肝细胞培养
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
步骤一、实验材料准备1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
肝脏细胞工程及应用研究
肝脏细胞工程及应用研究肝脏是人体最重要的器官之一，负责过滤血液、储存能量、合成蛋白质等多种功能。
然而，由于各种原因，肝脏损伤和疾病的发生率逐年上升。
肝脏移植是治疗肝病的有效手段，但异体移植存在很多问题，例如供体不足、排异反应等。
因此，肝脏细胞工程和应用研究成为了一种备受关注的新型治疗方法。
一、肝脏细胞工程的原理及技术路线肝脏细胞工程是利用体外培养的肝细胞并借助一系列生物技术手段以增强其生存、增殖、成熟及代谢功能，并且利用体外培养的肝细胞，重建肝脏外生环境，使之具有新肝脏的功能。
其基本步骤如下：1.肝细胞分离和培养首先需要从供体肝脏中获得肝细胞，一般采用胶原酶消化和梭菌筛选等方法来获得具有代表性和可行性的肝细胞。
然后将肝细胞培养在特定培养条件下，如使用适宜的培养基、温度、二氧化碳浓度等，以保证其生存、增殖和成熟。
2.肝细胞功能增强进行肝细胞功能增强，包括肝细胞的生长、成熟、代谢能力、细胞完整性、免疫逃避、肝细胞植入技术、肝细胞外壁等诸多方面的增强。
3.肝细胞植入宿主体内并发挥功能通过肝细胞移植或注射等方式将体外培养的肝细胞或其代谢物质植入宿主体内，并利用肝细胞的代谢途径和生理功能，发挥其治疗作用。
二、肝脏细胞工程的应用研究1. 肝病治疗肝细胞工程可用于治疗肝疾病，包括肝衰竭、肝癌、肝硬化、肝炎等。
例如，体外培养肝细胞可以用于替代肝移植，减少手术风险和患者拒绝等问题。
通过移植体外培养肝细胞，可以恢复肝脏的正常代谢和解毒功能，同时减少对外界的压力与多种药物的治疗，为肝脏的恢复做出贡献。
2. 新药试验体外培养肝细胞也可用于新药效果的检索。
通过使用体外培养肝细胞体系，可以模拟人体肝脏代谢过程，快速筛选有前途的药物，大大降低药物研发的时间和成本。
这项技术不仅为药品开发公司提供了新的研究方法，还有助于加速新药的上市进度，降低了阻止人类疾病进步的药品的研发成本。
目前，肝细胞工程技术已经被广泛应用于新药研发和临床前药效学研究。
蛙肝脏细胞实验报告
一、实验目的1. 学习蛙肝脏细胞的培养方法。
2. 观察蛙肝脏细胞的形态和生长特点。
3. 探讨蛙肝脏细胞在体外培养条件下的生物学特性。
二、实验材料1. 蛙：雌雄不限，体重约50克。
2. 培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素）。
3. 培养器具：细胞培养瓶、细胞培养板、移液枪、显微镜、无菌操作台等。
4. 实验试剂：胰蛋白酶、EDTA、D-Hank's平衡盐溶液、乙醇、DEPC水等。
三、实验方法1. 获取蛙肝脏细胞：将蛙置于解剖盘中，沿腹中线切开皮肤，取出肝脏，用D-Hank's平衡盐溶液冲洗干净。
2. 制备细胞悬液：将肝脏剪成小块，用胰蛋白酶和EDTA消化，制成细胞悬液。
3. 细胞计数：用细胞计数板对细胞悬液进行计数，调整细胞浓度为1×10^5个/mL。
4. 细胞培养：将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
5. 观察细胞形态：在显微镜下观察细胞形态、生长特点等。
6. 细胞传代：当细胞贴壁生长至80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代培养。
四、实验结果1. 细胞形态：在显微镜下观察到蛙肝脏细胞呈多边形，细胞核清晰可见，细胞间连接紧密。
2. 细胞生长特点：细胞在培养过程中，呈指数增长，生长速度较快。
3. 细胞传代：经过多次传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
五、讨论与分析1. 蛙肝脏细胞培养的成功，为研究蛙肝脏的生物学特性提供了实验基础。
2. 观察到蛙肝脏细胞在体外培养条件下，具有较好的生长特性，表明细胞在适宜的培养环境中能够保持正常的生物学功能。
3. 本实验中，细胞形态、生长特点等指标均符合蛙肝脏细胞的生物学特性，为进一步研究肝脏细胞功能提供了有力支持。
4. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免污染。
此外，细胞培养过程中要严格控制培养条件，如温度、pH值、气体环境等，以保证细胞正常生长。
六、结论通过本次实验，我们成功培养了蛙肝脏细胞，并观察了其形态和生长特点。
干细胞 肝脏类器官培养方法
干细胞肝脏类器官培养方法
肝脏类器官的培养方法涉及多个步骤，具体如下：
1. 准备所需工具和设备，包括剪刀、镊子（钝头）、培养皿、细胞培养箱、层流超净工作台、带有制冷功能和摇摆吊桶式转子的离心机、37°C水浴、冰桶、实验室冰箱、助吸器和血清移液管（5 mL）、微量移液器及吸头（2-200 μL）、锥形管（10 mL 和 50 mL，无菌）、24 孔板（经过组织培养处理，无菌）、真空泵、培养基过滤装置（μm，500 mL，无菌）、注射器（50 mL，无菌）、针头过滤器（μm，无菌）、细胞培养废液缸。
2. 制备肝脏类器官初始培养基和扩增培养基。
建议将肝脏导管类器官的生长去除，同时去除红细胞。
3. 在无菌条件下，将干细胞接种在24孔板中，并加入肝脏类器官初始培养基。
4. 将细胞培养在37°C、5% CO2的细胞培养箱中，并保持适当的湿度。
5. 观察干细胞的生长和分化情况，并适时更换培养基。
6. 当肝脏类器官形成时，将其转移至新的培养孔板中，继续培养。
7. 通过显微镜观察肝脏类器官的结构和形态特征。
请注意，这些步骤只是大致框架，具体操作可能会因实验条件和干细胞来源而有所不同。
因此，在进行实验前，建议仔细阅读相关文献并咨询专业人士的意见。
小鼠肝细胞实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解小鼠肝细胞的基本形态结构；2. 掌握肝细胞分离、培养及观察的基本方法；3. 通过观察肝细胞在不同条件下的变化，探讨肝细胞的功能特性。
二、实验原理小鼠肝细胞是研究肝脏生理和病理的重要模型。
通过分离、培养和观察肝细胞，可以了解肝细胞的基本形态结构，以及在不同条件下的生理和病理变化。
本实验采用差速离心法分离小鼠肝细胞，并进行体外培养。
三、实验材料1. 小鼠：体重20-25克，雌雄不限；2. 培养基：DMEM培养基；3. 胎牛血清；4. 胰蛋白酶；5. 离心管；6. 离心机；7. 显微镜；8. 其他实验器材。
四、实验方法1. 分离肝细胞：（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏剪成小块，加入胰蛋白酶，消化肝细胞；（3）将消化后的肝细胞悬液过滤，收集滤液；（4）将滤液以1000 rpm离心5分钟，弃去沉淀；（5）将上清液以2000 rpm离心10分钟，收集沉淀，即为肝细胞。
2. 肝细胞培养：（1）将肝细胞用DMEM培养基洗涤，制成细胞悬液；（2）将细胞悬液以1×10^5个细胞/毫升的密度接种于培养瓶中；（3）置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 肝细胞观察：（1）在显微镜下观察肝细胞的基本形态结构；（2）观察肝细胞在不同条件下的变化，如细胞形态、细胞器分布等。
五、实验结果1. 肝细胞形态：（1）肝细胞呈多边形，细胞核位于细胞中央，细胞质丰富，含有丰富的细胞器；（2）细胞间连接紧密，形成单层细胞。
2. 肝细胞在不同条件下的变化：（1）正常培养条件下，肝细胞生长良好，细胞形态稳定；（2）在缺氧条件下，肝细胞出现肿胀、空泡化等变化；（3）在肝损伤因子作用下，肝细胞出现变性、坏死等变化。
六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养小鼠肝细胞，为后续研究肝细胞的功能特性提供了良好的实验材料。
2. 肝细胞在正常培养条件下生长良好，表明肝细胞具有较强的生存能力。
3. 肝细胞在不同条件下的变化表明，肝细胞具有调节自身生理和病理状态的能力。
某研究小组对某种动物的肝癌细胞和正常肝细胞进行培养以用于药理研究，下列叙述正确的是（ ）
某研究小组对某种动物的肝癌细胞和正常肝细胞进行培养以用于药理研究，下列叙述正确的是（）
A. 制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理
B. 肝细胞培养过程中不需要更换培养液
C. 为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的干扰素
D. 二者的培养都没有经过脱分化的过程
答案：
解：A、制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胰蛋白酶处理，不能使用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶需要在强酸环境下才能起作用，但这样的环境不适于细胞生存，A错误；
B、肝细胞培养过程中应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害，B错误；
C、为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素，以防培养过程中的污染，C错误；
D、培养动物细胞没有经过脱分化的过程，D正确．
故选：D．。
兔肝细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握兔肝细胞的分离、培养和观察方法。
2. 了解兔肝细胞的基本生物学特性。
3. 探讨兔肝细胞在生物学研究中的应用。
二、实验材料1. 兔肝组织块2. DMEM培养基3. 胎牛血清4. 胰蛋白酶5. D-Hank's液6. 离心机7. 培养皿8. 显微镜9. 计时器三、实验方法1. 兔肝细胞的分离（1）取新鲜的兔肝组织，放入D-Hank's液中清洗。
（2）将兔肝组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
（3）在37℃水浴中消化10分钟。
（4）取出离心管，用D-Hank's液清洗3次，去除未消化的组织块。
（5）将细胞悬液转移到培养皿中，加入DMEM培养基，调整细胞密度。
2. 兔肝细胞的培养（1）将培养皿放入培养箱中，在37℃、5%CO2条件下培养。
（2）每隔2天更换一次培养基。
（3）观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
3. 兔肝细胞的观察（1）在显微镜下观察细胞形态、大小、排列等。
（2）观察细胞在培养过程中的生长、分裂、死亡等现象。
四、实验结果1. 兔肝细胞的分离实验成功分离出兔肝细胞，细胞形态呈多边形，细胞核明显，细胞质丰富。
2. 兔肝细胞的培养兔肝细胞在培养过程中生长良好，细胞密度逐渐增加，细胞形态稳定。
3. 兔肝细胞的观察（1）在显微镜下观察，兔肝细胞呈多边形，细胞核明显，细胞质丰富。
（2）细胞在培养过程中，出现生长、分裂、死亡等现象。
五、实验讨论1. 兔肝细胞分离、培养的成功，为生物学研究提供了良好的细胞模型。
2. 兔肝细胞在培养过程中，表现出良好的生物学特性，为研究肝细胞的功能提供了便利。
3. 兔肝细胞在药物筛选、基因治疗等领域具有广泛的应用前景。
六、实验总结本实验成功分离、培养了兔肝细胞，观察了细胞的基本生物学特性。
实验结果表明，兔肝细胞具有良好的生长、分裂和分化能力，为生物学研究提供了有力的实验材料。
在今后的实验中，我们将进一步研究兔肝细胞在不同条件下的生物学特性，为相关领域的科学研究提供理论依据。
牛蛙肝细胞实验报告
一、实验目的1. 观察牛蛙肝细胞的形态和结构。
2. 掌握牛蛙肝细胞培养的基本技术。
3. 了解牛蛙肝细胞在不同培养条件下的生长情况。
二、实验原理牛蛙肝细胞是牛蛙体内重要的代谢器官，具有丰富的生物活性。
通过体外培养牛蛙肝细胞，可以研究细胞在特定条件下的生长、代谢和功能。
本实验采用组织块培养法，将牛蛙肝组织块接种于培养皿中，通过观察细胞的生长情况，了解细胞的形态、结构和功能。
三、实验材料1. 实验动物：牛蛙2. 培养基：DMEM培养基3. 胎牛血清：10%4. 肝素：0.1mg/ml5. 胰蛋白酶：0.25%胰蛋白酶6. 24孔培养板7. 移液器8. 显微镜9. 刀片10. 吸水纸四、实验方法1. 取材：将牛蛙处死后，迅速取出肝脏，用生理盐水清洗，剪成1mm×1mm×1mm的组织块。
2. 胰蛋白酶消化：将组织块放入含有0.25%胰蛋白酶的DMEM培养基中，37℃消化10分钟。
3. 分离细胞：用吸管轻轻吹打组织块，使细胞从组织块中分离出来。
4. 细胞计数：用移液器将细胞悬液转移至计数板上，在显微镜下观察细胞计数。
5. 接种：将细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔100μl，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。
6. 观察与记录：每隔24小时观察细胞生长情况，记录细胞形态、生长速度等。
五、实验结果1. 细胞形态：接种后24小时，细胞开始贴壁生长，细胞呈圆形、椭圆形或不规则形。
培养48小时后，细胞开始连接成片，细胞形态逐渐变长。
2. 细胞生长速度：培养72小时后，细胞生长速度加快，细胞数量明显增加。
3. 不同培养条件下的细胞生长情况：将细胞分为两组，一组加入10%胎牛血清，另一组加入10%胎牛血清和0.1mg/ml肝素。
结果显示，加入肝素的细胞生长速度明显快于未加肝素的细胞。
六、实验讨论1. 本实验采用组织块培养法，成功培养了牛蛙肝细胞，为后续研究提供了实验材料。
2. 细胞形态和生长速度与培养条件密切相关。
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2 细胞的培养方法
自19世纪末以来, 鉴于肝脏代谢学、毒理学、 生物化学与分子生物学研究不断增长的需求, 众多科学家都致力于肝细胞培养技术的不断探
索, 使该领域得到了较快的发展. 到目前为止, 用于肝细胞培养的方法主要有以下几种, 现叙 述如下. 2.1 组织块贴壁培养法 该法是用于培养肝细胞 的最原始的方法. 聂兴草 et al [23]在运用该方法培
■同行评议者 孙殿兴, 主任医 师, 白求恩国际和 平医院肝病科
牟卉卉, 胡康洪, 中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重 点实验室 湖北省武汉市 430071 胡康洪, 德国雷根斯堡大学分子和细胞解剖学研究所 德国 雷根斯堡 93051 国家十一五传染病重大专项任务基金资助项目, No. 2008ZX10002-011 作者贡献分布: 牟卉卉负责资料的搜集、整理及文章的撰写; 胡 康洪负责课题方向的选择及文章的审校. 通讯作者: 胡康洪, 研究员, 博士, 博士生导师, 430071, 湖北省 武汉市, 中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室. hukgh@ 电话: 027-87198362 收稿日期: 2009-04-20 修回日期: 2009-06-18 接受日期: 2009-06-23 在线出版日期: 2009-07-28
Recent advances in techniques for isolation and culture of primary hepatocytes
Hui-Hui Mou, Kang-Hong Hu
Hui-Hui Mou, Kang-Hong Hu, State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, Hubei Province, China Kang-Hong Hu, Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Regensburg, Regensburg D-93053, Germany Supported by: the National Key Project in the Field of Infectious Diseases, No. 2008ZX10002-011 Correspondence to: Professor Kang-Hong Hu, State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, Hubei Province, China. hukgh@ Received: 2009-04-20 Revised: 2009-06-18 Accepted: 2009-06-23 Published online: 2009-07-28
Key Words: Primary hepatocyte; Hepatitis B virus; Bioartificial liver; Techniques for isolation and culture of hepatocytes
Mou HH, Hu KH. Recent advances in techniques for
牟卉卉, 等. 原代肝细胞分离培养技术现状及展望
2165
1.1.1 机械分离法: 机械分离法是利用机械剪切 及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶 et al [4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将 树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和 震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从 而获得互相分离的肝细胞. 1.1.2 胰酶消化法: 胰酶消化法是利用胰酶来破 坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方 法. Dulbecco et al [5]首次采用胰酶来分离猴肾细 胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和 培养中. 刘友平 et al [6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有 血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底 的细胞悬液. 1.1.3 胶原酶消化法: 胶原酶消化法是利用胶原 酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的 一种方法. 王琳 et al [7]在利用该方法分离新生小 鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3 组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加 入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原 酶的作用, 得到肝细胞悬液. 1.2 采用灌流的方法 虽然非灌流的方法以其简 单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在 消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块
isolation and culture of primary hepatocytes. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009; 17(21): 2164-2170
摘要 原代肝细胞的分离和培养是建立体外HBV感 染的细胞模型和临床应用生物人工肝的关键 步骤, 许多学者对肝细胞分离和培养技术做了 大量探索. 本文就近年来建立的各种肝细胞分 离技术和培养技术的优缺点进行比较, 并对该 领域今后的发展前景作了展望.
® wcjd@
文献综述 REVIEW
世界华人消化杂志 2009年7月28日; 17(21): 2164-2170 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
原代肝细胞分离培养技术现状及展望
牟卉卉, 胡康洪
■背景资料 乙型肝炎病毒 (HBV)感染导致 的慢性肝炎是严 重威胁人类健康 的世界性疾病. 由 于缺乏理想的体 外感染模型, HBV 复制机制的研究 和抗病毒药物筛 选一直受到制约. 实验室对获得足 够数量以及生长 状态良好的肝细 胞的需求十分迫 切, 发展和完善原 代肝细胞分离技 术和培养技术是 进行HBV基础研 究、新药发现以 及生物人工肝应 用的关键一步.
插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的 方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌 注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做 流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行 灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充 分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到 制备好的肝细胞悬液. 1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法: 在使用两步灌 流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的 问题. 而Gerlach et al [15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流
技术, 建立了一种高效的细胞分离方法(图1). 刘应生 et al [16]在使用该方法分离细胞时, 采
用了无钙缓冲液进行开放灌注, 以去除器官内 血细胞, 这样可以得到纯度更高的肝细胞. 并且 用无C a2+缓冲液洗掉C a2+后再用含C a2+缓冲液开 放灌注, 这样可以提前为胶原酶营造一个Ca2+环 境. 最后用4℃的培养液进行灌注, 低温的环境 可以减少操作过程对细胞造成的损害.
存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应 用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏 灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分 地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝 细胞的活力和数量大大提高. 1.2.1 离体胶原酶灌流法: 离体胶原酶灌流法是 将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使 用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血
胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法 的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中 肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率[11-12]. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法: 半原位胶原酶灌 流法是我国学者彭齐容 et al [13]以Seglen法为基 础建立的肝细胞分离技术. 俞红 et al [14]在采用 该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的 D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保 留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无 菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与 间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后 得到制备好的细胞悬液. 1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法: 下腔 静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉
1 细胞的分离方法 体外培胞. 自1953年 Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流 的方法. 1.1 采用非灌流的方法 早期的研究一般通过非 灌流这种简单的步骤分离肝细胞.
管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's 液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞 与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化 作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液[9]. 1.2.2 Seglen两步灌流法(原位胶原酶灌注法): 自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根 据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中 Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的 Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的 标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要 是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和
Abstract
Isolation and culture of primary hepatocytes are key steps for establishment of the in vitro cellular model of HBV infection and clinical application of bioartificial liver. Over the past decade, numerous studies have been performed on the isolation and culture of hepatocytes. In this article, we will review the advantages and disadvantages of various hepatocyte isolation and culture techniques developed so far and discuss future prospects in this field.