核酸扩增实时荧光检测系统培训教材
某公司PCR系列产品操作培训教材
样本保存
➢样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰 箱2-8℃存放，并在72h内检测 ➢-20℃保存不超过3个月 ➢-70℃下长期保存 ➢应避免反复冻融
乙醇可提取放于冰箱，低温 可提高DNA的沉降效率
6）10000rpm离心1min，弃废液；
样本管编号与硅胶柱编号应
7）加入500ul溶液W1（确保已加入乙醇）；
一一对应
8）10000rpm离心1min，弃废液；
9）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）；
10）10000rpm离心1min，弃废液；
整体操作流程
样本采集
DNA提取 PCR试剂配制、加样
上机扩增
结果分析
结果分析
设置基线（以ABI仪器为例）
➢若有Ct<16的强阳性样本，将此样本定为强阳性，并将此样本从数 据库中剔除，然后以3-15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct值； 若该样本需进行定量，则将其稀释后再重新扩增 ； ➢若无Ct<16的强阳性样本，应选3-15个循环的平均荧光信号作为基线 再分析Ct值。
样本类型&采集方法 ❖ 宫颈脱落细胞
用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处 宫颈脱落细胞。
❖ 男性尿道标本
用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉 拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。
❖ 男女性疣体标本
既可以直接切下疣体组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射 器把疣体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处脱落细胞置入无菌玻璃 管，密闭送检。
实时荧光定量PCR介绍课件
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 21
质粒标准品构建流程
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
基因组DNA 质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 22
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
4/5/2024 • 12
RT Primer的选择
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 13
RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。
核酸扩增技术教学课件ppt
RT-PCR技术
总结词
转录、反转录、灵敏度高。
详细描述
RT-PCR技术是一种将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的方法，具有高 灵敏度、高特异性、简单易行等特点，常用于检测细胞中基因表达水平。
qPCR技术
总结词
定量、高灵敏度、实时监测。
详细描述
qPCR技术即实时荧光定量PCR技术，是一种对特定DNA片段进行实时定量检测 的方法，具有高灵敏度、高特异性、可实时监测等特点，已广泛应用于基因表达 分析、病原体检测等领域。
详细介绍qPCR反应所需的各个组分及其作用，如 模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶、荧光染 料或探针等。
qPCR数据分析
介绍qPCR实验数据应该如何进行分析，包括扩增 曲线和熔解曲线的绘制和分析，以及Ct值的计算 和应用。
04
核酸扩增技术的数据分析与解读
数据分析方法与技巧
描述性统计分析
对实验数据进行描述性统计，如均 值、标准差等，以了解数据的集中 趋势和离散程度。
通过检测特定基因的扩增或缺失，对疾病进 行诊断和预测。
生物制药
进化研究
利用核酸扩增技术生产重组蛋白、抗体等生 物药物，用于治疗和预防疾病。
研究物种间的基因序列差异，揭示物种进化 的历史和机制。
误差分析与质量控制
01
误差来源
分析核酸扩增技术的误差来源，如试剂质量、操作流程、仪器设备等
。
02
质量控制
制定质量控制标准，如重复实验、阳性对照等，以确保实验结果的准
2023
《核酸扩增技术教学课件 ppt》
目 录
Байду номын сангаас
• 核酸扩增技术概述 • 核酸扩增技术的种类与特点 • 核酸扩增技术实验方案与步骤 • 核酸扩增技术的数据分析与解读 • 核酸扩增技术的优化与改进建议 • 核酸扩增技术的未来发展趋势与展望
核酸检测操作培训课件
核酸检测操作培训课件核酸检测操作培训课件随着新冠疫情的爆发和蔓延，核酸检测成为了目前最主要的病毒检测手段之一。
为了提高核酸检测的准确性和效率，许多机构和实验室都开展了相关的操作培训课程。
本文将介绍一些核酸检测操作培训课件的内容和要点。
一、核酸检测的原理和意义在介绍具体的操作步骤之前，首先需要了解核酸检测的原理和意义。
核酸检测通过提取样本中的核酸，利用特定的引物和酶的作用，扩增目标病毒的核酸片段，并通过荧光信号等方式进行检测和定量。
核酸检测的意义在于及时发现感染者，采取相应的隔离和治疗措施，有效遏制病毒的传播。
二、核酸检测的操作步骤1. 样本采集与保存核酸检测的第一步是样本采集与保存。
常见的样本包括鼻咽拭子、咽拭子、唾液等。
在采集样本时，需要注意采集器具的清洁和消毒，避免外界污染。
采集后的样本应妥善保存，避免温度过高或过低，影响核酸的稳定性。
2. 样本处理与核酸提取样本处理与核酸提取是核酸检测的关键步骤之一。
首先需要将采集的样本转移到提取管中，加入相应的提取缓冲液，破坏细胞膜和核酸的结构。
然后通过离心等操作，将核酸从其他组分中分离出来，并将其溶解在适当的缓冲液中，以便后续的扩增和检测。
3. 核酸扩增与检测核酸扩增与检测是核酸检测的核心步骤。
常用的扩增方法包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。
在扩增过程中，需要添加特定的引物和酶，以选择性地扩增目标病毒的核酸片段。
扩增后的产物可以通过荧光信号等方式进行检测和定量。
三、操作注意事项和常见问题在进行核酸检测操作时，需要注意以下几个方面的问题：1. 严格遵守操作规程和实验室安全规定，确保自身和他人的安全。
2. 保持操作环境的洁净和无菌，避免外界污染对实验结果的影响。
3. 使用高质量的试剂和耗材，确保实验的准确性和可靠性。
4. 注意样本的保存和处理方法，避免核酸的降解和损伤。
5. 定期进行设备的维护和校准，确保设备的正常运行和结果的准确性。
第三章 核酸扩增技术 ppt课件
5 目录
基础知识
+
2020/10/28
6 目录
基础知识
2020/10/28
7 目录
一、核酸分子杂交的基本原理
基础知识
DNA加热变性
DNA冷却复性
2020/10/28
8 目录
基础知识
DNA变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA分 子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有 序的双螺旋结构变为不规则无序的单链 线团样结构的过程。
二、PCR体系基本组成成分
1. 模板DNA 2. 特异性引物 3. 耐热DNA聚合酶 4. dNTPs 5. 缓冲液
现在位置 P170 2020/10/28
23 目 录
模板(template)
模板就是将要被复制的核酸片段， 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线 粒体DNA等。
在用 RNA作为模板时，须先将 RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为 PCR反应的模板进行扩增反应。
现在位置 P169 2020/10/28
15 目 录
一、PCR的原理和反应过程
PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得 以扩增，每一次复制包括3个步骤：
变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension）
现在位置 P125 2020/10/28
16 目 录
热变性的DN)。
2020/10/28
12 目 录
基础知识
2020/10/28
13 目 录
基础知识
dNTP
dATP dCTP dGTP dTTP
dNTP
2020/10/28
14 目 录
第一节 聚合酶链式反应
核酸检测培训资料
核酸检测培训资料摘要核酸检测是一种重要的生物技术，广泛应用于医学、疾病预防控制和研究领域。
本文档旨在提供核酸检测培训的资料，包括核酸检测的基本原理、常用的核酸检测方法和实验操作流程等内容。
通过本文档的学习，读者将能够掌握核酸检测技术的基本知识，为相关工作提供支持。
引言核酸检测是通过特定的方法和技术检测生物样本中的核酸分子，从而了解其中的基因组成和表达情况。
核酸检测在疾病诊断、基因表达研究、病毒监测等领域起着重要的作用。
本文档将介绍核酸检测的基本原理、常见的核酸检测方法以及相关实验操作流程，帮助读者快速入门核酸检测技术。
1. 核酸检测的基本原理核酸检测的基本原理是通过特异性的互补配对关系，将待检测的核酸与探针或引物结合，并利用特定的信号标记方法来检测目标核酸的存在与否。
主要包括以下几个方面的内容：•DNA与RNA的结构和特性•互补配对原理•控制实验条件以实现特异性检测2. 常见的核酸检测方法2.1 聚合酶链反应（Polymerase Chn Reaction, PCR）PCR是一种常用的核酸检测方法，通过不断重复进行DNA 的扩增，从少量起始模板DNA扩增到大量目标DNA。
该方法具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优点，广泛应用于医学诊断、个体鉴定和基因工程等领域。
2.2 实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）是PCR技术的改进版，可以实时监测PCR反应的过程，通过荧光信号的定量分析来确定起始模板的数量。
该方法具有高灵敏度、高特异性和准确性的优点，广泛应用于基因表达研究、病毒检测和药物研发等领域。
2.3 基因测序基因测序是确定DNA序列的方法，可以深入了解基因的结构和功能。
常见的基因测序方法包括Sanger测序和下一代测序技术。
基因测序在基因组学、遗传学和进化学等领域得到广泛应用。
2.4 蛋白质核酸相互作用分析蛋白质核酸相互作用分析是研究蛋白质与核酸之间相互作用的方法，可以深入了解蛋白质的功能和调控机制。
实时荧光定量PCR技术ppt课件
斜率与扩增效率
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光定量PCR化学原理
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fபைடு நூலகம்st
特征：
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直
观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差
（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光
性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
基因在不同组织中的表达差异
药物疗效考核
耐药性研究
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
实时荧光定量PCR讲座
熔解曲线有什么用？
• SYBR I • 逐步提高温度，读取荧光值，得到温度
与荧光值的关系曲线 • 目的：
– 1.决定产物双链的解链温度 – 2.产物的特异性（PCR反应的好坏）
• 设定适合的读板温度，避免非特异性产 物的荧光信号干扰
熔解曲线有什么用？
specific product
Non-specific product
➢ 不要用此PCR仪进行非荧光PCR反应；
➢ 荧光PCR使用的反应管为白管，透明盖。盖 盖子时不要用手，避免产生非特异荧光；
➢ 反应结束后，不但要关闭PCR仪电源，也务 必拔掉Blcok后面的黑色细插线；电脑可以不 关闭。
熔解曲线的暗示
• 反映本质问题
域值线的设置
• 曲线的优化
– 扣去基线（Baseline）
• Cycle Range （此区域内的荧光信号为背景） • Minimum over cycle range • Average over cycle range • Minimum Global
– 扣去空白（Blank）
10-14 g
104
4.03 x
10-13g
105
4.03 x 10-12
106
4.03 x 10-11
107
4.03 x 10-10
108
4.03 x 10-9
109
4.03 x 10-8
1010
4.03 x
10-7 g
计算出拷贝数（copies/ul） 梯度稀释制作标准品（大体积稀释10ul to 90ul） 定量PCR，检查Ct值差异 产物跑胶鉴定大小
（ug/ul)
如何制作标准品
• 以Adeasy腺病毒质粒为例：
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用右手向上翻开机盖
1
2
3
双手把持机盖两侧
向下翻转机盖
用双手母指向下用力 门扣合上，机盖关闭
样本量比较多 时, 将样本管均匀 分布于模块上, 使热盖能均匀 施压于任一个 样本管
样本量比较少 时, 将4个空样本 管置于模块4 角,平衡热盖压 力
MJR Opticon3 LED 光电倍增管 实时检测 在线观测 半导体 TaqMan探针 杂交探针 SYBRGREEN I 分子信标 有 0～1010 外对照 内对照
PE7000 卤素灯 CCD镜头模式 实时检测 在线观测 半导体 TaqMan探针 杂交探针 SYBRGREEN I 分子信标 有 0～1010 外对照 内对照
1. 接收光处易堵,模块需定期清洁
热盖
免维护的 二极管光源 虑光片
荧光检测单元
光电倍增管
步进马达Βιβλιοθήκη 优点: 1. 底部接收,接收光装置简单,成本低 缺点: 1. 接收光和发光处易堵,模块需定期 清洁 2. 底部如有血清杂质,灵敏度受影响 3.底部激发光,受光面积小,荧光激发 不充分
优点: 1. 由于侧面发光,热盖上部结构简单 缺点: 1. 接收光和发光处易堵,模块需定期 清洁 2.底部激发光,受光面积小,荧光激发 不充分 3.需加双向镜,使激发光和接收光分 离
AC220V，50Hz 1200VA 520mmX420mmX320mm
20kg
外形尺寸
重 量
处理器 操作系统 显示器 内存 硬盘
Pentium Ⅲ 主频800MHz Windows2000/XP 1024*768 128M RAM 10G
1
2
3
用右手母指向下 用力压紧机盖
再用右手按门扣上 部，门扣即被打开
博日FQD-33A LED 光电倍增管 实时检测 在线观测 半导体 TaqMan探针 杂交探针 SYBRGREEN I 分子信标 有 0～1010 外对照 内对照
上海枫岭 卤素灯 CCD镜头模式 实时检测 在线观测 半导体 TaqMan探针 杂交探针 SYBRGREEN I 分子信标 有 0～1010 外对照 内对照
致冷加 热方式
试剂定 量方法
熔点曲 线分析 动力学 范围 质控
1 LED发光源 2 470nm滤光片 3 热盖 4 样本管 5 变温模块 6 光纤束 7 530nm滤光片 8 光电倍增管PMT 9 数据处理器 10 计算机
长条形模块 传感器A 传感器B 翅片式散热器 半导体制冷器
1. 传感器A精确采集模块温 度 2. 传感器B为辅助传感器,通 过控制散热器温度,提高模 块温度控制的稳定性 3. 厚基板的翅片式散热器保 证散热器散热更均匀 4. 三个风扇的组合排风,保 证散热器排风均匀,确保长 条形模块的各处温度均匀
DA7600是全自动、实时监测、定量分析的核酸扩增实时荧 光检测系统。结合半导体制冷实现PCR扩增过程，并通过高灵 敏度的光电系统和高通量光纤导光系统对荧光信号进行实时检测， 实现同时对样品的扩增和检测。
优点: 1. 顶部激发光,受光量充足 2. 侧面接收,接收光充足 3. 侧面接收,接收光装置简单,成本低 缺点:
MJR Opticon3 实时荧光定量 PCR检测系统
优点: 1. 顶部激发光,受光量充足 2. 顶部接收,接收光无堵塞
隐患
缺点: 1. 接收光路复杂,设计难 度、设计成本高
VVVVVVVVVVVV
项 目 激发光 模式 荧光接 收模式 检测方 式
DA7600 LED 光电倍增管 实时检测 在线观测 半导体 TaqMan探针 杂交探针 SYBRGREEN I 分子信标 有 0～1010 外对照 内对照
风扇
样本容量
48X0.2ml 离心管
激发光波长
检测波长 模块温度范围 温度精确度 温度均匀性 升降温速率 工作环境
470nm
530nm、640nm、710nm 30～99℃ ≤±0.5℃ ≤±0.5℃（20秒后) 3 ℃/s (max. ) 环境温度10～30℃，相对湿度10%～70%
输入电源 耗 能