发酵工艺学原理思考题及答案文经学院概要

第二章思考题

1. 比较固体培养与液体培养的优缺点

固体培养基：酶活力高；无菌程度要求不严；产物浓度大，易分离，有效降低产品分离成本。

劳动强度大，占地面积大，不宜自动化生产；周期长；环境条件难控制；菌种菌类不纯；

生物量检测不易，盲目性大。

液体培养基：生产效率高，便于自动化管理；生产参数可全面控制；通常生产液体种子，生产周期短。

无菌程度要求高，相对生产设备投资较大；某些发酵，因投资大和生产密度大而难以实现。

2. 说明菌种扩大培养的条件。

①培养基：摇瓶用的培养基原料精细，C源浓度较低且易被利用。种子罐用培养基原料接近大生产所用的原材料，N源浓度高，利于菌体增殖。

②温度：从试管到三角瓶到种子罐，温度逐步调整，最后接近大生产的温度，使菌种逐渐适应。

③氧的供给：需提供足够的氧气利于菌体增殖。

④PH：为菌体最适生长PH，往往与发酵最适PH不同。灭菌后，PH值下降0.5——1个单位，应调整（三角瓶不行，不宜无菌操作）。

3. 菌种扩大培养的目的和意义是什么？

①提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种，而达到提高发酵罐利用率，缩短发酵周期，降低能耗，减少染菌的机会及使培养菌在数量上取得绝对优势，而抑制杂菌生长。

②使菌种逐渐适应大生产的环境。

③提高生产的成功率，减少“倒灌”现象。

4. 工业生产用菌种的基本要求有什么？

①具有稳定的遗传学特性。

②微生物的生长和产物的合成对于基质无严格的要求。

③生长条件易于满足。

④对于细菌，希望具有抗Phage的能力。

⑤有较高酶活力，可在一定范围内提高生长速率和反应速度，进而缩短发酵周期，降低生产成本。

⑥目标产物易分离得到。

5．微生物发酵常用菌种有哪些？

（细菌：短杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌；

酵母：啤酒酵母，酒精酵母，汉逊酵母，假丝酵母；

霉菌：黑曲霉，黄曲霉，青霉菌，红曲霉。

第三章思考题

1. 微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？

碳酸；淀粉及其水解糖；化工石油产品（醋酸，甲醇，乙醇）

2. 微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？

无机：氨水，尿素（有脲酶的M,流加）；铵盐。有机：豆粕，玉米浆，酵母粉，酵母浸出物，鱼粉；菌体蛋白，玉米蛋白粉。

3. 淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？

①酸解法:简单易行，对设备要求简单，设备生产能力大，用时短。

反应剧烈，副产物多；生产环境恶劣；设备需耐腐蚀，耐高温高压；对淀粉原料要求严；淀

粉浓度不宜过高。

②双酶水解法：反应条件温和；副产物少；淀粉的水解产率和转化率较高；原料可直接是粮食；使用的

淀粉浓度较高；制得的糖液颜色浅，质量高，利于精制。

酶解反应时间较长，要求的设备较多，需具备专门培养酶的条件，酶的存在使糖液过滤困难。

③酸酶结合水解法：酸酶法（酸液化速度快，可采用较高浓度的淀粉乳）。酶酸法（可用粗淀粉，较酸

法水解度高，减少了副反应。）

4.双酶法淀粉的水解通常使用哪2种酶？其作用特点分别是什么？

（1）α-淀粉酶（淀粉液化酶）：只作用于淀粉α-1,4葡萄糖苷键，快速将长链淀粉水解为短链糊精，水

解速度随淀粉链长度的降低而减慢。终产物：短链糊精，少量葡萄糖。

淀粉α-1,4；1,6葡萄糖苷酶（糖化酶）：水解淀粉的α-1,4或α-1,6葡萄糖苷键，从淀粉的非还原性末端

开始，淀粉链越短水解速度越快。终产物：葡萄糖。

（2）酸法水解的主要副产物是什么？

①复合二糖：异麦芽糖（不利于产物的结晶提出），龙胆二糖（抑制菌体的生长）；

②一分子G脱水形成5-羟甲基糠醛（抑制菌体的生长）；

③美拉德反应，G与-NH2, 形成氨糖，有颜色，不利于精制。

5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？

使用高压蒸气灭菌，利用加热产生蒸气，随着蒸气压力不断增加，温度随之升高，高压蒸汽灭菌具有穿透力强，传导快，能使微生物的蛋白质较快变性或凝固，作用可靠，操作简便，水蒸汽含有潜热热压灭菌温度与时间的关系如下：115 ℃（68kPa ）/30min ，121 ℃（98kPa ）/20min ，126 ℃（137kPa ）/15min 。可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。

灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。t=(2.303/K ）×LNN0/N S

6.生物反应器灭菌的操作要点有什么，绘图说明操作过程。

（1）①定期检查设备、管道有无渗漏。②培养基升温时，打开所有的排气阀门。③升温时开动搅拌系统，使培养基内部传热均匀。温度达100℃时，停止搅拌。④注意辅助设备的灭菌。⑤保温期间，要求罐压：0.09-0.10MPa；温度：118-121℃；时间：30min。⑥灭菌结束，立即通入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却。⑦配制培养基时，应充分考虑培养基灭菌时的稀释。

（2）简：升温阶段，保温阶段，冷却阶段。

7．以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。

lg(k2/k1)/lg(k2’/k1’)=E/E’>1

8 理论灭菌时间：理论灭菌时间的计算

t=1/k×lnN0/N t=2.303/K×lgN0/N t

式中：N0—开始灭菌（t=0）时原有活菌数；Nt----经时间t后残存活菌数。K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；t ：表示理论灭菌时间

k=（2.303/t）logN t/N0；比死亡速率常数K，K值大，表明微生物容易死亡。

对数残留定律:微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程：

-dN/dt = k * N

式中，N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。该方程称为对数残存定律，表示微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。

实消:实消，就是分批灭菌，就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。

实消流程：放罐--清洗--检修--空消--进料--预热--实消--冷却--接种发酵

实消的优缺点

优点：1、设备成本低；2、染菌风险低，连续灭菌过程需要将灭菌发酵液无菌输送至无菌发酵罐；3、易于人工控制；4、易于处理含有高比例固体物质的培养基。

缺点：1、对于培养基的营养成份破坏大；2、蒸气用量波动大。

空消:用蒸汽对单纯的生物反应器及其附属设备灭菌。由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。

连消:（连续灭菌）将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作过程。

优点：1、能实现高温短时灭菌，能极大地保持培养基的营养；2、易于放大；3、易于自动化控制；4、减少蒸气的用量；5、降低蒸气量的波动；6、在一定程度上减少发酵罐的腐蚀。

缺点：1、设备成本高；2、染菌风险高；3、不适合处理含有高比例固体物质的培养基。

波美度:（°Bé）表示溶液浓度的一种方法。把波美比重计浸入所测溶液中，得到的度数就叫波美度。

第四章思考题

1.能荷：能荷=（[ATP]+1/2[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])，大小在0～1之间。定量表示细胞能量状态。糖酵解：葡萄糖或糖原在组织中进行类似发酵的降解反应过程。最终形成乳酸或丙酮酸，同时释出部分能量，形成ATP供组织利用。

TCA循环：三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA），Krebs循环。是用于将乙酰CoA中的乙酰基氧化成二氧化碳和还原当量的酶促反应的循环系统。

磷酸五糖途径：HMP磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）由6-磷酸葡萄糖（G－6－P）开始，

故亦称为己糖磷酸旁路。在胞浆中进行，分两个阶段。第一阶段由G－6-P脱氢生成6-磷酸葡糖酸内酯开始，然后水解生成6-磷酸葡糖酸，再氧化脱羧生成5-磷酸核酮糖。NADP+是所有上述氧化反应中的电子受体。第二阶段是5-磷酸核酮糖经过一系列转酮基及转醛基反应，经过磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中间代谢物最后生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，后二者还可重新进入糖酵解途径而进行代谢。

甘油发酵:在酒精发酵中，如果通过依姆登-迈尔霍夫途径，则中间形成磷酸甘油醛。在正常反应中它的氧化是和它前面的反应即乙醛的还原有关。但是通过加入亚硫酸盐等将后者捕捉，就会代之以磷酸甘油醛的还原形成磷酸甘油。磷酸甘油经脱磷酸而有甘油累积。这种反应称为甘油发酵。

DCA 循环：乙醛酸循环，在异柠檬酸裂解酶的催化下，异柠檬酸被直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅酶A参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过程。

侧系呼吸链：NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常传递H+,将其氧化成H2O,但并没有氧化磷酸化生成ATP。酶系强烈需氧，缺氧可使酶不可逆失活。

标准呼吸链：能够正常产生ATP的呼吸链。

二氧化碳固定化反应：通过CO2的固定反应来补充草酰乙酸，酶：磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化酶，苹果酸酶。二氧化碳在酶的作用下转化为还原性有机化合物的过程。

初级代谢：一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢生成维持生命活动的物质和能量的过程。

次级代谢：在一定的生长时期（一般是稳定生长期），微生物以初级代谢产物为前体合成的对微生物本身的生命活动没有明确功能的物质的过程。

分叉中间体：可用来合成初级代谢产物，又可合成次级代谢产物，处于代谢分叉点上的物质。

发酵逆转：在正常的发酵过程中，微生物群体从完成了生长型到产物积累型的转变后，大量的产物开始生成，底物源源不断地转化成产物，但是当培养基中存在易引起分解代谢阻遏的物质时，菌体可能出现二次生长，微生物群体又回到了生长状态的现象。

反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。

阻遏：指基因的表达转录阶段为特异的调节因子（阻遏物）所抑制，使细胞内特定的酶或酶系合成率降低的现象。

优先合成机制：在生物合成分支点处，通过酶活性的调节，使某种产物优先合成。

同工酶：催化相同反应而分子结构不同的酶。

协同反馈抑制：由两个或多个终产物产生的对一种酶的反馈抑制。在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对特定的酶具有抑制作用。若某一末端产物单独过量则无抑制作用

营养缺陷型：对某些必需的营养物质或生长因子的合成能力出现缺陷的变异菌株或细胞。必须在基本培养基(如由葡萄糖和无机盐组成的培养基)中补加相应的营养成分才能正常生长。

抗性突变株：是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。组成型突变株：通过物理、化学或生物方法，使调节基因发生变异，阻遏蛋白无法合成或合成后无活性，或突变发生在操纵基因上，最终使诱导作用解除，酶的合成畅通无阻的突变株。

分解代谢阻遏：当培养基中同时存在多种可供利用的底物时，分解利用某些底物的酶往往被最容易利用的底物所阻遏。

代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物。

偶联：氧化还原反应或分解反应与磷酸化反应相偶联。在生物体内酶反应中可看到放能反应的进行与由ADP和正磷酸生成ATP（吸能反应）相偶联。

调节基因，regulatiopn gene：能产生阻抑物的基因，通过阻抑物与操纵基因的结合与否来控制操纵基

因的关闭和开启。

P---启动子，Promotor：有与RNA聚合酶结合的位点，可识别转录起始点的核苷酸序列。

O---操纵基因，operation gene: 对结构基因起着“开关”的作用的核苷酸序列，可直接控制结构基因

的转录。

S---结构基因，structure gene:决定合成某一种蛋白质或RNA分子结构相应的一段DNA。

2.厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。

(①甘油厌氧发酵的缺点：

a.菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生；

b.转化率较低，按照上述能量平衡计算，糖与甘油的转化率不可能超过50%，加上酵母增殖需要消耗一部分糖，发酵液中残留一部分糖，实际转化率远低于50%。这一转化率，导致了厌氧发酵生产甘油的成本较高。

②好氧发酵：

优点：在适当（或者说有限的好氧）好氧的条件下，酵母细胞进行有限的好氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸可以通过TCA循环来增加其产能水平，一方面减少3—磷酸甘油醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例；另一方面，增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率，有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。

缺点：这种有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行TCA循环的同时，也增加了TCA循环过程中的许多中间性产物的产生，这对于甘油的提取带来了不利的影响）

3.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？

（1）EMP畅通无阻：①控制Mn+ ﹥NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制。②控制溶氧，防止侧系呼吸链失活

（2）强化CO2固定反应生成C4二羧酸：添加辅酶——生物素。

（3）柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低: 控制培养基中的Fe2+的浓度

4.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。

(柠檬酸产生菌体内侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，即只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，生产失败。)

5.简述二氧化碳固定反应对于提高柠檬酸产率的意义。

（葡萄糖经过EMP途经生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)，则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CoA，也就是需要1.5分子的葡萄糖；如果其中一分子的丙酮酸通过CO2固定反应生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要1分子的葡萄糖，产率得以提高。）

6.比较细菌发酵和酵母发酵的优缺点。

（优点：

（1）菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。

（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。

（3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。

缺点：

（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或

菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。

（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。

（3）细菌发酵易感染噬菌体。

7.写出大肠杆菌中Lys代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产Lys的菌种特性和控制要点。

大肠杆菌赖氨酸代谢特点：

关键酶是天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物（Lys、Met和Thr）的抑制，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活性才能完全被抑制。

控制要点：

要使菌体合成并积累Lys，可以选育Hos-，这样的话，既可以解除β—天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos-，使得代谢过程中不可能产生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys可以抑制关键酶——天冬氨酸激酶1，但是天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met、Thr的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸β—半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻。

8.写出黄色短杆菌中Lys代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产Lys的菌种特性和控制要点。

特点：（1）天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr

的协同反馈抑制。

（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，即优先合成Hos，然后再优先合成Met，当Met过量时，阻遏：催化Hos琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈抑制：Asp-β-半醛Hos所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向Lys的合成。

控制要点：根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产Lys，需要选用Hos-，尽管，从理论上讲，选育Hos-进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hos-是不够的，但是为了高效率的转化Lys，可以选育结构类似物抗性突变株：①S-L-半胱氨酸抗性突变株AECr ②γ-甲基赖氨酸抗性突变株MLr③L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株LysHxr④苏氨酸氧肟酸盐抗性突ThrHxr使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met-+Thr-）,其本质上和Hos-是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：遗传性质稳定，恢复突变的几率少。

9．谷氨酸发酵生产过程中，主要出现哪些异常现象？其危害是什么？产生的原因是什么？如何处理？（1）初期PH下降（菌体生长缓慢）：

①初脲不够。应提前酌情流加;

②跑尿出现，可能是因为温度过高，尿素形成双缩脲。或培养液中的NH4+分解成NH3跑出。或NH4+

被结合成其他物质；

③培养基中磷酸盐浓度过高，代谢平衡打破，酸性产物积累；

④供氧不足。可能是因为通风不足，泡沫塞住尾气管，压强升高，使进气管的空气流速下降。或搅拌器转速较低，KLa较小，特别是当菌体处在对数生长期时。或发酵罐压力过低。或发酵罐的结构设计不合理，如挡板结构，搅拌桨T/D值，两档的距离。

（2）接种后菌体生长不良，OD值偏低，耗糖速度慢。（使发酵周期变长，菌体活力低，糖酸转化率偏低）：

①菌体感染Phage；

②培养基缺V H, 缺磷酸盐，或存在抑制性物质——如淀粉水解产生：龙胆二塘，5·-羟甲基糠醛。或灭菌时尿素变成双缩脲；

③通风量过大，氧气溶解水平反而不高，菌体耗糖速度低（能荷）；

④菌种不良，种子衰老或接种温度过高，菌体被烫死；

⑤前期通风少，PH偏小，累积酸性代谢物，不利菌体生长。

（3）中后期，OD值上升，耗糖快，产酸低（只长菌不产酸）：

①V H（玉米浆）过高，生长型到产物型转变不利，应维持亚适量；

②可能是感染杂菌（镜检可初步判断）。

（4）中后期，耗糖快，产酸低或不产酸：

①感染杂菌；

②供氧不足，酸产物积累；

③V H过高，磷酸盐过高。

（5）泡沫太多—因此发酵罐装液量在70％以下，酶制剂在50％（影响传热，易跑液染菌，损失发酵液等：

①淀粉质量差，杂质多（Pr）；

②糖化不完全，糖化液含有糊精（泡沫稳定剂）：酶剂添加量不合理或PH调节不合理；

③糖化工艺不合理，形成的复合物（焦糖，美拉德反应物）多；

④感染杂菌，杂菌生长速度快，产生的大量CO2与其他物质形成复合物；

⑤感染Phage，菌体破裂，Pr等物质释放；

⑥消泡剂选择不合理或用量过少。

（6）菌体产酸后，GA产量又下降：

①PH过高，GLn合成酶活性加强，使GA+NH4+——>谷氨酰胺的反应右移，谷氨酰胺的存在不利于GA的沉淀分离；

②感染杂菌，GA被作为C源、N源分解利用。

（7）GA浓度急剧增加（在分离提纯时，杂质多，等电点法，离心法难以结晶）：

感染phage,菌体裂解。PI=3.22，冷冻沉淀离子交换柱。

10.说明微生物细胞内NH+4参与分解与合成代谢的途径。

在抗生物的发酵过程中，培养基中如果存在容易被利用的无机氨态氮，例如：（NH4）2SO4、NH4CL等，或其他可以被迅速利用的氮源，则对抗生素的合成有强烈的抑制作用；NH4+可以强烈的刺激菌体的生长，进而影响了菌体从生长型到产物积累性的转变，影响了抗生素的生物合成。发酵中期当微生物群体进入产物合成期时，如果向发酵液中流加氮源，则可以造成发酵逆转。

11.写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO2固定化反应的重要性。

体系不存在CO2固定反应：

3/2 C6H12O6+NH4+==C5H9O4+4CO2

产率：147/（180*3/2）==54.4%

体系存在CO2固定反应：

C6H12O6+NH4+==C5H9O4+CO2

产率：147/180==81.7%

可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。

12.谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA，其菌种内在的原因有哪些？

①α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失。

这是菌体生成并积累α—KGA的关键，α—KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在α—KGA 脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA 进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。

②GA产生菌体内的NADPH的再氧化能力欠缺或丧失。

（1）NADPH是α—KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α—KGA的脱羧氧化有一定的意义。

③产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。

该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。

④菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性。

α—KGA+NH4++NADPH==GA+NADP L—谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联

13.谷氨酸产生菌之所以能够在10%以上的葡萄糖培养基上，生产大量的GA,除了上述谷氨酸产生菌的内在本质外，其需要的外在条件有什么？

①供氧浓度。过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α—KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。

②NH4+浓度。（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：过低，不利于α—KGA的还原氨基化过高，产生固安酰胺NH4+的供给方式：（1）液氨（2）流加尿素

③磷酸盐过量。（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等（2）产生并积累Val。Val①可以抑制葡萄糖——>丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止②消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率③发酵液中的Val存在，严重的影响GA的结晶、提出。

14.谷氨酸发酵过程中，生物素（V H）作用表现在那几个方面？

（1）生物素对糖代谢的影响

①生物素对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。②可以通过控制生物素的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。（2）生物素对氮代谢的影响

当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA循环正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。（3）生物素对菌体细胞膜通透性的影响

细胞膜通透性的调节对于GA发酵时非常重要的，正如前述，当菌体进入产物合成期时，开始有GA 的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L—谷氨酸脱氢酶活性的

抑制作用，从而使现由Glucose到GA的高效率转化，物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是V H，V H在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。

15.生物素（V H）如何封闭乙醛酸循环的？

DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，受以下几个因素的影响：

①为醋酸诱导

②受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制。

当VH缺乏时：

（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于V H对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低。

（2）V H对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强。

两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。

16.微生物群体当实现从生长型到产物积累性的转变后，从外观上通常会有哪些变化？这些变化的本质是由什么引起的？

庆大霉素的发酵（放线菌）在菌体的增殖期，菌丝体细长，而进入庆大霉素的合成期，菌丝体变得粗短；地衣芽孢杆菌由原来生长期的粗短型转变成细长。这与同样是细菌发酵的谷氨酸发酵不同，后者当菌体从生长型转变成产物积累型后，其形态由细长变为粗短。

外观：菌体停止生长但形态发生变化，一般变得粗短，[OD]值变大。本质：某些营养成分成为限制性因子

17.细胞膜通透性的调节方式都有那几种？调节的意义是什么？

（1）①改变细胞膜的组成与结构，使之成为不完整的膜。

②破坏细胞壁的合成，细胞膜由于缺少壁的机械保护作用可以改变其渗透性。

③通透性酶活性的调节与控制，以有利于提高M的代谢产物的过量生产。

（2）过量排出产物，解除产物对酶系的抑制作用，进而提高底物转化率。

18.简述磷酸盐在抗生素发酵过程中的调节作用。

磷酸盐对抗生素发酵的影响具有双重性，主要表现在：

（1）高浓度的磷酸盐对抗生素的生物合成具有抑制和阻遏作用

①抑制或阻遏抗生素合成途经中的某些关键酶。已有许多研究证明：当磷酸盐的浓度≧10mmol/L时，菌体内与抗生素合成有关的酶的活性将受到抑制。②高浓度的磷酸盐可以改变菌体的代谢途径。

高浓度的磷酸盐改变MEP，HMP，不利于HMP的进行，当然也不利于以HMP途经中的中间产为前提的次级代谢产物的生物合成。

（2）磷酸盐浓度低时，菌体生长速度缓慢，生长量（菌体浓度）也不够，不利于抗生素的生物合成。

19. 从能荷的角度解释柠檬酸发酵过程中，“只长菌，不产酸”的原因。

菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中，有一步反应：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。而实际上，柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，即NADH即被氧化了，又没有产生ATP。该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸。

第五章思考题

1. 发酵热:发酵过程中，由于菌体对培养基利用而发生的生物反应及搅拌时产生的摩擦等等，都会产生一定的热量。同时罐壁的散热、水分的蒸发等也带走了一部分热量，发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热。Q发酵热=Q生物热+Q搅拌热+Q蒸发热+Q辐谢热

生物热:微生物在生长过程中，由于培养基中的营养性物质：糖、蛋白质、脂肪等被氧化，同时产生大量的热量，这些热量一部分用于合成高能物质（ATP\GTP）等，这些高能物质用于菌体自身的生长、繁殖上；剩余的另一部分，则以热的形式散发出来，其表现在外观上，就是使培养基的温度升高，这一部分热量称之为生物热。

生长相关性发酵:产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物。混合生长相关性发酵:生长与产物生成相关(如乳酸、柠檬酸、谷氨酸等的发酵)。

非生长相关性发酵:在生长和产物无关联的发酵模式中，细胞生长时，无产物，但细胞停止生长后，则有大量产物积累，产物的形成速率只与细胞积累量有关。

微生物的比生长速率:以单位细胞浓度为基准的细胞生长速率。

μ=r/c r：细胞生长绝对速率c：细胞浓度

搅拌轴功率:搅拌器输入搅拌流体的功率，即用以克服流体阻力所需用的功率。

氧传递动力学方程:dc/dt=kLa×(c*-c)

也可以写成以（P*-P）为推动力的氧传递方程式：dc/dt=kLa×（P*-P）式中：dc/dt——溶氧速率，mol/m3.h kLa——体积溶氧系数，1/h c*——与气相中氧的分压呈平衡的液相中的氧的浓度，也就是一定体系下的液相中的最大的溶氧浓度，mol/m3c——液相中氧的实际浓度，mol/m3

氧传递的双膜理论:①溶氧过程存在一个界面，这个界面的厚度可以忽略不计。在这个界面上，气相中氧的分压与溶于液相中氧的浓度呈平衡关系，既Pi与Ci呈平衡关系，符合亨利定律：Ci=K*Pi。②传质过程是一个稳定的过程，各点氧的浓度不是时间的函数。③气膜、液膜都以层流状态存在。

泡沫:泡沫是指气体分散在少量液体中的一种体系。在这个体系中，分散相是气体连续相是液体。

化学消泡:向发酵液中流加一定量的消泡剂，利用消泡剂的特殊性质消除掉泡沫的方法。

机械消泡：一种物理消泡方法，靠机械强烈震动，压力的变化促使气泡破裂或借机械力将

排出气体中的液体加以分离回收。

2.计算酵母菌在厌氧条件下代谢葡萄糖的发酵热？计算在好氧条件下的发酵热？两者比较说明什么？在有氧的的条件下Glucose经过MEP途经生成丙酮酸，丙酮酸进TCA循环被氧化成CO2和H2O，并有38分子的ATP生成，总反应式如下：C6H12O6+38ADP+38Pi=38ATP+6H2O+6CO2+Q生物热

-10×38×4.18KJ/mol根据化学反应的基本原理，对于一个化学反应，可以看成是一个平衡过程，则有下式：O生物热=O可逆=T?△S=△H-△G=-674-(-380)=-294kcol/mol式中：△H为反应的焓差，可以计算如下：

△H=△HG,C298-△HCO2,C298-△HH2O,C298

△HG,C298—葡萄糖的标准燃烧热，-674×4.18KJ/mol

△HCO2,C298，△HH2O,C298分别表示CO2和H2O的标准燃烧热0.△G为反应的焓差，即自由能，其值为-10×38×4.18KJ/mol则：O生物热=-294kcol/mol=-294×4.18KJ/mol

这就意味着，酵母菌在有氧的条件下，每氧化1mol的葡萄糖则可以产生：-294×4.18KJ/mol，用于使发酵液的温度升高。（2）酵母菌在无氧的条件下Glucose经过MEP途径生成2分子的丙酮酸，在无氧的条件下完全氧化生成乙醇、CO2。C6H12O6+2ADP+2Pi=2ATP+2C2H5OH+2CO2+Q生物热

-10×2×4.18KJ/mol

同样，有下列方程：Q生物热=Q可逆=T?△S=△H-△G=-674-2(-315)=-20kcol/mol

式中：△H为反应的焓差，可以计算如下：△H=△HG,C298-△HCO2,C298-△HH2O,C298-△H C2H5OH,C298△HG,C298—葡萄糖的标准燃烧热，-674×4.18KJ/mol△H C2H5OH,C298—乙醇的标准然热，-315×4.18KJ/mol

△HCO2,C298，△HH2O,C298分别表示CO2和H2O的标准燃烧热，0△G为反应的焓差，即自由能，其值为-10×2×4.18KJ/mol则：O生物热=-20kcol/mol=-20×4.18KJ/mol这就意味着，酵母菌在无氧的条件下，每氧化1mol的葡萄糖则可以产生：-20×4.18KJ/mol，用于使发酵液的温度升高。以上计算表明：有氧代谢和无氧代谢，其生物热差别是很大的。这一计算结果本质上是由于在不同的代谢条件下，形成的代谢产物是不同的，其产能水平也是不同的，因此生物热也不相同。这一部分的能量用于菌体生长代谢，即△G=-10×38×4.18KJ/mol

3.pH值对微生物生长的影响主要表现在那几个方面？

①pH值影响到了酶的活性，不同的酶有其最适合的pH值，当菌体中的酶系处于不适合的pH值环境时，必然影响到其代谢活动。

②pH值影响了菌体细胞膜的带电状态，从而影响了细胞膜的渗透性，必然就会影响营养物质的吸收与代谢产物的排泄。

③pH值影响Medium中的营养成份和中间性代谢产物的电离状态，从而影响了M对这些物质的正常

利用。

④pH值不同，其菌体代谢途径也会发生变化，代谢产物也不同。

⑤pH对细胞形态的影响实际上是pH值对细胞生长和代谢途径影响的外部（宏观）表现

4.我国机械消泡不能起主导作用的原因是什么？

在发酵产品质量，使用方法，对发酵过程中的M的代谢影响上，机械较化学消泡优越，但其作用过于有限。而化学消泡效果较好，抑泡效果优良。天然油脂类消泡剂价格便宜，来源广泛。

5.说明发酵过程中泡沫的消长规律？

通常，在发酵初期，由于培养基中的大量的发泡物质的存在，使得泡沫较多，但这时的泡沫大，易破碎；随着菌体的大量的增殖，以及大量的发泡物质被消耗，发酵过程中有一段时间泡沫很少；当菌体进入对数生长期后，由于菌体呼吸强度的增加，泡沫越来越多；当菌体进入产物合成期后，发酵液的泡沫仍然继续增加，这主要是由于菌体合成的产物增加了发酵液的粘度；发酵后期，由于大量的菌体的死亡以及死亡菌体细胞的菌体自溶，使得发酵液中的大分子蛋白质浓度增加，泡沫更为严重。

6.影响泡沫稳定的因素有哪些？

①与通风量、搅拌转速有关。通风量越大，泡沫越多；搅拌转速越大，泡沫越多。②培养基的成分。发泡物质：玉米浆、蛋白胨、花生粉、豆粕粉、黄豆粉、酵母粉、糖蜜等。泡沫的稳定物质：glucose,中分子的Pr，糊精，起泡性较差，但是它可以增加发酵液的粘度，稳定泡沫的存在。③与灭菌的操作有关。灭菌过程中，灭菌的强度越大，其发酵液中的泡沫越多。④泡沫与菌体的生长代谢有关。泡沫消长规律7.选择化学消泡剂的原则是什么？化学消泡主要有什么缺点？

（0）对发酵过程中的微生物的生长和代谢无副作用，对人、动物无毒性。（产品人用，母液用于饲料的生产）（1）能够迅速的消泡，对泡沫的控制持久性好。（2）高温灭菌不变性，在高温灭菌的温度下，对设备无腐蚀，也不产生腐蚀性的物质。发酵过程中流加的消泡剂需要先灭菌后流加,培养基中先要加一部分。（3）对产品的后述操作不产生不利的影响。（4）不干扰发酵过程中的分析系统的正常工作，DO、PH等（5）对氧的传递不产生不利的影响。（6）来源丰富，价格低廉。（7）分散性还好，有利于泡沫的控制。

1.天然油脂类主要有：玉米油、豆油、棉籽油、花生油等优点：价格便宜，来源较广泛，在中间加入后可以作为微生物的C原使用。缺点：不能一次性的加入的过多，否则，各种油脂会被脂肪酸酶分解成各种脂肪酸，造成发酵液的PH值的下降。油脂易氧化，氧化了的油脂对微生物的生长和代谢可能带来抑制作用。

2.聚醚类：生产上应用较多的是：聚氧乙烯氧丙烯甘油，又称为泡敌（GPE），其使用量在0.3-0.35%，消泡能力为天然油脂的10倍以上。聚氧丙烯（GP)也是一种消泡剂，其与环氧乙烷加成则生成聚氧乙烯氧丙烯（GPE）泡敌，

前者，具有良好的抑泡能力，后者，具有良好的消泡能力。在实际生产中，可以考虑两者共同使用。 3.硅酮类：聚甲基硅氧烷及其衍生物。为无色液体，不溶于水，试验表明，适合于微碱性的细菌、放线菌的发酵，对于发酵液的pH值为5左右的霉菌类的发酵，其消泡能力很差。

8.高粘性物系发酵过程中，搅拌产生的影响有哪些？

①对传热的影响。高粘度的物系发酵的发酵和其他发酵一样，发酵过程中有大量的热量产生，由于物料的高粘性使得热量的传递非常困难。②搅拌对气液混合的影响。不同的搅拌速率对于气液混合也会带来比较显著的影响。

9.以谷氨酸发酵过程中pH值的变化规律为例，说明为什么pH值的变化是反应过程中菌体生长和产物合成的综合性指标？