DB43T1422-2018渔业水体中孔雀石绿的测定液相色谱-串联质谱法
高效液相色谱-串联质谱法检测3种渔业环境基质中的孔雀石绿及隐性
收稿日期：２０１８－０６－２０ 作者简介：刘菁华（１９８６—），女，工程师，研究方向为环境药物残留检测及微生物降解。 项目资助：上海市水产研究所青年人才成长计划［沪农青字（２０１６）第 ３－４号］。
１６６
水产科技情报 ２０１９，４６（３）
等［６］对 珠 江 三 角 洲 某 水 产 养 殖 池 塘 的 ＭＧ 和 ＬＭＧ进行调研分析，结果显示，１０个取样点的底 泥中有 ＭＧ残留，残留量最高为 ０．０３０７μｇ／ｇ，３ 个取 样 点 的 底 泥 中 有 ＬＭＧ 残 留，残 留 量 为 ０．００７３～０．０３０９μｇ／ｇ。 因 此，评 估 渔 业 环 境 中 ＭＧ及其代谢产物 ＬＭＧ的残留状况，建立相应的 检测分析方法，对水产品中 ＭＧ和 ＬＭＧ污染来源 的排查具有重要意义。
本研究利用高效液相 －色谱串联质谱仪，针 对养殖池塘中的水体、底泥以及底泥 －水体混合 物 ３种不同基质中残留的 ＭＧ及其代谢产物 ＬＭＧ 进行提取、净化和富集，优化前处理过程以及仪器 分析条件，建立完善的渔业生态环境中的药物残 留检测体系，旨在为环境污染来源排查及评价生 态环境对健康养殖的影响提供技术支持。
由于孔雀石绿价格低廉、抗菌效果显著，且尚无更 好的替代药物，因此至今仍不断有违规使用孔雀 石绿的情况发生。
渔业养 殖 用 户 在 违 规 使 用 孔 雀 石 绿 的 过 程 中，往往会出现投放过度的情况，这些未被养殖动 物吸收的残留药物在水体中积累［４］，并随水中的 悬浮颗粒沉降，吸附在池塘底泥中，然后通过生物 富集作用对养殖生态系统和水产品质量产生影 响。我国渔业环境中孔雀石绿等药物的检出情况 时有发 生。 梅 光 明 等［５］对 某 地 乌 鳢 养 殖 集 中 区 域的 １２份池塘底泥样品进行检测，其中 １份样品 中检出 ＬＭＧ，质 量 浓 度 为 １．２２μｇ／ｋｇ。程 杏 安
高效液相-串联质谱同时测定水产品中孔雀石绿和氯霉素残留量
３ ０ ｓ ， ４ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 取上清液至另 ５ ０ ｍ Ｌ
离 心管 中。 加人 １ ０ ． ０ ｍＬ乙腈 重 复 提取 １ 次， 合并 提
取液 ， 用乙腈定容至 ２ ５ ． ０ ｍ Ｌ ， 摇匀备用 。 １ ． ２ ． ２ 样 品净化 移取 ５ ． Ｏ ０ ｍ Ｌ样 品溶液 加 至 已活 化 的中性氧化铝柱上 ，用 １ ５ ｍ Ｌ离心管接收流 出 液， 加 ８ ． ０ ｍＬ乙腈 洗 涤 中性 氧 化铝 柱 ， 收 集全 部 流
量 １ ０ ． ０ Ｉ ｘ Ｌ 。 氯 霉 素流动 相 ： 乙腈 ＋水 ：４ ０＋６ ０ ， 流 速０ ． ２ ｍ Ｌ ／ ｍ ｉ ｎ 。孑 Ｌ 雀石 绿流 动相 ： Ａ为 乙腈 ， Ｂ为
ｌ ０ ％甲醇 １ ０ ０ ． ０ ｍＬ＋０ ． ３ ％乙酸 ３ ． ０ ｍ Ｌ＋０ ． ２ ％甲酸
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ｎ ｇ氯霉 素 内标 ，按 样 品处理 程 序进 行提 取 和净化 、 浓缩 ， 制 备基 质加 标工 作 曲线 ， 内标法 定量 。 １ ． ３ 液相 色谱 一 串联质 谱条 件
Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｅ ｓ ， 使用前用 ５ ． ０ ｍ Ｌ乙腈进行活化。
１ ． ２ 样 品前 处理
铵 （ ３ ． １ ５ ｇ甲酸铵 溶 于 １ ０ ． ０ ｍＬ ９ ０ ％甲醇水 ） ２ ． ０ ｍＬ
超高效液相色谱-串联质谱快速测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量
摘要 ：建立 了超高效 液相色谱一 串联质谱 （ Ｐ Ｃ Ｍ ／ ）测定水产品中孔 雀石绿 （ Ｇ） Ｕ Ｌ — Ｓ ＭＳ Ｍ 、结 晶紫 （ Ｖ Ｃ ）及其代 谢物隐色孔雀石绿 （ ＭＧ）和隐色结晶紫 （ Ｃ Ｌ Ｌ Ｖ）残 留量 的快 速、准确检测 方法。该法在 Ｓ ／ ７ ８２０ Ｎ Ｔ １６ － ６快速 ０ 检测方法 的基础上 ，采用空 白样品添加 不同质量 浓度标准 溶液的方式 绘制校 准 曲线 ，并 以氘 代孔雀石绿 （） Ｉ・ ５ Ｍ Ｇ）和氘代隐色孔雀石绿 （ Ｌ Ｇ）为内标进行检测 ，从 而大 大提高了定量 的准确性。结果表 明，ＭＧ Ｖ Ｄ Ｍ 、Ｃ 、
第 ６卷第 ４期 ２ ０年 ８月 ０１
ｄｉ ０ ３ ６／．ｓｒ １７ ２ ２． ００ ０ ．０ ｏ：１．９ ９ｊｉ ｒ ６３— ２ ７２ １．４ ０６ ｓ 南 Nhomakorabea方 水 产
Ｓ ｕ ｈ Ｃ ｉａ Ｆ ｓ ｅ ｉｓＳ ｉｎ ｅ ｏ ｔ ｈ ｎ ｉｈ ｒ ｃｅ ｃ ｅ
检 测要 求 。
关键词 ：超高效液相色谱． 串联质谱 ；孔雀石绿 ；结 晶紫 ；代谢物；水产品
中 图分 类 号 ：Ｓ ４ ；Ｒ １５５ ８ ５ ． ９ 文献 标 志 码 ：Ａ 文章 编 号 ：１７ ２ ２ ６ ３— ２７一 （０ ０ ０ ０ ３ ０ ２ １ ） ４— ｏ ２— ５
Ｌ ＭＧ和 Ｌ Ｖ４种 待 测 物 在 ０～１ ． ｇｍＬ 范 围 内线 性 关 系 良好 （ ０ ９ ） Ｃ ００ｎ ・ Ｒ＞ ．９ ，方 法 检 出 限 均 为 ０ １ ・ｇ ． ｋ ～。 在
加标量为 ０５和 １０ｂ ・ｇ ． ． Ｌ ｋ 水平下 ４种待测物平均 回收率在 ９ ． ％ ～１１０ ｇ ２１ １． ％之间 ，测定结果的相对标准偏差为 ２ ２ 一 ． ％。此外 ，该法在 Ｆ Ｐ Ｓ国际能力验证 中得以证实 ，改进后的方法快速且 准确 ，能满足水产 品出 口 ．％ ９５ ＡＡ
水产品有机有害物的检测—孔雀石绿的测定
定量方法
四
内标法：
① 实验过程采用同位素内标法。 ② 内标物为：同位素内标氘代孔雀石绿(D5-MG)、
同位素内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)，纯度 大于98%。
检测原理
二
提取原理
试样中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶 紫、隐色结晶紫残留用乙腈提取，中性氧 化铝和阳离子交换固相萃取柱净化。
定量方法
1.液相色谱串联质谱测定 2.内标法定量。
三
1.提取过程：
提取步骤
称取5g样品于50 mL塑料离心管中； 加入20 μL内标标准工作液,加人10 mL乙腈； 匀浆2 min(l0000 r/min)； 超声提取10 min,离心3 min(3000 r/min)； 取上清液再加人10 mL乙腈,重复提取一次；
提取步骤
三
2.净化过程：
活化：5 mL乙腈。 上样：准确吸取5mL过固相萃取柱。 洗脱：用4 mL乙腈淋洗收集。 浓缩：洗脱液氮吹至0.5mL(≤45℃)。 复容：1.0 mL乙腈溶解，再加入1mL 乙酸铵溶液，过0.45 μm滤膜测定。
检测范围
四
种类及项目参数：
① 鱼、虾、蟹、贝、鱼粉、植物源性饲 料、浓缩饲料、配合饲料、饲料添加 剂、精料补充料。
检测原理 提取步骤 检测范围
孔雀石绿 简介
一
孔雀石绿室一种带有金属光泽的绿色结晶体，易 溶于水，水溶液呈蓝绿色。曾经作为杀菌剂，杀虫剂， 消毒剂 广泛应用于养殖业中，预防水产品水霉病、 鳃霉病和寄生虫病等，也用于水产品的运输和存放过 程中消毒并延长鱼类的生存时间，经研究表明孔雀石 绿进入人体或动物体后，代谢产物有高毒性、高残留 具有致畸 致癌 致突变风险严重危害人体或水产品安 全，因此我国已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。
液相色谱-串联质谱法测定水产品中孔雀石绿的残留量
９ ． ％ ．Ｒ Ｄ ｗｅ ｅ６ ２ ％ ａ ｄ ６ ７ ％ ．ｒ ｓ ｅ ｔ ｅｙ ５０ Ｓ ｒ ． ３ ｎ ．４ ｅ ｐ ｃ ｉ ｌ． ｖ Ｋｅ ｒ ｓ ｉ ｈ ｒ ｒ ｄ ｃｓ ｍａａ ｈ ｔ ｅ ｎ； ｈ ｇ — ｅ ｏ ａ ｃ ｉ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａ ｏ ａ ｈ — ｎ ｅ ｍａ ｓ ｓ ｅ ｔ ｍｅｒ ； ｍｕ ｔ ｌ ｅ ｃ ｙ ｗｏ ｄ ：ｆ ｅ ｐ ｏ ｕ ｔ ； ｌ ｃ ｉ ｇ ｅ ｓ ｙ ｅｒ ｉｈ ｐ ｒ ｒ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔ ｇ ｐ ｙ ｔ ｄ ｍ ｓ ｐ ｃｒ ｆｍ ｑ ｒ ａ ｏ ｔ ｙ ｌｐｅｒａ ’ ｉ
ｑ ａ ｔ ｃ ｔ ｎ ｗｅｅ ｐ ｒ ｒ ｄ ｕ ｉ ｇ ｉｔ ｒ ａ ｔｎ ａｄ ｍｅｈ ｄ ｕ ｎ ｉ ａｉ ｒ ｅ ｏ ｍｅ ｓｎ ｅ ｎ ｓａ ｄ ｒ ｔ ｏ ．Ｔ ｅ ｌ ｔｏ ｅｅ ｔ ｎ ｗ ｓ０ １ ， ・ ｇ。 ，ａ ｄ ｔ ｅ ｌ ｅ ｒｒｎ ｅｗａ ． ０ ｉ ｆ ｏ ｆ ｎ ｌ ｈ ｉ ｆｄ ｔｃ ｉ ａ ． ０ ｐ ｋ 。 ｎ ｈ ｎ ａ ｇ ｓ １ ｍｉ ｏ ｇ ｉ ａ ０
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第 ３卷 第 ６期 ２ ０ ０ ７年 １ 月 ２
Ｖｏ ． １ ３． Ｎｏ ６ ．
Ｄｅ ．， ２ ０７ ｃ Ｏ
液相 色 谱一 串联 质 谱 法测 定水 产 品 中
孔 雀石 绿 的残 留量
张海琪 ，何 中央 ，郑重莺 ，叶累海 ，施礼科
● ～ ＿ ＇ ・
ｇｒ ｅ ｉ ｔｓ ｒ ｏｄ ｔ ｅ ｎ ｎ ｉ ｈｅ ｙ ｐｒ ｕｃ ｓ
ＺＨＡＮＧ ｉ ， ＨＥ Ｚｈ ｎ ｙ ｎ Ｈａｑｉ ｏ ｇ ａ ｇ，ＺＨＥＮＧ ｏ ｇ ｉ ｇ， ＹＥ ｅｉａ ， Ｓ ｋ Ｃｈ ｎ ｙ ｎ Ｌ ｈ ｉ ＨＩＬｉｅ
高效液相色谱法测定水体中孔雀石绿残留量
107实验研究孔雀石绿，又称为碱性绿、孔雀绿等，其为一类生物染色剂、染料，商品名中含有草酸盐及氯化锌两种规格，呈现翠绿色结晶体，主要包含两种结构式，即盐酸盐和无色孔雀石绿，易溶于水、乙醇及甲醇中，其水溶液呈现蓝绿色，在水生生物体内代谢产物变为无色孔雀石绿。
当前水产品感染孔雀石绿途径主要包含养殖、运输及存放，其中养殖户进行鱼苗孵阶段，会利用孔雀石绿将其各类鱼病防治。
孔雀石绿不仅拥有高毒素特征，而且致癌及致畸性较强，可在动物内长期存留，通过动物代谢之后转化为无色孔雀石绿，对人们健康构成严重威胁。
本次实践的主要内容是使用高效液相色谱法测定水体中孔雀石绿的残留量。
检测结果的准确性、稳定性有利于有关监管部门对水产养殖基地兽药使用的监控，对食品安全起到预警、监督作用。
1.材料与方法1.1仪器与设备本试验中主要涉及以下设备：Agilent 1100型高效液相色谱仪：配荧光检测器；Mettler Tolledo(PL202-L/100)百分一天平；IKA MS3 basic旋涡混合器；OA-SYS氮吹仪；CNW固相萃取装置;Thermo移液器（1mL 5mL 10mL ）；Microman微量移液器（20μL~100μL ）1.2材料与试剂乙腈：色谱纯；二氯甲烷；冰乙酸；氨水；孔雀石绿标准品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)：纯度≥98%。
提取液：盐酸羟胺3g，对甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中。
硼氢化钾溶液［ 0.2% ］：称取0.2 g硼氢化钾溶于100 mL水中，现配现用。
乙酸铵缓冲溶液［ 0.125mol /L］：称取9.64 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至4.5，过0.45μm滤膜备用。
乙酸铵缓冲溶液［ 0.1mol /L］：称取7.71 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至10.0，过0.45μm 滤膜备用。
PRS柱洗脱液：乙酸铵缓冲溶液（0.1mol /L）+乙腈=1+1，现配现用。
超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量
超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量宋娟;毕小玲;庄晓洪【摘要】采用超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物的残留量。
样品经盐酸羟胺、对甲苯磺酸、乙酸铵的混合液作为提取剂均质提取，乙腈萃取，并通过－18℃冷冻离心分层。
以 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离，用乙腈与5 mmol·L－1乙酸铵溶液（75＋25）的混合液洗脱，采用正离子模式监测。
以氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿为内标物。
孔雀石绿和隐色孔雀石绿的线性范围均为1．0～20．0μg·L－1，检出限（3S／N）依次为0．05，0．06μg· kg－1。
在1．0，2．0，5．0μg·kg－1等3个浓度水平进行加标回收试验，回收率在90．2％～106％之间，测定值的相对标准偏差（n＝6）在2．1％～11％之间。
%UHPLC-MS/MS was applied to the determination of residual amounts of malachite green and its metabolite in aquatic product.The sample was treated by homogeneous extraction with extracting agent of mixed solution of hydroxylaminehydrochloride,toluene-p-sulfonic acid and ammonium acetate,and then extracted with acetonitrile.Phase-separation was attained by freezing centrifugation at - 18 ℃.ACQUITY UPLC BEH C18 column was used as stationary phase and a mixture of acetonitrile and 5 mmol·L-1 ammonium acetate (75 +25) was used as mobile phase in chromatographic separation.Positive electrospray ionization was used in the detection. The malachite green D5 and leuco-malachite green D6 were used as internal standards.Linearity ranges of malachite green and leuco-malachite greenwere found same between 1.0 -20.0 μg·L-1 with detection limits (3S/N)of 0.05,0.06 μg·kg-1 respectively.Tests for recovery were made by standard addition method at 3 concentration levels of 1.0,2.0,5.0 μg·kg-1 ,giving values of recovery and RSD′s (n=6)in the ranges of 90.2%-106% and 2.1%-11% respectively.【期刊名称】《理化检验-化学分册》【年(卷),期】2016(052)010【总页数】5页(P1164-1168)【关键词】超高效液相色谱-串联质谱法;孔雀石绿;代谢物;水产品【作者】宋娟;毕小玲;庄晓洪【作者单位】成都市食品药品检验研究院，成都 610000;成都市食品药品检验研究院，成都 610000;成都市食品药品检验研究院，成都 610000【正文语种】中文【中图分类】O657.63孔雀石绿（MG）是一种三苯甲烷类染料，过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂等［1］。
液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中孔雀石绿、结晶紫以及它们的隐色代谢物残留
于 ８２ ． ％。大 量 实 际 水 产 品 样 品 的检 测 结 果 表 明 ， 方 法 适 合 于 对 水 产 品 中孔 雀 石 绿 、 晶紫 以 及 它 们 的 隐 色 代 谢 此 结
物 的 残 留检 测 。
关 键 词 ： 相 色谱 一 液 串联 质 谱 ； 雀 石 绿 ； 晶 紫 ； 孔 结 隐色 代谢 物 ； 产 品 水 中 图分 类 号 ： ６ ８ ０ ５ 文献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ０ ８ ｌ （ ０ ７ ０ 一０ ６０ １ ０ —７ ２ ０ ） ｌ０ ６ —４ ３ 栏 目类 别 ： 究 论 文 研
相 萃取 净 化 。 采 用 Ｚ Ｒ Ａ Ｂ Ｃ Ｏ Ｂ Ｘ Ｓ — 色 谱 柱 ， 以 ０ ５ｍｍｏ／ 并 ． ｌＬ乙 酸铵 一 腈 （ 积 比 为 １ ： ０ 混 合 溶 液 为 流 动 相 ， 乙 体 ０９ ） 无 需 使 用 氧 化铅 柱 在 线 氧 化 ， 谱 分 离 后 直 接 进 入 串 联 质 谱 检 测 器 检 测 。 采 用 电 喷 雾 离 子 源 ， 离 子 多 反 应 监 测 色 正 （ Ｍ） 式 检 测 。方 法 的 检 测 限 （ ／ ＝ ） ＭＲ 模 Ｓ Ｎ ３ 可达 ０ ５ｎ ／ ， ． ｇ ｇ 平均 加标 回 收 率 为 ７ ． ％ ～ ８ １ 相 对 标 准 偏 差 均 小 ７６ ９ ． ％，
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湖
南省地方标准DB43
DB43/T 1422—2018 湖南省质量技术监督局发 布
2018-04-04 发布2018-07-04 实施
ICS 65.150
B 50渔业水体中孔雀石绿的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of malachite green in fisheries water
Liquid chromatography-tandem mass spectrometric method
DB43/T 1422—2018
目次
前言 (Ⅱ)
1 范围 (1)
2 规范性引用文件 (1)
3 方法原理 (1)
4 试剂与材料 (1)
5 仪器与设备 (2)
6 采样 (2)
7 测定步骤 (2)
8 结果计算 (3)
9 方法的灵敏度、准确度、精密度 (4)
附录 A （资料性附录）孔雀石绿、隐色孔雀石绿选择反应监测（SRM）色谱图 (5)
I
DB43/T 1422—2018
前言
本标准按GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。
本标准起草单位：湖南省水产科学研究所、农业部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙）、水产健康生产湖南省协同创新中心。
本标准主要起草人：黄向荣、万译文、杨霄、何咏、陈湘艺、伍远安、肖维、索纹纹、洪波、刘伶俐、黄华伟、曾春芳、李小玲、范叶。
II
渔业水体中孔雀石绿的测定液相色谱-串联质谱法
1 范围
本标准规定了渔业水体中孔雀石绿的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于我省渔业水体中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SL 187 水质采样技术规程
3 方法原理
水样中的目标物经中性氧化铝固相萃取柱富集和净化后，用带有电喷雾离子源的液相色谱－串联质谱仪正离子模式测定，内标法定量。
4 试剂与材料
本方法所用试剂除另有说明外，均为分析纯；实验用水应符合GB/T 6682一级水的规定。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2甲酸：色谱纯。
4.3乙酸铵：色谱纯。
4.4乙酸铵溶液（2 mmol/L）：称取0.075 g乙酸铵，置于500 mL容量瓶中，用水溶解定容至刻度。
4.5标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、同位素内标氘代孔雀石绿（D5-MG）、同位素内标氘代隐色孔雀石绿（D6-LMG），纯度应大于99.0%。
4.6标准储备溶液（100 μg/mL）：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿标准品，用乙腈配制成浓度为100 μg/mL的标准储备溶液，-18℃避光保存。
4.7混合标准溶液（100 ng/mL）：准确移取适量孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准储备溶液（4.6），用乙腈配制成100 ng/mL混合标准溶液，-18℃避光保存。
4.8混合内标标准溶液（100 ng/mL）：准确移取适量氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿标准储备溶液（4.6），用乙腈配制成100 ng/mL混合内标标准溶液，-18℃避光保存。
4.9混合标准工作溶液：根据需要，临用时准确吸取一定量的混合标准溶液（4.7）和混合内标标准溶液（4.8），用乙腈+2 mmol/L乙酸铵溶液（1+1）稀释配制成氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿浓度为2.00 ng/mL以及孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度为0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、
5.00 ng/mL的混合标准工作溶液。
4.10微孔有机过滤膜：0.22 μm。
1
5 仪器与设备
5.1液相色谱-串联质谱联用仪，配有电喷雾（ESI）离子源。
5.2 分析天平：感量0.00001 g和0.001 g。
5.3旋转蒸发仪。
5.4涡旋混匀器。
5.5 固相萃取装置。
5.6茄形瓶：50 mL。
6 采样
采样按SL 187的规定执行。
7 测定步骤
7.1 样品提取和净化
准确量取20 mL水样，置于50 mL离心管中，用甲酸调节pH至3.0左右，加入混合内标标准溶液（4.8）40 μL，涡旋混合30 s。
将预处理的水样在不抽真空的条件下全部转移至已活化的中性氧化铝固相萃取柱中，待水样全部过完后，加入5 mL纯水进行淋洗并吹干，加入8 mL乙腈进行洗脱，收集全部洗脱液，于45℃旋转蒸发至近干，加入1 mL 乙腈和1 mL乙酸铵溶液(4.4)后，漩涡混匀，过0.22 μm 微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。
7.2 测定
7.2.1 液相色谱参考条件
色谱柱：C18 (100×2.1 mm,粒径3 µm)，或其它等效柱。
流动相：A相：乙腈；B相：2 mmol/L乙酸铵溶液（含体积分数为0.1%甲酸）。
流动相梯度洗脱条件参见表1。
进样量：10 µL。
流速：0.30 mL/min。
柱温：35 ℃。
表1 流动相梯度洗脱条件
时间（min） A (%) B (%)
0 10 90
1.0 10 90
5.0 90 10
8.0 90 10
10.0 10 90
12.0 10 90
2
3
离子源：电喷雾离子源。
扫描方式：正离子扫描。
检测方式：选择反应监测（SRM ）。
喷雾电压：3.5 kV 。
离子传输毛细管温度：350 ℃。
定性、定量离子对和碰撞能量见表2。
表 2 定性、定量离子对和碰撞能量 目标化合物
定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 碰撞能量 / eV 329＞208 37
孔雀石绿
329＞313
329＞313 32 331＞239
31 隐色孔雀石绿
331＞316
331＞239 22 氘代孔雀石绿
334＞318 334＞318 37 氘代隐色孔雀石绿 337＞240 337＞240 32 7.2.3 定性
样品中待测化合物色谱峰的保留时间与相应浓度标准校准溶液的色谱峰的保留时间应一致，偏差在±5%之内。
在相同实验条件下，样品中待测化合物定性离子的相对丰度与浓度接近的标准物对应的定性离子的相对丰度比较，相对离子丰度的最大允许偏差参见表3。
表3 相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度K
K ＞50% 20%≤K ≤50% 10%<K<20% K ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%
7.2.4 定量
按7.2.1和7.2.2设置仪器条件，将混合标准工作溶液、样品溶液、空白溶液、空白添加试样等体积进样测定，内标法定量，孔雀石绿和隐色孔雀石绿的选择反应监测（SRM ）色谱图参见附录A ，孔雀石绿、隐色孔雀石绿混合标准溶液的选择反应监测（SRM ）色谱图参见附录A 中图A.1，空白水样的选择反应监测（SRM ）色谱图参见附录A 中图A.2，空白水样中添加孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准溶液的选择反应监测（SRM ）色谱图参见附录A 中图A.3。
7.2.5 空白试验
用实验用水替代样品，按上述测定条件和步骤进行。
8 结果计算
样品溶液中待测物的浓度由仪器工作站按内标法自动计算。
样品中待测物含量按（1）计算，计算结果需扣除空白值，保留2位有效数字。
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1V i i 式中：
X i ——样品中待测物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL ）； C i ——样品溶液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL ）； V 1——最终定容体积，单位为（mL ）；
V 2——试样体积，单位为（mL ）。
9 方法的灵敏度、准确度、精密度
9.1 灵敏度
本方法孔雀石绿和隐色孔雀石绿的定量限均为0.05 ng/mL 。
9.2 准确度
本方法添加浓度为（0.05～0.5）ng/mL 时回收率为（70～120）%。
9.3 精密度
本方法的批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。
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附录A
(
资料性附录）
孔雀石绿、隐色孔雀石绿选择反应监测（SRM ）色谱图
图A.1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿混合标准溶液
（0.10 ng/mL ）的选择反应监测（SRM ）色谱图
图A.2 空白水样的选择反应监测（SRM ）色谱图
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图A.3 空白水样中添加样品（0.10 ng/mL ）的选择反应监测（SRM ）色谱图 1—孔雀石绿特征离子（m/z 329＞208）
2—孔雀石绿特征离子（m/z 329＞313）
3—氘代孔雀石绿特征离子（m/z 334＞318）
4—隐色孔雀石绿特征离子（m/z 331＞316）
5—隐色孔雀石绿特征离子（m/z 331＞239）
6—氘代隐色孔雀石绿特征离子（m/z 337＞240）。