。
样品在三氯乙酸和乙腈（体积比=3：1）的提取条件下的加标回收率最高，为101.63%。
关键词高效液相色谱，三聚氰胺，液态奶1 引言1.1 三聚氰胺仪器检测方法概述三聚氰胺(melamine)是一种重要的氮杂环有机化工原料[1]，俗称蜜胺。
因其含氮量大于66%，且我国通常采用“凯氏定氮法”估测食品和饲料中的蛋白含量，三聚氰胺常被不法商人掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被称为“蛋白精”。
但三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的。
国家质量监督检验检疫总局与国家标准化管理委员会联合发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》，即国标GB/T 22388-2008[2]。
这一新标准制定了高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）及气相色谱-质谱联用法（GC-MS）三种检测方法与标准。
三聚氰胺的检测方法还包括酶联免疫吸附(ELISA)法等。
1.1.1 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法的定量限为2.0mg/kg，具有操作简单、灵敏度高，测定周期短等优点。
试论用高效液相色谱（HPLC）检测原料乳与乳制品中三聚氰胺的原理和方法
科技文苑December 2017 CHINA FOOD SAFETY 75高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法，被广泛应用于保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等方面。
针对近年来一些不法商家在牛奶中添加三聚氰胺的案例，笔者所在单位加强了乳制品中三聚氰胺的检验工作，在执行标准GB/T 22388和GB/T 22400的基础上，摸索出另一种使用HPLC 检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，通过一段时间的实验，效果显著，现将该方法总结归纳如下，供业界参考。
1 基本原理用50%甲醇和乙酸铅溶液作为原料乳和乳制品的蛋白质沉淀剂与三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱分离，高效液相色谱—紫外检测皿/二极管阵列检测皿检测，外标法定量。
2 试剂与材料水：GB/T 6682规定的一级水；乙腈（CH 3CN）：色谱纯；磷酸（H 3PO 4）；磷酸二氢钾（KH 2PO 4）；三聚氰胺溶液标准物质：1.00mg/mL；乙酸铅溶液：称取22g 乙酸铅（准确至0.01g），加水800mL 完全溶解后，用水稀释至1L，用滤膜过滤后备用；磷酸盐缓冲液：0.05mol/L（称取6.8g 磷酸二氢钾，加水800mL 完全溶解后，用磷酸调节pH 至3.0，用水稀释至1L，用滤膜过滤后备用）；一次性注射皿：5mL；滤膜：水相，0.45μm；针式过滤皿：有机相，0.45μm；具塞刻度试管：50mL；移液枪：2~20μL、5~50μL、20~200μL、100~1000μL。
3 仪皿高效液相色谱仪：配有紫外检测皿/二极管阵列检验皿；分析天平：感量0.0001g 称0.01g；pH 试纸：pH 0.5~5.0；溶剂过滤皿；离心机；涡旋混合皿；超声波清洗皿。
4 测定步骤4.1 试样的制备称取混合均匀的15g 乳制品样品（准确至0.01g），置于50mL 具塞刻度试管中，加入5mL 乙酸铅溶液，在加入25mL 甲醇/水（1:1），涡旋混匀，加水至50mL，涡旋振荡6min，离心10min，转速为3000r，静置后用一次性注射皿吸取上清液，用针式过滤皿过滤，作为分析试样。
固相萃取一高效液相色谱法测定液态奶中三聚氰胺含量
固相萃取一高效液相色谱法测定液态奶中三聚氰胺含量一、引言三聚氰胺是一种有机化合物，化学式为C3H6N6，是一种白色结晶性固体，可溶于水和乙醇，主要用作工业生产中的原料，如氰酸酯树脂、氰酸脂和脲醛树脂等。
但由于其高氮含量，三聚氰胺还可以在一定条件下成为一种良好的氮肥料。
三聚氰胺在奶制品中的使用引起了广泛的争议。
2008年，中国发生了因三聚氰胺被加入奶粉中而导致大量儿童发生尿路结石的事件，震惊了全国。
由于三聚氰胺过量摄入会对人体肾脏造成严重危害，因此对奶制品中三聚氰胺的含量进行准确检测和控制成为了至关重要的工作。
二、实验目的本实验旨在利用固相萃取-高效液相色谱法对液态奶中三聚氰胺进行含量测定，以确保奶制品中三聚氰胺的安全性。
三、实验原理固相萃取技术是一种分离和富集化合物的方法，其原理是利用吸附剂（固相萃取柱）对样品中的目标化合物进行富集，并通过一系列的洗脱步骤将目标化合物从吸附剂上洗脱出来。
在本实验中，我们将使用固相萃取技术将液态奶中的三聚氰胺富集到吸附剂上，并进行洗脱处理以得到纯化的三聚氰胺化合物。
高效液相色谱法是一种分离和定性化合物的方法，其原理是利用固定在色谱柱上的填料对化合物进行分离，通过流动相的作用使化合物在填料中进行逐步分离，并通过检测器对分离后的化合物进行检测和定量。
在本实验中，我们将使用高效液相色谱法对洗脱后的三聚氰胺进行检测和定量分析。
四、实验步骤1. 样品准备：将液态奶样品装入适当的容器中，以备后续的固相萃取处理。
2. 固相萃取：将样品经过预处理后注入固相萃取柱中，利用固相萃取柱对三聚氰胺进行富集。
3. 洗脱处理：使用洗脱液将固相萃取柱中富集的三聚氰胺进行洗脱处理，得到纯化的三聚氰胺化合物。
4. 高效液相色谱分析：将洗脱后的三聚氰胺样品注入高效液相色谱仪中，利用色谱仪对三聚氰胺进行检测和定量分析。
5. 数据处理：根据高效液相色谱仪得到的检测结果，计算出液态奶中三聚氰胺的含量。
五、实验结果根据实验数据分析，我们得到了液态奶中三聚氰胺的含量为x mg/L。
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ
ｆｒｅｓｈ ｍｉＩｋ ａｎｄ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｅ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｆｅｒｒｉｎｇ ｔｏ ＦＤＡ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＮＹ厂ｒ ｌ ３７２—２００ｒ７ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｌａｍｉｎｅ．ｔｈｅ
※分析检测
良晶科学
２００８，Ｖ０１．２９，Ｎｏ．１０ ５３１
高效液相色谱测定生鲜乳及乳制品Ｉｐ 三聚氰胺的方法研究
汪辉，彭新凯，李文丽，曹小彦木，黄辉，胡朝晖 （长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南长沙４１００１３）
摘 要：建立用高效液相色谱．二极管阵列法测定生鲜乳及乳制品中的三聚氰胺的检测方法。本实验参照ＦＤＡ三 聚氰胺检测方法、ＮＹ，Ｔ １３７２—２００７，探讨检测三聚氰胺的色谱条件和优化生鲜乳及乳制品中的三聚氰胺前处理 方法。最后确立了有效的检测方法，采用硫酸铵（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）：甲醇＝９４：６（Ｖ／Ｖ）作为流动相，２０３ｎｍ为检测波长。样 品溶液在０．１～１５０１ａｇ，ｒｎｌ之间均具有良好的线性关系，最低检测限为０．５ｍｇ／ｋｇ，回收率均在９１％以上，回归方程式 为ｙ＝２．３７×１０５ｘ＋１．２１×１０·及相关系数ｒ＝０．９９９８。此法操作简便、快速、灵敏、准确，样品处理简便易行，适 于测定生鲜乳及乳制品中的三聚氰胺。 关键词：高效液相色谱；二极管阵列检测器；生鲜乳；乳制品：三聚氰胺
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ Ｆｒｅｓｈ Ｍｉｌｋ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＷＡＮＧ Ｈｕｉ，ＰＥＮＧ Ｘｉｎ－ｋａｉ，ＬＩ Ｗｅｎ－ｌｉ，ＣＡＯ Ｘｉａｏ－ｙａｎ＋，ＨＵＡＮＧ Ｈｕｉ，ＨＵ Ｚｈａｏ—ｈｕｉ （Ｃｈａｎｇｓｈａ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌ时Ｓａｆｅｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００１３，Ｃｈｉｎａ）
ｓｕｌｆａｔｅ—ｍｅｔｈａｎｏｌ（９４：６，ｗｖ）ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ，ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ２０３ ｎｌｎ．Ｔｈｅ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆｆｒｏｍ ０．１
ｔｏ １５０ ｕ ｇ，ｒｎｌ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｉｓ ０．５ ｍｇ／ｋｇ，ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｅｌａｍｉｎｅ ａＩ｝ｅ ａｂｏｖｅ ９１％，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ
５３２ ２００８，Ｖ０１．２９，Ｎｏ．１０
良晶不斗学
※分析柃测
物发生肾衰竭并导致死ＬＩ扪。 目前国内外测定食品中三聚氰胺含量的方法很少，
一般采用液相色谱法１３·５１、液相．质谱法肛６１、气相．质谱 法１７．８１、酶联免疫吸附测定法等。本实验结合ＦＤＡ三聚 氰胺检测方法、ＮＹ／Ｔ １３７２—２００７等方法，对色谱条件 及样品处理进行了考察和研究，避开毒性大的乙腈，采 用甲醇和０．０２ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵作为流动相，结果令人满意。
最近频频曝光的“三鹿奶粉”被检出含比较高的 三聚氰胺。这是继美国发生了许多猫狗宠物非正常死亡 事件（美国ＦＤＡ经过调查确认是宠物食品的原料受非法添 加的三聚氰胺污染，原料来自中国）以来，我国国内发 生重大的刚婴幼儿食用含三聚氰胺较高的奶粉而产生不 良后果的事件。
三聚氰胺（ｍｅｌａｍｉｎｅ）即蜜胺，又称氰尿酰胺，是一 种白色晶体，熔点３５４℃，难溶于水、乙二醇、甘油 和吡啶，略溶于乙醇，不溶于乙醚、苯和四氯化碳Ｉ¨。
收稿日期：２００８。０９．２５
作者简介：汪辉（１９８３．），男，助理工程师，主要从事食品检验研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｕｅｉｌ５８＠１６３．ｃｏｒｎ ·通讯作者：曹小彦（１９７３．），女，高级工程师，硕士，主要从事食品安全分析与评价研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｕｅｉｌ５８＠１６３．ｃｏｒｎ
万方数据
１．４．１
提取
准确称取５．０９样品于１００ｍｌ的三角瓶中，加入ｌ％
三氯乙酸超声波提取３０ｍｉｎ，取提取液用滤纸过滤，滤
液待用。
１．４．２
净化
依次用３ｍｌ甲醇、３ｍｌ水活化ＳＣＸ固相萃取柱，准
确移取５ｍｌ滤液分次卜柱，控制过柱速度在ｌｍｌ／ｍｉｎ以
内，再分别用５ｍｌ水、５ｍｌ甲醇淋洗ＳＣＸ固相萃取柱，
Ｏ．１０
０．０８
ｏ ０．０６ 《
０．０４
Ｏ．０２
０．００
Ｆｉｇ．８
２
４
６
８
时间（ｍｉⅡ）
图８未过柱的样品溶液的色谱图 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓａｍｐｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
抽干后用１０ｍｌ ５％氨水．甲醇分次洗脱，洗脱液在５０℃
下氮气吹至近干，准确加入５ｍｌ流动柏，在快速混匀器
上混匀１ｍｉｎ，经０．４５ ＩＬｔｍ的滤膜过滤，上机分析。
２ 结果与分析
２．１ 检测波长的选择与定性 取浓度为５ １．Ｊ－ｇ／ｍｌ的三聚氰胺标准使用液及某待榆样
品，在１９０一－４００ｎｍ波长处扫描，发现三聚氰胺在２０３．５ｎｍ 和２３４．１ｎｍ处有吸收峰（图２），实验表明，经过柱后的 样品溶液，在低波长下，几乎无其他物质干扰，且三 聚氰胺在低波长处，吸收较好，从而降低了方法的检 出限，提高了检测灵敏度。故选用２０３ｎｍ为三聚氰胺 的检测波长（图３）。同时，样品测定中可采用二极管阵 列检测器对其进行光谱扫描，并以保留时间和三维光谱 图相似性系数进行定性（图４）。
０．００８ Ｏ．００６毫０．０４Ｏ．００２ Ｏ．０００
Ｆｉｇ．６
２
４
６
８
ｌＯ
时间（ｒａｉｎ）
图６ 甲醇淋洗液的色谱图
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｅｌｕｅｎｔ
１００
９９
９８ 冰 斟 ９７
翟 ９６ 媸
９５
９４
２
４
６
８ １０
１２ １４
１６
洗脱液体积（ＩＩｌｌ）
Ｆｉｇ．７
图７ 洗脱液体积对洗脱率的影响 ＥｆｆｅｃＩｓ ｏｆ ｅｌｕｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ ｏｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ
ｉｓ ｙ＝２．３７×１０Ｓｘ＋１．２１×１０４ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ０．９９９８．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｅｘａｃｔ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｅａｓｉｂｌｅ．Ｉｔ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｅｔ．
２．４．２ 洗脱液浓度的选择 洗脱液５％氨水．甲醇体积对ＳＣＸ柱中吸附的三聚
氰胺的洗脱率有明显的影响。本实验对氨水．甲醇浓度 进行了研究，发现氨水．甲醇浓度小于５％时，洗脱效
１．００
’毫０．５０
０．００
２
４
６
８
１０
时间（ｍｉｎ） 图５ 水淋洗液的色谱图 Ｆｉｇ．５ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｅｌｕｅｎｔ
因为三聚氰胺有三个胺基，易与金属离子络合， 采用２ｍｌ １０６９／Ｌ亚铁氰化钾和２ｍｌ ２１９９／Ｌ醋酸锌沉淀蛋 白质时，三聚氰胺会有损失，回收率仅为５５％。三聚 氰胺是酰胺类物质，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。 三氯乙酸本来就有沉淀蛋白质的功能，因此在实验过程 中用三氯乙酸提取样品时无需再加沉淀剂。样品提取完 成后，用滤纸过滤，便可得到清液。 ２．４ 净化过程的优化
小柱５００ｍｇ／３ｍｌ。 １．２ 色谱条件
色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＣ．Ｃ Ｊ８色谱柱（２５０ｍｍ Ｘ ４．６ｍｍ， ５ ｕｍ ｉ．ｄ．）；柱温为４０℃；流速为０．８ｍｌ／ｍｉｎ＝流动相为 硫酸铵（Ｏ．０２ｒｅｅｌ／Ｌ）：甲醇＝９４：６（Ｖ，ｖ）；检测波长为２０３ｎｍ＝ 进样量１０Ｉ．ｔｌ。 １．３ 标准溶液的制备
Ｎ
Ｎ
厶么
Ｈ２Ｎ
Ｎ
ＮＨ２
图１ 三聚氰胺的结构式 Ｆｉｇ．１ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｌａｍｉｎｅ
１ 材料与方法
１．１ 试剂与仪器
三聚氰胺（９９％） Ｓｉｇｍａ公司；甲醇为色谱纯；硫 酸铵、氨水、三氯乙酸均为分析纯。
Ｗａｔｅｒｓ ｌ ５２５高液相色谱仪配２９９６二极管阵列检测
器，７１７Ｐｌｕｓ自动进样器，Ｅｐｏｗｅｒ工作站；超纯水处 理器：超声清洗器；氮吹仪；ｓＫ．１快速混匀器；ＳＣＸ
验。结果发现用乙腈为流动相时，乙腈洗脱能力较 强，三聚氰胺保留时间较小，乙腈正好在三聚氰胺出 峰处有背景吸收，很难分离，且乙腈毒性大。采用 硫酸钱（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）：甲醇＝９４：６（Ｖ／Ｖ），甲醇也有背景吸 收，但三聚氰胺与甲醇的背景吸收完全分开，分离度 大于１．５，且峰型对称，出峰时间比较理想。 ２．３ 沉淀剂的选择
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｓｐｏｓａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ