原代肝细胞

原代肝细胞分离培养与方法肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.1 非酶分离细胞法1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。

该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。

但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。

1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。

的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。

该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。

但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。

可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。

2．离体肝脏酶消化分离法2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。

的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。

胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。

肝细胞产率高、损伤小，且保持特异性功能的时间长。

但胶原酶价格比较昂贵，成本高。

胰蛋白酶既消化细胞问质又消化细胞本身，操作简单，价格便宜，但胰酶消化的条件极难把握而使该法未被广泛应用 L8．9_。

2．2 胰蛋白酶、胶原酶消化的组织块法：处死小鼠，无菌分离肝脏，置 D-Hanks液中，冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成 1 mm。

的组织块，在 37℃下用胰酶或(和)胶原酶消化后，加人培养基终止消化，自然沉降后，取下层组织块，再用培养基洗涤数次即可将肝组织块贴壁于培养瓶中，每个培养瓶放组织块 30~35块，加少许培养基。

该法分离效果、纯度较单纯的组织块法好，且细胞从组织块爬出时间相对短。

但消化酶的用量和时间不易控制：消化过度，形成的絮状组织块不能分离；消化不充分，酶没有发挥其作用[10~12]。

2．3 在体肝脏酶灌注法2．3．1 Seglen灌注法：即经典的二步胶原酶灌注法。

两步灌注即经门静脉以无钙缓冲液和胶原酶恒流、恒温灌注，这是目前国际上公认的方法。

首先用不含 Ca 的离子螯合剂(EDTA等)移走肝组织中的 Ca ，从而打破固定细胞的细胞桥粒样结构；再用胶原酶进行蛋白分解消化，最终使纤维组织网被消化，细胞间连接被解除，再经反复离心分离，即得到肝细胞悬液。

有报道肝灌流的途径除了门静脉外，还有经胆道、腹主动脉等多种途径。

则认为二步灌流法分离肝细胞的关键是把握两个 Ca。

的浓度和两个温度。

两个 Ca。

的浓度是指预灌流液和灌流液中 Ca 的浓度，为了肝细胞的最终分离必须用 EDTA 溶液进行充分的预灌流，其冲走了 Ca 依赖性的黏附分子，进而引起半桥粒的分开，同时胶原酶是一种需要 Ca 活化的酶，胶原酶消化时需含一定的 Ca。

(5 mmol／L)；两个温度是指胶原酶消化时的温度 (37℃)和纯化时的操作温度 (4℃)。

该法分离效果好，一次能获得大量肝细胞。

细胞活力好、存活率高，培养易成功并可分离出肝实质细胞及肝非实质细胞 (如星状细胞、SE21细胞等)，是肝细胞实验研究的理想灌注方法。

但操作繁琐、流程长、技术要求高，需要恒流循环灌注装置和消耗大量的胶原酶，并且易污染。

2．3．2 半原位胶原酶灌流法：有学者在原位灌流法的基础上建立了半原位灌流法。

苯巴比妥钠麻醉成年 SD大鼠，肝素钠肝素化，门静脉插管进行灌流，用 EDTA 溶液灌流，之后剪下肝脏保留门静脉，再以含Ⅳ型胶原酶的 Hanks 溶液灌流，之后去除肝被膜及血管，钝性撕裂肝组织，加入培养基，制备单细胞悬液，多层纱布过滤即可得单个肝细胞。

该法与Seglen法比较有以下优点：①以普通的一次性输血器替换了恒流泵装置，通过旋钮控制输注速度，其调节方便，流量均匀，解决了蠕动泵安装复杂、间断性灌流的难点；②此法胶原酶的用量仅为 Seglen法的 1／4；③流程短、操作简便而且不需要特殊设备。

但操作过程也容易产生污染。

（体外原代肝细胞分离培养方法的比较徐雅玲综述黄巨恩刘华刚审校）目前采用的Seglen门静脉两步灌流法及其改良的方法,分离大鼠原代肝细胞，并联合应用percoll单密度梯度离心法进行纯化，所得细胞数量多，活力好，纯度高，并且保留了肝细胞的各项功能。

该方法也存在操作复杂，技术要求高，所需时间长，易污染，经济成本高等缺陷，限制了原代肝细胞在研究中的广泛应用。

为了改变这些方法的瓶颈点，有关学科的学者们不懈的探索着简单易行、经济实用的小鼠原代肝细胞分离纯化方法来为进一步的相关研究奠定基础。

1、聂兴草的一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法试剂：D-ha nk 's 液; 消化液Ⅰ: 含1 g / L 胰蛋白酶、10g / L 聚乙烯吡咯烷酮( p olyvi nyl py ro li do ne, PV P)及0. 3 g /L EDTA ;消化液Ⅱ:含2 g /L胶原酶Ⅳ及10 g / L PV P; 基础培养液为DM EM , 另含青霉素100 u /ml、链霉素 1 00 μg /m l、50 m mol /L HEPES、30 g / L 谷氨酰胺; 小牛血清; 培养基内其他因子: 胰岛素5μg /ml、转铁蛋白5μg/ml 、促甲状腺素释放因子10- 6mol /L、促肝细胞生长因子20 μg /m l、氢化可的松10- 6mo l / L)。

方法：断头处死动物无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

肝组织用4℃D-hank 's液或不含BS的培养液洗净血污, 剥除包膜及纤维成分, 将肝组织切为约1 mm3小块, 再用上述液体尽量洗去残留血污, 最后一次清洗后800 r /min离心 4 min, 弃上清, 加入消化液Ⅰ, 37℃孵育12 min, 再用培养液洗3次以清除胰酶。

将消化好的肝组织块贴于25 cm2培养瓶中,加少许含100 ml /L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3 h 后再补充6 ml含100 ml /L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml /L BS培养液。

1. 4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上,加入消化液Ⅱ, 置4℃过夜消化,去除消化液加含100 ml /L BS培养液,用滴管轻轻吹打成细胞悬液, 经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次, 4℃50 g离心4 min,收集肝细胞,台盼蓝活细胞计数> 80% ,按5×105/ml 密度接种, 于37℃、5% CO2 条件下培养, 待细胞贴壁生长后改为50ml /L BS培养液。

2、张娓的大鼠肝细胞的分离及 BRL细胞培养上清对原代肝细胞增殖的影响主要试剂：Ⅳ型胶原酶、台盼蓝培养基为，胎牛血清。

主要仪器设备：CO：细胞培养箱，医用超净工作台，倒置显微镜方法：Wistar大鼠于术前 24 h禁食水，以 15 g／L 的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉 (50 mg／kg)，尾静脉注射肝素 1 000 U，仰卧位固定，腹部备皮消毒，在超净台内打开腹腔，游离门静脉，门静脉内插入软硅胶管并固定。

以 37℃预热的灌流液快速灌流，灌速30～40 ml·min～，同时剪断下腔静脉，约 10 min后可见肝脏变成灰白色。

离断肝周血管韧带，仅保留门静脉，将肝脏移入无菌平皿中，以 37℃的 0．5 g／L 的Ⅳ型胶原酶Hanks溶液灌注，灌速 5 ml·min～，约 20 min。

可回收平皿内的胶原酶液，循环灌注。

撕下肝包膜，将肝细胞刷入预冷的 Hanks液中，200 目滤网过滤，制成粗制肝细胞悬液，1 500 r／min离心 3 min，以预冷的 Hanks液漂洗，共 3次。

以不同的混合培养液或普通培养液重悬肝细胞，台盼兰排斥法检测肝细胞活力。

以每孔 1×10 个肝细胞的密度接种入 24孔培养板，于 37℃、体积分数 5％ CO：培养箱内培养。

3、余莹的改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法主要试剂：EGTA ,HEPES ,IV型胶原酶，DMEM-HG培养基干粉，percoll ，碱性品红、高碘酸，Sorvall Legend RT离心机;倒置荧光显微镜;小牛血清、胎牛血清;细胞培养皿、细胞培养板;20 ml一次性注射器，7号输液针。

肝灌洗液I为含EGTA 0.5 mmol/L HEPES 1mmol/L的无Caz"、无Mgz·的D-hanks缓冲液，I}用前将pH值调至7.27.5之间，于37℃温育。

W型胶原酶溶液用肝灌洗液I配制，加人5 mrnol/L的CaClz, 0.02% IV型胶原酶，用前37℃温育5 mina percoll单密度(1.070 g/cm')离心液percoll原液90 ml加1.5 mol/L NaCI溶液 10 ml，配成100%的percoll溶液;用PBS稀释100%的percoll溶液至30%浓度，即密度为1.07岁cm3的单密度肝细胞分离液。

肝细胞培养液高糖DMEM,10%FBS,100 U/L青霉素、100 U/L链霉素，10 nmol/L胰岛素。

方法：颈椎脱臼法处死小鼠，固定四肢，75%酒精消毒后打开腹腔，暴露肝脏及门静脉;用7号输液针与20 ml注射器相联，排气后门静脉穿刺插管固定;用37℃预热的无钙肝灌洗液I进行原位肝脏灌注，待肝脏膨起，整个呈土白色，剪断下腔静脉放血;继续灌注时，采用间断法，即快速灌注至肝脏略膨后，停顿5一10 s，待肝窦内残血流出，肝脏回缩后，再进行推注，反复5一10次，至肝回缩时无残血流出;共约2 min;用IV型胶原酶溶液进行原位消化;灌注胶原酶时，先用镊子夹住下腔静脉，至肝脏膨起，然后松开镊子，反复3次。

每只小鼠约需5 ml胶原酶溶液。

消化2}Smin，用镊子压按肝脏，凹陷不反弹时取下整个肝脏，PBS漂洗去除肝脏表面的血渍;于冰上预冷的培养皿中用眼科镊钝性撕碎肝组织呈糊状，加人Sml冰上预冷的含血清DMEM中止消化，涡旋混匀;用移液枪充分吹打分散细胞，于100目细胞筛过滤除去未消化的肝脏组织及结缔组织，所得悬液即为肝细胞悬液。