一种简单、经济、高效的大量肝细胞培养方法
肝脏细胞在体外培养技术的研究
肝脏细胞在体外培养技术的研究肝脏是人体最重要的器官之一，其主要功能是解毒、代谢、贮藏和合成。
然而，肝脏疾病在世界范围内仍然是一个重要的公共卫生问题。
在过去几十年中，肝脏细胞在体外培养技术的研究逐渐成为了一项重要的生物医学研究领域。
这项技术是指从人体肝脏中分离出来的肝细胞，通过外界提供的营养条件，使其在体外继续生长和分化。
这项技术不仅有助于深入了解肝脏生理学和疾病发生机制，还可以用于药物筛选、毒理学研究和肝移植等领域。
然而，肝脏细胞在体外培养的难度很大，一方面是因为肝脏细胞在体外容易失去其功能和特性，另一方面则是由于肝脏细胞的可塑性非常弱。
因此，如何在体外培养肝脏细胞，并保持其结构和功能的完整性成为了研究的重点。
从组织学角度来看，肝脏的结构非常复杂。
肝脏由肝小叶组成，每个肝小叶包含数百万个肝细胞、肝窦和肝管。
肝细胞没有直接连接，而是通过肝窦相连。
这样的结构能够使肝细胞与血液接触，从而能够达到解毒和代谢的作用。
因此，要在体外培养肝脏细胞就需要考虑如何模拟肝脏这种结构。
在研究中，肝细胞常用的培养基是DMEM/F12(1:1),其中DMEM包含了必需的氨基酸、糖类和维生素，而F12则富含微量元素。
为了模拟肝脏的组织结构，可以使用3D培养体系，如细胞聚集体、生物支架和生物芯片等。
这些3D培养体系可以更好地模拟肝小叶和肝窦之间的关系，从而提高肝细胞在体外培养中的生存率和功能表现。
其中，生物支架是一种被广泛使用的3D培养体系，它可以提供一种类似于肝窦的微环境，并通过支架对肝细胞进行定位和定向生长。
生物芯片则是一种新型的3D培养系统，基于微流体和微加工技术，能够在非压力、低剪力的微环境下培养肝细胞。
使用这种技术，可以更精确地调控细胞生长的微环境，从而获得更稳定的结果。
除了3D培养体系之外，肝细胞在体外培养中的质量管理也非常重要。
在这方面，正常的肝细胞生态系统、细胞密度、超生和梯度离心等操作都会对细胞的品质产生重要影响。
一种猪肝细胞的原代培养方法[发明专利]
![一种猪肝细胞的原代培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/7a2dd9183069a45177232f60ddccda38376be1f7.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710525598.X(22)申请日 2017.06.30(71)申请人 云南农业大学地址 650000 云南省昆明市盘龙区黑龙潭(72)发明人 郭荣富 李美荃 张春勇 陈克嶙 安清聪 (74)专利代理机构 昆明盛鼎宏图知识产权代理事务所(特殊普通合伙)53203代理人 许竞雄(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种猪肝细胞的原代培养方法(57)摘要本发明公开了一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于：包括依次进行的肝脏的获取、肝脏组织压块、肝细胞培养、原代细胞鉴定，其中，所述肝脏组织压块是将肝脏于灭菌培养皿中，剪碎后放置在30～60目网筛中碾压，收集滤过的肝脏组织块于灭菌容器中。
本申请采用网筛碾压组织块培养法，通过网筛碾压得到合适的猪肝脏组织块，大小适宜贴壁生长，肝细胞长势良好。
权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 107151651 A 2017.09.12C N 107151651A1.一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于：包括依次进行的肝脏的获取、肝脏组织压块、肝细胞培养、原代细胞鉴定，其中，所述肝脏组织压块是将肝脏置于灭菌培养皿中，剪碎后放置在30～60目网筛中碾压，收集滤过的肝脏组织压块于灭菌容器中。
2.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肝脏来源于新生仔猪，所述新生仔猪的猪龄小于5h。
3.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肝脏的获取是将新生仔猪浸泡于酒精中消毒后，颈部处死，移至超净工作台，取出肝脏，剥除纤维成分，所述纤维成分包括被膜和血管。
4.根据权利要求3所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述酒精为体积分数75%的酒精，消毒时间为20s。
5.根据权利要求1所述的一种猪肝细胞的原代培养方法，其特征在于，碾压肝脏时不断用含血清DMEM冲洗后离心，得到肝脏组织压块。
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程(二)
肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程(二)肝细胞的体外扩增培养方法及应用与流程一、引言肝脏是人体重要的器官之一，肝细胞的研究对于治疗肝疾病和药物研发具有重要意义。
体外扩增培养肝细胞是研究肝脏生物学和药物代谢的关键步骤。
本文将详细介绍肝细胞的体外扩增培养方法及其应用与流程。
二、肝细胞体外培养方法1.培养基的配制•配制DMEM/F12基础培养基，并加入胎牛血清（FBS）和抗生素。
•应用无菌操作将培养基放置在培养瓶中，密封保存。
2.肝细胞的分离和培养•将新鲜动物肝脏取出，迅速放入含有DMEM/F12培养基和酶的培养皿中。
•利用离心等步骤，轻轻将肝组织分离成单个肝细胞。
•将分离的肝细胞转移到培养瓶中，加入预先配制好的培养基。
•将培养瓶放入恒温恒湿的培养箱中，经过适当时间的培养，肝细胞会开始扩增。
三、肝细胞体外扩增培养的应用1.药物代谢研究•体外培养的肝细胞可以用于评估药物的代谢途径和代谢产物。
•利用体外扩增培养的肝细胞，可以进行药物代谢动力学研究，了解药物在人体内的代谢速率和排泄途径。
2.肝脏疾病研究•体外培养的肝细胞可以用于研究肝脏疾病的分子机制和新药的筛选。
•通过体外培养，可以模拟肝脏疾病的环境，从而寻找有效的治疗方案。
四、肝细胞体外扩增培养的流程1.准备工作•配制培养基和相关试剂。
•检查培养设备和器具的无菌状态。
2.肝细胞的分离•使用无菌操作，将肝脏取出并分离。
•利用酶的作用，将肝组织分离成单个肝细胞。
3.培养肝细胞•将分离的肝细胞转移到培养瓶中，并加入培养基。
•将培养瓶放入培养箱中，提供适当的温度和湿度。
4.培养细胞的维护•定期更换培养基，以提供养分和生长因子。
•检查细胞的健康状态和扩增情况。
5.应用与研究•根据需要，将培养的肝细胞用于药物代谢研究或肝脏疾病模型的建立。
•分析和记录实验结果，并进行相应的数据处理和统计分析。
五、结论通过体外扩增培养肝细胞，可以为肝脏相关研究提供重要的实验材料和平台。
介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法
钙的 Ô胶原酶灌注液 30 m ,l 37 e 循环灌注 (图 1), 流速 5 m l/m in, 约 10 m in后, 肝脏呈龟裂状; 将肝脏 移至另一无菌培养皿中, 内置 60 m l预冷的不含血 清的肝细胞清洗液, 小心撕破肝包膜, 轻轻抖落肝细 胞, 制成肝细胞悬液。将肝细胞悬液先经过 100目 的不锈钢滤网, 以除去结缔组织和细胞团块, 300 r / m in离心, 5 m in; 然后细胞悬液再经过 200目的不锈 钢滤网过滤, 300 r /m in离心 3 m in, 重复两次。向沉 淀的肝细胞中加入 50 m l肝细胞清洗液, 轻轻吹打 均匀, 加入到预先配制好 P erco ll密度分离液中, 500 r/m in离心 5 m in , 肝细胞由于密度接近 P ercoll密度 分离液而悬浮于其中, 组织碎片沉于底部, 而肝非实 质细胞、破碎肝细胞及红细胞等漂于顶部; 弃上清, 取肝细胞并向其中加入适量含 10% FBS 的肝细胞 培养液中, 轻轻吹打均匀, 制成肝细胞悬液。镜下见 肝细胞透亮, 圆形或椭圆形, 核居中, 透光度好 ( 图 2)。
In troduce a fac ility and h igh efficien cy separat ion m ethod of rat p rimary hepatocytes ZHANG X ingyuan1 SONG X iangqin1 ZHANG F ang1 OU K un1 LB Y i2
1 A ffilia ted H osp ita l o f B inzhou M edical U niversity, B inzhou 256603; 2 the F irstA ffiliated H ospita l of X ia'n Jiaotong U niversity = Ab stract> O bjective Introduce a fac ility and h igh e fficiency sepa ration m e thod of rat prim ary hepa to cy tes. M eth ods R a t hepatocy tes we re iso la ted and pur ified by us ing the m od ified Selgen. s tw o-step m ethod. R esults T he average y ield of rat hepa tocy tes w as ( 1156 ? 0. 31) @ 108 percen t rat, w ith an average v iability o f ( 95. 1 ? 4. 2)% and pur ity of 98% . Conc lusions The sepa ra tion m ethod of hepatocytes w as sim ple and easy, w ith adv antages o f h igh y ield, good v iability and h igh pur ity, so it w ou ld be applied w idely in o rd inary laboratory. = K ey words> P rim ary hepatocy tes; Sepa ra te; Co llagenase
肝细胞的培养方法2006.3.1
肝细胞培养方法一、培养概要1）在无菌状态下，采取大鼠的游离肝细胞2）将细胞置于well中，在Williams’ medium E (5%cuff serum)20%O2，5%CO2的环境下培养2.5小时后，将细胞清洗一次。
3）之后，再在相同的培养基中培养21.5小时（合计24小时）4）用得到的第一代培养肝细胞进行各种试验。
二、实验方法:1 洁净台的使用方法1）将灭菌物喷过酒精后，置入其中。
2）手洗过后，喷过酒精，方可伸入其中。
3）细胞培养用的培养皿也需盖上盖子，四周喷过酒精后方可置入其中。
4）在不操作的时候，只将1号键的按纽处于打开的状态（紫外线照射）。
在操作中，只能打开两个按纽（荧光灯，风）。
要注意不要让肌肤直接接触紫外线。
5）在使用洁净台时要点着喷灯。
但是由于之前有过煤气喷灯导致火灾的事故，因此点着喷灯的时候，千万不要离开。
6）在洁净台内部，通常放置以下的物品。
除此之外的，在每次实验结束后要尽快拿出去，注意洁净台内部尽量不要放物品。
7）装有用70%EtOH浸过剪好棉花的罐子装有吸移管橡胶乳头、吸耳球的小托盘外科用手术钳子（大）8）用钳子镊取浸有70%EtOH的棉花，将洁净台内的床擦干净，开始操作。
棉花或者乙醇一旦没有了，要马上供给，将周围用酒精喷过后置入其中。
9）以上第8）点的操作最好是在感觉到洁净台内床有污染时进行。
2 培养板的准备24井一次性培养板3块，为已经消毒灭菌好的，可直接使用。
3 瓶的打开，关闭方法1）瓶有100ml、250ml、500ml，1000ml，每一种都可以是半永久性的高压灭菌器。
2）瓶绝对不能用手打开的，用钳子（大）打开。
但是，因为也有第一下打不开的情况，这种时候，只有第一下可以用手打开。
3）在洁净台外，将瓶口周围的塑料绝缘带去掉，瓶的周围喷乙醇水，之后置于洁净台内。
4）首先，在打开瓶子之前用喷灯灼烧瓶口（*通常用喷灯将瓶口、盖、还有钳子灼烧灭菌是很好的）。
5）灼烧钳子。
干细胞 肝脏类器官培养方法
干细胞肝脏类器官培养方法
肝脏类器官的培养方法涉及多个步骤，具体如下：
1. 准备所需工具和设备，包括剪刀、镊子（钝头）、培养皿、细胞培养箱、层流超净工作台、带有制冷功能和摇摆吊桶式转子的离心机、37°C水浴、冰桶、实验室冰箱、助吸器和血清移液管（5 mL）、微量移液器及吸头（2-200 μL）、锥形管（10 mL 和 50 mL，无菌）、24 孔板（经过组织培养处理，无菌）、真空泵、培养基过滤装置（μm，500 mL，无菌）、注射器（50 mL，无菌）、针头过滤器（μm，无菌）、细胞培养废液缸。
2. 制备肝脏类器官初始培养基和扩增培养基。
建议将肝脏导管类器官的生长去除，同时去除红细胞。
3. 在无菌条件下，将干细胞接种在24孔板中，并加入肝脏类器官初始培养基。
4. 将细胞培养在37°C、5% CO2的细胞培养箱中，并保持适当的湿度。
5. 观察干细胞的生长和分化情况，并适时更换培养基。
6. 当肝脏类器官形成时，将其转移至新的培养孔板中，继续培养。
7. 通过显微镜观察肝脏类器官的结构和形态特征。
请注意，这些步骤只是大致框架，具体操作可能会因实验条件和干细胞来源而有所不同。
因此，在进行实验前，建议仔细阅读相关文献并咨询专业人士的意见。
肝细胞培养方法
低浓度胶原酶原位循环灌流法：1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥钠10mg/100g体重、肝素20 u/100g体重分别腹腔注射以麻醉和抗凝。
2 10-15分钟后固定大鼠，75%酒精消毒，紫外灯照射15-30分钟。
腹部再次75%酒精消毒后正中切开打开腹腔并更换器械。
3显露肝门部门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下下腔静脉2-3cm，各置一结扎线，暂不结扎。
4穿刺针插入门静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵时，输液器亦可），同时剪断肝下下腔静脉远端。
5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝内血液，1分钟内即可见肝脏颜色变浅，持续灌注10分钟至肝脏呈米黄色。
同时切开胸腔结扎肝上下腔静脉。
6插另一硅胶管入肝下下腔静脉并结扎固定，换D-Hanks液为胶原酶消化液(370C预热)循环灌注消化，灌流速度为10-20ml/min，持续时间10-20分钟至肝质变软，压之凹陷不易恢复。
7停止灌注，小心剪取各肝叶置入消毒平皿内，加入适量肝细胞洗涤液（4oC预冷），撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。
8 100目筛网过滤入50ml离心管，500rpm离心1-2分钟。
去上清，沉淀加入RPMI 1640 （4oC预冷）20-30ml洗涤3次。
9肝细胞沉淀加入肝细胞培养液重悬为10ml，取适量计数并用0.4%台盼蓝染色判断存活率。
后即可按实验设计接种培养.几点体会与疑问:1.开始肝素对所研究的实验结果有没有影响.比如你想测一种蛋白,可能肝素本身是一个因素.肝素原因在于抗凝不良致肝内血液淤滞严重影响消化灌注这一问题。
因为发现永不用肝素细胞的提取量差不多.2.第四步的同时剪断肝下下腔静脉远端很重要.3.输液器的胶原酶消化液的温度控制问题.4.4oC预冷的肝细胞洗涤液对细胞的功能有没有影响.觉得首先细胞缺氧的可能.所以觉得采取常温行不行?。
人体肝脏细胞培养技术研究
人体肝脏细胞培养技术研究人类的肝脏是一个极其重要的器官，它提供了许多重要的功能。
肝脏能解毒，合成胆汁，分解脂肪，维持酸碱平衡以及修复受损的组织。
然而，人们往往会因为饮酒，吃药和某些疾病如乙型肝炎而导致肝脏受损。
因此，我们需要一些新的技术来研究人类肝脏，以及条件反射下如何提高这个器官的功效。
其中一个重要的研究方向就是肝脏细胞培养技术。
肝脏细胞培养技术是指将肝脏细胞分离、培养和保存的技术。
他可以分为三个阶段：第一阶段是肝脏组织的分离。
研究人员需要收集新鲜的肝脏组织来进行分离。
通常，肝脏是从猴子或小鼠中获取的，并且进行相应的预处理。
进行预处理的主要目的是去除血管和其他连接组织的部位，并产生合适的细胞分离酶。
对于许多种高质量的肝脏细胞，就需要使用胶原酶（Collagenase）。
肝脏细胞需要分离，但是人们在将肝脏细胞分离之前需要进行尖叫管理，确保这种方式对人体是安全的。
第二个阶段是肝脏细胞的培养。
在这个阶段，肝脏细胞将被在培养皿或培养板中生长。
培养基是必须的，它被设计用来储存、支持和激发肝脏细胞的生长。
通常培养基是指含有高糖、氨基酸和其他类似物质的液体溶液。
这些物质能够满足肝细胞的能量需求，通常是3-5天的生长周期。
这个周期包括细胞增殖、分化、功能恢复和发挥其功能。
第三个阶段是肝细胞的存储。
在细胞培养完成之后，存储和传输细胞变得非常重要。
细胞可以以不同的方式保存，如冻干、低温液氮中的冰冻保存、冷藏保存和液氮中的气相保存。
在保存细胞之前，研究人员需要检查并收集细胞，以确保生长和功能特性等不会受到影响。
肝脏细胞培养技术是一个复杂的过程，需要非常多的专业技能。
这种技术几乎可以用于任何类型的基础和应用性研究，如药物研究、细胞毒性测试等。
然而，需要注意的是，这种技术有缺陷，可能与真实生物体环境存在差异。
因此，需要结合其他模型来研究肝脏及其功能特性在真实背景下的表现。
肝脏细胞培养技术在临床医学中的应用非常广泛。
它可以用于治疗肝病、研究癌症、开发新药物以及中毒的检测。
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肝细胞的传代培养
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因为这个小题的化学味道比较浓而删除" 这种做 法体现了高考生物学试题设计过程中 $处理生物学和 物理(化学知识关系方面所坚持的原则"
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