荧光素酶报告基因检测系统原理 ppt
双荧光素酶报告基因 ppt课件
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在这个过程中：
1.“基因剪刀”
剪切DNA的酶就像一把“基因剪刀”
2.“缝纫针”
连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使 二者连在一起
3.“交通工具”
使用载体好比一辆车子
4.“乘客”
有用基因如IL2好比乘客，车子把乘客送进理想天堂 （宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产
品或开展基因治疗（IL2/LAppKt课→件 抗癌）。
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一、目的基因的获取
1. 直接从染色体DNA中分离 2. 通过mRNA反的基因 5. PCR扩增目的基因 6. 人工体外合成基因片段
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PUC8 PBUDCE41 YE
pGEX-4T M13 pAdV5
(1)M13 (2)plasmid (3)λ phage (4)casmid (5)BAC (6)YAC 13
常用的报告基因载体类型： 1）basic 载体：不含 P/E,用于检测启动 子活性。 2）control载体：含启动子，用于检测增 强子或沉默子的活性。
受态 2 加入重组质粒，冰浴30分钟，不要震荡 3 42℃水浴60~90S，热休克 4 马上冰浴
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第七节 筛
抗药性筛选：ampr tetr kanr 插入表达筛选: 蓝白斑筛选： 测序 菌落或噬菌斑杂交筛选 酶切鉴定：插入否？插入方向？
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转染 ：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新 的遗传标志的过程 。 若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称 “瞬时转染(transient transfection)”； 若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制 称“稳定转染(stable transfection)”。
荧光素酶报告基因的检测
一、荧光素酶报告基因的检测原理荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。
自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。
细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。
目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。
发光机制生物荧光实质是一种化学荧光。
萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。
这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。
荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。
二、荧光素酶报告基因的检测流程1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。
三、荧光素酶报告基因的优点1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；4、发光检测，检测方便；5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；6、检测范围广，大于7个数量级。
荧光素酶报告基因实验原理和应用
荧光素酶报告基因实验原理和应用
荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，其原理
是利用荧光素酶（Luciferase）基因作为报告基因，将其插入到感
兴趣的基因或启动子区域中，通过检测荧光素酶的活性来研究目标
基因的表达情况或调控机制。
在实验中，研究人员首先将荧光素酶基因与感兴趣的基因或启
动子区域连接成融合基因，然后将融合基因导入到细胞系或转基因
模型中。
随后，通过添加荧光素底物（如琥珀酸衍生物）来激活荧
光素酶，荧光素酶与底物发生化学反应产生荧光信号，研究人员可
以通过荧光素酶活性的检测来定量或定性地分析目标基因的表达水
平或调控情况。
荧光素酶报告基因实验在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的转录水平和调控机制，通过分析荧光素酶活
性的变化来了解基因的表达模式及其受到的调控。
其次，荧光素酶
报告基因实验也可以用于筛选药物或化合物对基因表达的影响，从
而在药物研发领域发挥重要作用。
此外，荧光素酶报告基因实验还
可以用于研究信号转导通路、蛋白质相互作用等生物学过程，为科
研人员提供了重要的工具和手段。
总之，荧光素酶报告基因实验通过检测荧光素酶活性来研究基因表达和调控，具有灵敏度高、操作简便、应用广泛等特点，对于生物学研究和药物开发具有重要意义。
双荧光素酶系统实验操作步骤及方法ppt课件
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二、实验原理
➢ 利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣 的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞， 适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶 活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
1. 1X PLB裂解缓冲液配制：将4×体积水或PBS加入1×体 积5X PLB裂解缓冲液。（使用前在室温平衡1X 缓冲液， 平衡需2-3 min）。 2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：将Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后， 分装，置于-20℃避光保存。（一次配好，分装成小管， 避免反复冻融），使用前将配好的LAR II从-20℃拿出，并 平衡至室温（需20-30min）。
Protocols Run Promega Protocol DLR-O-INJ OK 3.将50μl LAR II加入1.5ml EP管中（专用的进口EP管），取
10μl 细胞裂解液加入装有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3 次混匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击 “Measure” 开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。 （使用前LAR II要混匀，并平衡到室温）
➢ 在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂II (LARII)时产 生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基 因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入 Stop & Glo® 试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾 荧光素酶反应，同时进行第二次测量。
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测荧光素酶报告基因检测是一种常用的生物学实验技术，它利用荧光素酶作为报告基因，通过检测其活性来研究目标基因的表达情况。
荧光素酶报告基因检测技术具有灵敏度高、操作简便、结果快速等优点，在分子生物学研究和生物医学领域得到了广泛的应用。
荧光素酶报告基因检测的原理是利用荧光素酶与其底物荧光素结合产生荧光反应，从而实现对目标基因表达的定量和定性检测。
在实验操作中，首先需要构建含有荧光素酶报告基因的表达载体，然后转染至目标细胞中。
随后添加荧光素底物，荧光素酶与底物结合产生荧光信号，通过荧光测定仪器检测荧光强度，从而反映目标基因在细胞中的表达水平。
荧光素酶报告基因检测技术在基因表达调控、信号转导、蛋白质相互作用等方面发挥着重要作用。
通过该技术可以实现对基因表达水平的定量检测，进而研究基因的调控机制和功能。
在药物筛选、基因治疗、疾病诊断等领域，荧光素酶报告基因检测也被广泛应用，为生物医学研究和临床诊断提供了重要的实验手段。
荧光素酶报告基因检测技术的发展不断推动着生物学研究的进步，但在实验操作中也需要注意一些关键问题。
例如，合理设计实验方案、选择合适的表达载体、优化转染条件等，都会对实验结果产生重要影响。
因此，在进行荧光素酶报告基因检测时，需要充分了解该技术的原理和操作要点，严格按照操作规程进行实验操作，确保获得准确可靠的实验结果。
总的来说，荧光素酶报告基因检测技术作为一种重要的生物学实验技术，具有广泛的应用前景和重要的科学研究意义。
通过对目标基因表达水平的检测和分析，可以深入了解基因调控机制、信号转导途径等生物学问题，为生命科学领域的研究提供有力支持。
随着生物技术的不断发展和完善，相信荧光素酶报告基因检测技术在未来会发挥更加重要的作用，为人类健康和生命科学研究做出更大贡献。
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测的原理是利用荧光素酶（Luciferase）作为报告基因，将其与感兴趣的基因启动子区域连接，构建成重组融合基因。
当该融合基因转染到细胞中后，若目标基因启动子区域受到调控，荧光素酶的表达水平也会受到影响。
通过加入荧光素底物后，荧光素酶会产生荧光信号，其强度与目标基因的表达水平成正比，从而可以通过检测荧光信号的强度来间接反映目标基因的表达水平。
荧光素酶报告基因检测在科研领域中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的调控机制。
通过构建不同长度或突变的基因启动子区域，可以了解到底哪些区域对基因的表达起着关键作用。
其次，荧光素酶报告基因检测也可以用于筛选药物或其他化合物对基因表达的影响。
通过将荧光素酶报告基因检测与高通量筛选技术相结合，可以快速筛选出对特定基因表达具有调控作用的化合物。
此外，荧光素酶报告基因检测还可以用于研究信号转导通路、蛋白质相互作用等多个研究领域。
相比于其他报告基因检测技术，荧光素酶报告基因检测具有许多优势。
首先，荧光素酶的底物具有极高的灵敏度和稳定性，使得
检测结果具有较高的准确性和重复性。
其次，荧光素酶报告基因检
测的操作简单、快速、成本较低，适用于大规模的样品检测。
此外，荧光素酶报告基因检测还可以通过荧光信号的定量来精确测定基因
的表达水平，而不受到其他细胞因素的干扰。
总之，荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于分子生物学研
究领域的技术，其原理简单、灵敏度高、操作方便、成本低，因此
受到了科研人员的青睐。
相信随着技术的不断进步，荧光素酶报告
基因检测将在生命科学领域发挥更加重要的作用。
荧光素酶报告实验原理
荧光素酶报告实验原理引言荧光素酶（Luciferase）报告实验是一种常用的生物学研究技术，它利用荧光素酶催化活性产生可见荧光信号，从而实现对特定基因表达水平的定量检测。
本文将介绍荧光素酶报告实验的原理及其在基因表达分析、药物筛选和疾病研究中的应用。
一、荧光素酶的基本原理荧光素酶是一种天然的生物发光酶，最早从发光昆虫中分离得到。
该酶能够将氧化的荧光素底物（D-luciferin）与氧气催化反应，产生CO2、AMP、光子和一些其他产物。
光子释放产生的荧光信号可以通过荧光仪进行定量测量，并用于确定荧光素酶活性。
二、荧光素酶报告基因构建为了实现对特定基因表达水平的检测，常将荧光素酶基因与目标基因的启动子片段融合构建成荧光素酶报告基因。
当目标基因启动子活性增加时，荧光素酶报告基因的转录水平也会相应增加，从而导致荧光素酶活性的增强。
三、荧光素酶报告实验流程1. 细胞培养与转染：将需要研究的细胞系培养至适当的数目，并转染荧光素酶报告基因。
2. 荧光素底物处理：在细胞培养基中添加荧光素底物，并在一定的温度和pH条件下孵育。
3. 荧光检测：使用荧光仪检测培养基中荧光素酶活性产生的荧光信号。
4. 数据分析：通过比较样品之间的荧光信号强度，可以进行定量分析，并得出目标基因的表达水平。
四、荧光素酶报告实验的应用1. 基因表达分析：荧光素酶报告实验可以定量测定特定基因在不同条件下的表达水平，帮助研究人员理解基因调控机制。
2. 药物筛选：荧光素酶报告实验可用于筛选药物对目标基因的影响，从而加速新药的研发过程。
3. 疾病研究：荧光素酶报告实验可以用于研究与疾病发展相关的基因表达变化，为疾病的诊断和治疗提供新的线索。
五、荧光素酶报告实验的优缺点1. 优点：荧光素酶报告实验灵敏度高，动态范围广，可用于定量分析基因表达水平；操作简便，成本低廉；无需破坏样本，可进行实时监测。
2. 缺点：荧光素酶报告实验对荧光素底物的要求较高，需要添加供应商提供的特定底物；背景荧光较高，可能会造成误差；某些细胞系对荧光素酶基因的表达不敏感。
荧光素酶报告基因
荧光素酶报告基因(Fluorescent Reporter Gene)是生物学领域中广泛应用的一种技术手段。
荧光素酶作为分析生命现象所必需的一种生物标志物，可以用来标记和追踪细胞内或外的分子、细胞类型、模拟生物转录过程、基因表达等方面。
技术通过将荧光素酶作为趋光性、生长、杂交等生物学过程的指标，来揭示生命现象的基本规律。
本文将介绍荧光素酶基因报告技术的基本原理、应用及其前景。
一、的基本原理是利用生物体自身内部的基因表达调节机制达到某种荧光素酶的表达密码子和目的产物细胞内外监测的方法。
荧光素酶是一种能够通过化学反应将无机物氧化成有机物的酶，其本身不会发出荧光。
通过将荧光素酶基因的编码序列与所研究的目的基因进行相互作用，使得目的基因在细胞表达时和荧光素酶基因同步表达。
通过构建含有的表达载体，将其转入到需要测试的细胞或组织中，使得荧光素酶基因能够在转录和翻译的过程中与目的基因共同运行，从而实现荧光素酶的表达和标记功能。
二、的应用1、生物学研究技术广泛应用于生物学研究中，例如基因表达的可视化、钙信号和细胞膜电位测量、蛋白相互作用和定位研究、药物筛选等多个方面。
在酵母菌中，可用于检测基因表达的动态变化，预测遗传调节网络的结构和功能。
在昆虫学中，可用于鉴定转基因昆虫和分析获得的虫体和细胞系的基因表达模式。
在细胞学和免疫学中，有助于检测细胞膜蛋白、病原菌等结构的活动。
2、医学研究技术可以用于医学研究中，如显像疾病的靶点和药物分子的筛选。
在肿瘤治疗方面，可以用于监测化疗药物的疗效和抗药性的产生。
同时，也有助于开发集成感应策略和筛选易感性团队的药物治疗体系。
三、技术的前景随着生命科学研究中的技术不断进步和多样化，技术也得到了越来越多的应用。
未来，技术可能会涉及到更广泛的应用领域，例如通过技术来实现自带传感器和设备的更高级操作系统，开发更智能的药物发现、治疗和诊断系统，推进生命科学的发展。
结论技术是一种应用广泛的生物技术手段，可以用于生物学研究以及医学研究方面。
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Background
Mouse models
The development is similar to the process of type 2 diabetes
Hyperinsulinemia is one of common features among all the animal models of obesity, and also one of the earlis- t metabolic alterations observed in 4 models.
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1
Contents
Background Method process
Conclusion
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2
Background
Type 2 diabetes
Insulin resistance
The mechanistic relationship between obesity, hyperinsulinemia, insulin resistance, and diabetes is not entirely clear.
At 60 min after 1nmol MTⅡ, the blood glucose test
The effect of melanocortin adminstration on serum insulin
-Leabharlann 10Results
Fig 1. 在ob/ob老鼠中，注射 黑皮质素激动剂对血清胰岛
素的影响。
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Process 1
Ob/ob mouse
Icv injection of MTⅡ (0.3 、1、3nmol) 、ACSF、
Leptin
Ob/ob 老鼠是瘦素缺陷 老鼠，具有高胰岛素血 症。
MTII 是MC4R/MC3R 的 激动剂，是α-MSH的类 似物。 ACSF—人工脑脊液
After 30-60min, RIA assay for serum insulin
2.芬妥胺对MTII在胰岛素分泌上的抑制作 用具有完全阻断效果。
3.芬妥胺对瘦素在胰岛素分泌上的抑制作 用具有部分阻断效果。
3. Whether the hyperinsulinemia in the melanocortin obesity syndromes is primary to MC4R blockade, a development consequence of MC4R blockade, or secondary to te hyperphagia and obesity.
The Central Melanocortin System Can Directly Regulate Serum Insulin Levels
From: Endocrinology (2000)
Author: Roger D. Cone et al.
Reporter：Ziqi Zhang
2015/6/22
Background
Energy intake
Energy expenditure
Glucose homeostasis
The Central Melanocortin
system
Hypothesis: the central melanocortin system may be involved in the regulation of glucose homeostasis
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Method
Surgical procedure
RIA assay for serum or plasma
insulin
Blood glucose and glucose tolerance test
Nonesterified fatty acid assay
Insulin tolerance test
72.8%
30-60min
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Conclusion
1.A中与两个对照相比，MTII 降低血清中的胰岛素水平，并具 有剂量反应 2.B中注射MTII后一小时检测到血糖浓度有明显增加。
a.中央黑皮质素受体可能参与在血糖调节过程。 b.MTII对胰岛素分泌的抑制不是由于降低血糖浓度而间 接起作用的。
-
to test the hypothesis
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Conclusion
Fig 2. MTII注射后降低血清胰岛素水平是通过刺激交 感神经而起作用的。
S: saline P: phentolamine A: ACSF M: MTⅡ L: Leptin
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Conclusion
1.芬妥胺对胰岛素分泌有促进作用，与文 献报道效果相同——芬妥胺能阻断交感 神经对胰岛素分泌的抑制作用。
MC4R
MC3R
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Background
Glucose homeostasis
外周组织对胰岛 素的敏感性
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Background
中央黑皮质素信号传 导缺陷（未知）
瘦素缺陷（有报道 ） 肥胖组织增生干扰胰 岛素作用（有报道）
其他未知
胰岛素敏感性下降
血糖升高
胰岛素抗性 胰岛补偿性分泌 胰岛素增加
血糖失衡 糖尿病
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Process 2
Ob/ob mouse
Ip injection with phentolamine or saline
Icv injection of MTⅡ 、ACSF、Leptin
RIA assay for serum insulin
Phentolamine :芬妥胺 ，非特异性α-肾上腺素 受体的反向激动剂，对 交感神经对胰岛素分泌 的抑制有阻断作用。
高胰岛素血症 血液胰岛素增加
血糖下降
暂时性血糖平衡
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Objective
1. Central melanocortin receptor signaling may play a role in the control of glucose homeostasis.
2.A hypothesis: the melanocortin agonist lowers serum insulin by stimulating the sympathetic drive to the pancreas known to inhibit insulin release.