一种可靠的大鼠肝星状细胞分离及培养方法

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大鼠肝星状细胞分离纯化方法的改进

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【摘要】目的研究肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化形成机制，建立一种经济、简便、可靠的分离大鼠肝星
状细胞（Ｃ的方法。方法用链霉蛋白酶和胶原酶灌流大鼠肝脏，ｔｒｐ密度梯度离心分离ＨＳ并进行体ＨＳ）ＯｐｉｅｐＣ，外培养。结果细胞得率为５００／，率和纯度分别为９％、６。结论该方法简便、用、定、靠，． ×１鼠活８９实稳可为
坌至三
主第９鲞箜２期ＬｂＭｅｌ，ｎａｙ２１，ｏ．，ｏ２ａｄｉＪｕｒ２Ｖ１Ｎ．Ｃｎａ０９
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论著・
大鼠肝星状细胞分离纯化方法的改进

一种改良的肝星状细胞分离方法

一种改良的肝星状细胞分离方法陈超;陈宁;覃霞;朱樑【摘要】目的改良肝星状细胞(HSC)的分离方法,为深入研究肝纤维化的发生机制奠定基础.方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位消化肝脏,在1.040~1.060 g/mL 范围内多重多次密度梯度离心分离HSC,台盼蓝染色测定细胞存活率,328 nm紫外光激发HSC自发蓝绿色荧光法和Desmin细胞免疫荧光法鉴定HSC及检测HSC 纯度.Desmin和α-SMA细胞免疫荧光方法鉴定HSC静息和活化状态.结果每只大鼠肝脏HSC得率为(3~5)×107个,HSC存活率在95%以上,纯度在90%以上,体外培养14 d后活化的HSC纯度几乎达100%.结论在1.040~1.060 g/mL密度范围内采用多重多次密度梯度离心方法,避免了HSC分离过程中因密度配比误差及HSC自身密度相对不均一性所导致的细胞流失,建立了一种改良的肝星状细胞分离方法,HSC得率和纯度更加稳定,达到国外文献报道水平.%Objective To improve the method of isolating rat hepatic stellate cells (HSCs). Methods Rat hepatic stellate cells were isolated for several times with multiple density centrifugation within 1. 040 ～ 1. 060 g/mL after enzyme perfusion of liver. The cell viability was determined by Trypan blue exclution staining. The purity of HSCs was identified by retinoid antofluorescence and immunostaining by Desmin. The phenotype of HSCs was evaluated by characteristic immunofluorescence using antibodies specific for Desmin and α-SMA. Results About (3 ～5 ) × 107 HSCs were harve sted from each rat through multiple density centrifugation within 1. 040 ～ 1.060 g/mL. The cell viability was more than 95％ determined by the trypan blue exclusion method. The purity of freshly isolated HSCs and the activatedHSCs were more than 90％ and almost 100％ respectively assessed by retinoid antofluorescence and immunostaining cells using Desmin antibody. Conclusion The method of multiple density centrifugation greatly increased the production of HSCs by reducing loss of cells due to error of density preparation and their relative heterogeneity of density during isolating HSCs. This method is more convenient, efficient and reliable.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2011(020)006【总页数】4页(P564-567)【关键词】肝星状细胞;细胞分离;肝纤维化【作者】陈超;陈宁;覃霞;朱樑【作者单位】第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003;第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003;第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003;第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003【正文语种】中文【中图分类】R575肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生发展的中心环节［1］。

大鼠肝脏细胞同步分离与培养方法的建立

大鼠肝脏细胞同步分离与培养方法的建立潘艳1, 王万鹏2, 张启迪3, 华香1, 房凤梅1, 傅承宏3, 王维1（1.涟水县人民医院检验科，江苏淮安 223400；2.涟水县人民医院肾脏科，江苏淮安 223400；3.上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院消化科，上海 200080）摘要：目的建立一种同时分离大鼠肝细胞（parenchyma cell，PC）、肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）、肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，SEC）与库普弗细胞（Kupffer cell，KC）的操作方案。

方法采用EDTA/胶原酶两步灌注法获取肝细胞悬液，通过低速离心首先分离出PC组分，然后通过链蛋白酶E去除非实质细胞（nonparenchymal cell，NPC）中的PC，最后通Nycodenz和Percoll溶液进行梯度离心分离并纯化HSC、SEC和KC，体外培养并观察各细胞表型和功能的变化。

结果 PC、HSC、SEC和KC平均每克组织产量分别为（26 ± 9.2）× 106、（1.5 ± 0.2）× 106、（7.4 ± 1.5）× 106和（3.1 ± 0.9）× 106，活力分别为（93.1 ± 2.3）%、（90.1 ± 3.4）%、（96.2 ± 2.1）%和（98.2 ± 1.7）%，纯度分别为（98.5 ± 1.2）%、（95.1 ± 2.5）%、（93.6 ± 3.6）%和（98.1 ± 1.4）%；HSC在体外培养过程中逐渐丧失维生素A，转化为肌成纤维样（myofibroblast，MF）细胞；SEC在体外培养第3天出现凋亡，至7天凋亡达到顶峰，随后少量存活的细胞在体外增殖，至培养14天时形成典型的“铺路石”形态；培养14天的SEC保留清道夫功能，但丧失窗孔结构；KC可在体外增殖，培养至14天仍具有吞噬功能，表达特征性标志CD68。

柴胡皂苷d对氧化应激诱导的HSC-T6活化细胞内AP-1、NF-κB表达的影响及其雌激素受体机制

柴胡皂苷d对氧化应激诱导的HSC-T6活化细胞内AP-1、NF-κB表达的影响及其雌激素受体机制沈艳婷;刘进锴;阙任烨;陶智会;林柳兵;李勇【摘要】目的：研究柴胡皂苷d（SSd）对氧化应激诱导的肝星状细胞HSC-T6活化细胞内AP-1、NF-κB表达的影响及其雌激素受体（ER）机制，探讨植物雌激素对肝纤维化的作用机制，为临床应用植物雌激素提供理论依据。

方法：体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6，采用免疫组化法，检测SSd对氧化应激诱导的HSC-T6活化细胞内α-SMA蛋白表达的影响；采用Western blot法，观察SSd对氧化应激诱导的HSC-T6活化细胞内AP-1、NF-κB表达的影响。

结果：氧化应激处理HSC-T6细胞后，α-SMA、AP-1和P65/NF-κB表达明显增加。

如使用雌二醇（E2）或SSd预处理HSC-T6细胞24h后再接受氧化应激处理，三种蛋白表达明显降低，这种作用可被雌激素受体（ER）完全拮抗剂ICI-182780和ERβ拮抗剂THC抑制。

结论：E2、SSd可能通过调控ERβ，进而抑制核转录因子AP-1和P65/NF-κB的表达起到抑制HSC-T6活化的作用。

【期刊名称】《江苏中医药》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】4页(P81-83,84)【关键词】柴胡皂苷d;肝;星状细胞;HSC-T6细胞;体外实验;大鼠【作者】沈艳婷;刘进锴;阙任烨;陶智会;林柳兵;李勇【作者单位】上海中医药大学附属市中医医院脾胃病科，上海200071;中国人民解放军第二军医大学附属东方肝胆外科医院肝外一科，上海200433;上海中医药大学附属市中医医院脾胃病科，上海200071;上海中医药大学附属市中医医院脾胃病科，上海200071;上海中医药大学附属市中医医院脾胃病科，上海200071;上海中医药大学附属市中医医院脾胃病科，上海200071【正文语种】中文【中图分类】R282.710.5肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是由于各种致病原因所致慢性肝损伤反复修复，经过过度的创伤愈合应答，导致瘢痕组织形成，引起细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝脏内过度增生与异常沉积所致肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理变化，其发生发展是一个连续的阶段性过程。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。

在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。

本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。

一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。

以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。

2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。

3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。

4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。

通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。

1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。

正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。

2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。

3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。

可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。

通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。

在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。

HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告

HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告前言肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞（fat-storing cell，FSC）、脂细胞（1ipocyte）、维生素A贮存细胞（vitamin A-storing cell）、窦周细胞（perisinusoidal cell）、Ito细胞等。

HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝细胞。

其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。

此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。

HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。

胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。

正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。

正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型，其功能主要有：（1）代谢和贮存Vitamin A：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。

视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。

（2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。

（3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。

目前的研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要合成细胞。

正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。

HSC 还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。

咖啡酸苯乙酯对肝星状细胞的作用及机制分析

!489:;4<:!咖啡酸苯乙酯对肝星状细胞的作用及机制分析杨　宁１，邓　江２，王怡恺２，常　莎１，高　宁２，王文俊２，党双锁２，石娟娟２１陕西中医药大学附属医院肿瘤医院，陕西咸阳７１２０００；２西安交通大学第二附属医院感染科，西安７１０００４摘要：目的　探讨咖啡酸苯乙酯（ＣＡＰＥ）对大鼠肝星状细胞（ＨＳＣ）－Ｔ６的作用及作用机制。

方法　不同浓度ＣＡＰＥ（５、１０、１５μｍｏｌ／Ｌ）分别作用于ＨＳＣ－Ｔ６细胞，同时构建ＧＦＰ－ＬＣ３质粒转染至ＨＳＣ－Ｔ６细胞，自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂３－Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ（３－ＭＡ）进行干预，采用ＭＴＴ方法检测ＣＡＰＥ对ＨＳＣ－Ｔ６细胞增殖的影响，透射电镜观察ＣＡＰＥ对ＨＳＣ－Ｔ６细胞超微结构的影响，细胞免疫荧光实验检测ＣＡＰＥ对ＨＳＣ－Ｔ６细胞ＬＣ３表达的影响，ｑＲＴ－ＰＣＲ检测自噬相关基因ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１２、Ｂｅｃｌｉｎ１和ＬＣ３ｍＲＮＡ的表达情况，Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ检测ＡＴＧ７、Ｂｅｃｌｉｎ１、ＬＣ３Ｉ／Ⅱ、ｐ－ＡＫＴ／ＡＫＴ、ｐ－ｍＴＯＲ蛋白的表达情况。

计量资料组间比较采用单因素方差分析及Ｄｕｎｎｅｔｔ－ｔ检验。

结果　ＣＡＰＥ干预组较对照组可抑制ＨＳＣ－Ｔ６细胞增殖，且生长明显受到抑制，细胞质中可观察到脂滴和轮盘状自噬体散在分布。

与对照组（１３．３４％±２．５９％）相比，不同浓度ＣＡＰＥ５μｍｏｌ／Ｌ（２３．６８％±３．７６％，ｔ＝－５．５５３，Ｐ＜０．００１）、１０μｍｏｌ／Ｌ（４３．４７％±３．８３％，ｔ＝－１５．９５８，Ｐ＜０．００１）、１５μｍｏｌ／Ｌ（５７２５％±２．７８％，ｔ＝－２８．３３４，Ｐ＜０．００１）的ＬＣ３荧光染色均显著增强，且呈正相关。

ＣＡＰＥ干预组（１０、１５μｍｏｌ／Ｌ）ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１２、Ｂｅｃｌｉｎ１和ＬＣ３ｍＲＮＡ水平明显增加（Ｐ值均＜０．０５）。

大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究

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［ｓａｔｊｃｉｅＴｘｌｅａｃｎｍｉａａｄｅｓｔｏｏｏｔｇａｄｃｌｒｇｔｅｒｔｅａｃｓｌｔｃｌＡｂｔｃ］Ｏｂｅｔ：ｏｅｐｏｎｅｏｏｃｎａｙｍｅｄｆｒｉｌｉｎｕｔｉａｐｔｔｌｅｅｌｒｖｒｌｈｓａｎｕｎｈｈｉｅａｓ
冲图分类号】３９２８Ｒ２．＋ｆFra bibliotek文献标识码】Ａ
ｆ编号】１７ — ２０２１）５ｂ一３ — ３文章６３７１（０００（）０００
Ｔｈｅｅｐｒｍｅｔｌｓｕｄｆｒｔｈｐａｉｔｌａｅｃｌｓｓｐａａｉｎａｕｔｖｔｏｘｅｉｎａｔｙｏａｅｔｃｓｅｌｔｅｌｅｒｔｏｎｄｃｌｉａｉｎ
ｔｔｄｈａｈｇｎｓｓｏｅａｉｂｏｉ．ｅｈｄ：ＡｄｌｈａｔｙｒｔｓｌｔｄｌｅｓｗｅｅｐｒｓｄｂｙｌｐｏａｅｏｓｕｙｔｅｐｔｏｅｅｉｆｈｐｔｆｒｓｓＭｔｏｓｃｉｕｔｅｈａｓｏａｅｉｒｒｅｆｅｙｃｃｏｈｒｓｌｉｖｕｌｕｄｉｉｏＡｆｒｔｅｄｎｉｒｄｅｔｃｎｒｕａｉｎｏｙｏｅｚｔｔｅｓｅｄｏ０００ｒｍｉｎｈｏｓｅｄｃｎｉｉｎｖｔ．ｔｈｅｓｔｇａｉｎｅｔｉｇｔｆｎｃｄｎｅａｈｐｅｆ２０／ｎａｄｔｅｌｗ— ｐｅｅ — ｑｒｅｙｆｏ

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肝星状细胞的方法。
该法是一种较理想的分离
［关键词】肝星状细胞；细胞分离；肝纤维化［中图分类号］Ｒ５５［７文献标识码］Ａ［文章编号］１７３０（００１６４— ８６２１）２—１５０１７— ４
ｄｉ１．９９ｊｉｎ１７３０．００１．１ｏ：０３６／．ｓ．６４— ８６２１．２０ｓ
ＡｅｉｂｅｍｅｈｄｆｒｔｅｉｏａｉｎａｄｃｌｒｆｒｔｈｐｔｔｌｔｅｌＺｔＮＧＧｏ，ＨＵＮＣｕｒｌｌｔｏｏｈｌｔｎｕｔｅｏａｅａｃｓｅｌｅｃｌａｓｏｕｉａｓｔＡｕＡＹｎ，
通讯作者：张法灿（９８一）男，１５，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向：消化系统疾病的基础与临床研究。Ｅｍｉ：ａｇｅｎ２．ｏ－ａｌｚｎｆａ＠１６ｃｒｈａｎ
［摘要］目的探讨一种高效、济、经稳定的肝星状细胞的分离方法，肝纤维化研究提供细胞模型。为方法应用链霉蛋白酶、胶原酶灌流，Ｎｃｄｎ为分离介质，以ｙｏｅｚ采用密度梯度离心法分离大鼠的肝星状细胞。结果肝星状细胞的获得率为（．０６）×１只、３２± ．７０／存活率为９％以上。结论０
ｇｏｉｎ，Ｎａｎｎ３０１Ｃｉａｎｉｇ５０２，ｈｎ
［ｂｔａｔＯｂｅｔｅｏｄｖｌｐａｐｕｔｅｉｅｐｎｉｎａｌｍｔｏ０ｔｅｉｌｏｎｕｔｒＡｓｃ］ｒｊｃｖＴｅｅｍｄｅｖ，ｘｅｓｅａｄｓｂｅｅｄｆｏｔｎａｄｃｌｅｉｏｉｎｖｔｈｒｈｓａｉｕ
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［ｙｗｒｓＨｅａｃｓｌｔｃＵＨＣ）Ｃｌｉｌｏ；ＨｐｔｂｏｉＫｅｏｄ］ｐｔｔｌｅｅｓ（Ｓｓ；ｅｏｔｎｉｅａｌｓａｉｅａｉｆｒｓｃｉｓ
自１８９２年Ｋｏｋ等…首次成功分离出肝星状ｎｏ
细胞（ｅａｃｓｌｔｃｉ，Ｓｓ以来，来越多的ｈｐｔｔｌｅｅｓＨＣ）ｉｅａｌ越资料证实，Ｓｓ肝纤维化进程的关键细胞－。在ＨＣ乃２］慢性肝炎病毒、酒精、物等一种或多种慢性损伤刺毒激下，静止的ＨＣ活化、殖并产生大量的细胞外Ｓｓ增
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中国临床新医学２１年００
１月２
第３卷笫１期２
・１５・１７
一
种可靠的大鼠肝星状细胞分离及培养方法
张国，黄俊娟，张法灿，刘斐，陈兴洲，梁列新
基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：０６１５；人社部资助留学人员科技活动择优项目（３９０４）编号：０９３；广西自然科学基２００）金资助项目（编号：１５３）０３０５；广西卫生厅重点科研课题（编号：桂卫重２０５）０９８
作者单位：３０１南宁，５０２广西壮族自区人民医院消化内科（治张
作者简介：张
国，张法灿，梁列新）４０６湖北，；３００武汉大学人民医院（黄俊娟）；
斐，陈兴洲）
５０２南宁，３０１广西壮族自治区人民医院科研实验中心（刘
国（９９一，，１６）男博士，主任医师，研究方向：慢性肝病的基础与临床研究。Ｅｍｉｚａｇｕｇ＠ｈｔａ．ｏ－ａ：ｎｇｏｌｈｘｏｉｃｍｌｍ
ｏｔｅａｃｓｌｔｅＵＨＳｓ８ａｃｌｍｄｌｒｅｓｄｅｆｅａｃｆｒｉＭｅｏｓａＨＣｅＯｆａｈｐｔｅａｅｓ（Ｃ）ａｅｌｏｅｆｔｉｓｐｔｂｏｓｔｄＲｔＳｓｒｉ．ｒｉｔｌｅｔｕｏｈｏｈｉｉｓ．ｈｗｅＳ