实验七 重组DNA分子的转化
DNA重组的原理
DNA重组的原理
DNA重组是一种实验技术，用于将来自不同来源的DNA片段重新组合在一起形成新的DNA分子。
它的原理基于DNA的
双链结构和其特有的互补碱基配对规则。
首先，需要获取来自不同来源的DNA片段。
这些片段可以来
自同一生物体的不同基因，也可以来自不同生物体的DNA。
每个DNA片段都有自己特定的基因序列。
接下来，将目标DNA片段和载体DNA准备好。
载体DNA是
一个可以自我复制的DNA分子，常用的载体有质粒和噬菌体。
目标DNA片段和载体DNA都需要进行酶切，使用特定的限
制酶将它们切割成互补的DNA末端。
然后，将目标DNA片段和载体DNA连接在一起。
这一步需
要使用DNA连接酶，将目标DNA片段和载体DNA的互补末
端连接起来，形成一个新的DNA分子。
连接的过程中会形成
磷酸二酯键。
最后，将重组后的DNA分子导入宿主细胞中。
这可以通过转
化或转染的方法实现。
宿主细胞会接受重组后的DNA，并将
其复制和传递给子细胞，从而产生大量拥有重组DNA的细胞。
通过DNA重组，可以将不同基因或DNA片段组合在一起，
创建新的DNA分子。
这项技术被广泛应用于基因工程、遗传
学研究以及生物制药等领域。
重组DNA转化及筛选实验报告
重组DNA转化及筛选实验报告引言DNA重组技术是现代生物学研究中不可或缺的工具之一，它可以将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现特定基因的表达。
DNA转化是重组技术的关键步骤之一，通过电刺激或化学方法将外源DNA引入宿主细胞中。
本实验旨在通过DNA转化及筛选，构建宿主细胞中的重组DNA，并对成功转化的细胞进行筛选。
实验材料和方法材料：1. E. coli DH5α细胞2.外源质粒DNA3.LB琼脂培养基4.青霉素/链霉素抗生素5.离心管6.PCR仪7.恒温摇床方法：1.准备转化液：将50 mL LB琼脂培养基加入含有适量抗生素的离心管中，混匀。
2.取出青霉素/链霉素抗生素的冻存液，解冻后加入LB培养基中，使其浓度为最佳浓度。
3.取出冻存的E. coli DH5α细胞，放在冰上解冻。
4.加入转化液中的合适量DNA，比例为1:10（DNA:转化液）。
5.放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。
6.取出孵育后的细胞转化液，通过离心将细胞沉淀。
7.倒掉上清液，用适量的无菌去离子水悬浮细胞。
8.取一小部分悬浮液涂抹在含有抗生素的琼脂平板上。
9.将琼脂平板放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
10.检查平板上是否有菌落生长，记录结果。
11.选取生长菌落较大、菌落形态规则的菌落进行进一步筛选。
12.取一小部分菌落涂抹在新的琼脂平板上进行单克隆分离。
13.重复步骤12，直至获得纯合阳性克隆菌落。
14.提取纯合阳性菌落中的质粒DNA，进行PCR验证。
结果与讨论经过上述实验操作，我们成功地进行了重组DNA的转化和筛选。
在配制转化液时，选择适量的抗生素浓度非常重要，它可以帮助筛选出成功转化的细胞。
通过在琼脂平板上培养过夜后，我们可以观察到菌落的生长情况。
有菌落生长的平板可以说明转化成功，而没有菌落生长的平板则说明转化失败。
选取生长较大、形态规则的菌落进行进一步筛选是为了确保筛选出的细胞是单克隆的。
通过单克隆分离，我们获得了纯合阳性克隆菌落。
重组子实验报告
一、实验目的1. 了解DNA重组技术的原理和操作流程。
2. 掌握DNA片段的酶切、连接和转化等基本操作。
3. 学习重组子构建、筛选和鉴定的方法。
二、实验原理DNA重组技术是指利用限制性内切酶、DNA连接酶等工具，将不同来源的DNA片段按照一定顺序重新组装成新的DNA分子。
通过重组，可以获得具有特定遗传信息的DNA分子，如基因克隆、基因编辑等。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、紫外分光光度计、恒温培养箱、离心机等。
2. 实验试剂：DNA模板、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA载体、感受态细胞、PCR引物、琼脂糖、Tris-HCl缓冲液、DNA标记物等。
四、实验步骤1. 酶切反应a. 将DNA模板与限制性内切酶混合，加入Tris-HCl缓冲液和适当的盐，进行酶切反应。
b. 反应完成后，加入DNA连接酶，进行连接反应。
2. 连接反应a. 将酶切后的DNA片段与DNA载体混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
b. 反应完成后，加入终止剂，终止反应。
3. 转化反应a. 将连接产物与感受态细胞混合，加入CaCl2，进行转化反应。
b. 反应完成后，将转化后的细胞涂布在琼脂糖平板上，进行培养。
4. 重组子筛选a. 在培养过程中，观察平板上的菌落生长情况。
b. 挑选菌落进行PCR扩增，检测是否成功构建重组子。
5. 重组子鉴定a. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA条带。
b. 将电泳结果与预期结果进行对比，鉴定重组子。
五、实验结果与分析1. 酶切反应：酶切反应后，DNA模板发生断裂，形成一定长度的DNA片段。
2. 连接反应：连接反应后，DNA片段与载体分子连接，形成重组子。
3. 转化反应：转化反应后，重组子被导入感受态细胞。
4. 重组子筛选：通过PCR扩增，成功筛选出重组子。
5. 重组子鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳，鉴定出预期的DNA条带，证明重组子构建成功。
六、实验总结1. 本实验成功构建了重组子，并对其进行了筛选和鉴定。
基因工程实验流程
基因工程实验流程1.选择目标基因：首先，确定要研究或改造的目标基因。
这个基因可以是来自任何生物的DNA序列，包括原核生物和真核生物，甚至可以是合成的DNA片段。
2.基因分离：将包含目标基因的DNA从生物体中分离出来。
这可以通过提取目标生物体的基因组DNA，然后使用特定的酶切酶将目标基因从DNA中剪切出来。
3.DNA克隆：将目标基因插入到合适的载体中，形成重组DNA分子。
常用的载体包括质粒、病毒或人工染色体。
重组DNA分子可以通过转化、感染或转染等方法导入到宿主细胞中。
4.转化宿主细胞：将重组的DNA分子导入到适当的宿主细胞中。
这可以通过热冲击、电穿孔、化学方法或用载体病毒感染的方式实现。
在这一步中，多个宿主细胞可能被转化，以增加目标基因的表达量。
5.分子鉴定：通过PCR反应、限制性酶切、DNA测序等方法，对导入宿主细胞的重组DNA分子进行鉴定和验证。
这可以确认目标基因是否被正确克隆和定位在宿主细胞的基因组中。
6.蛋白质表达：通过转录和翻译，使目标基因在宿主细胞中转录成mRNA，然后翻译成蛋白质。
这个过程可以通过合适的启动子和转录因子来调控。
7.蛋白质纯化：通过细胞裂解和各种分离技术，获得纯度较高的目标蛋白质。
这包括离心、超滤、电泳等技术，可以去除其他细胞组分和杂质。
8.蛋白质功能研究：对纯化的目标蛋白质进行功能研究，了解其生物学功能和相互作用。
这可以通过基因敲除、突变、结构分析、生物活性检测等方法进行。
9.结果分析和确认：对实验结果进行数据分析和统计，确保实验结果的可靠性和重复性。
这包括基因表达水平、蛋白质功能、相互作用准确性和可靠性的验证。
10.应用和进一步研究：根据实验结果，根据需要对目标基因进行进一步改造或利用。
这可能涉及到设计新的实验和技术，以满足具体的应用需求。
总结：基因工程实验流程是一个复杂的过程，需要多个步骤和技术的相互协作。
这个过程涉及到基因选择、分离、克隆、转化、鉴定、蛋白质表达和纯化等多个关键步骤。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
实验七 重组DNA的转化
9、什么是假阳性？什么是假阴性？产生的原因有哪些？
-半乳糖苷酶（LacZ）和-互补
1、由四个相同的亚基组成，每个亚基包含和片段。
2、lacZ M15编码片段，当M15缺失（△M15）时lacZ基因只能表达片段，
-半乳糖苷酶则没有活性。
3 、 当 带 有 lacZ M15 （ 片 段 ） 基 因 的 lac 操 纵 子 通 过 载 体 DNA 转 入 到 lacZ△M15基因型的细菌细胞中，在诱导物存在的情况下，-半乳糖苷酶
实验六、重组DNA的转化
一、实验目的
学习将体外重组DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从 中筛选出重组子的常用方法。
二、实验原理
把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于 容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用 CaCl2处理受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻（0℃） 的CaCl2溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的 羧基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞 吸收外源DNA。在丰富培养基（SOC）上生长数小时后，球状细胞复原并分 裂增殖，被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基 平板上，可选出所需的转化子。 本实验所用重组DNA的载体带有E. coli中的-半乳糖苷酶基因（LacZ）的 调控序列和部分编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后 可与宿主细胞之间实现-互补而产生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成蓝色 菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。
分子生物学实验复习题附答案（最新整理）
分⼦⽣物学实验复习题附答案（最新整理）分⼦⽣物学复习题实验⼀DNA的制备（1）为什么分⼦⽣物学实施时要担⼼EB？溴化⼄锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化⼄锭可以嵌⼊碱基分⼦中，导致错配。
具有⾼致癌性(接触致癌)（2）DNA加样缓冲液的⽤途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产⽣不利的影响，在抽提缓冲液中需加⼊抗氧化剂或强还原剂(如巯基⼄醇)以降低这些酶类的活性。
线状DNA⼤⼩/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1（4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么DNA分⼦在pH值⾼于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。
DNA分⼦在电场中通过琼脂糖凝胶⽽泳动，除了电荷效应以外，还有分⼦筛效应。
由于DNA分⼦可⽚段的相对分⼦质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分⼦质量不同或构象不同的DNA分离。
DNA⽚段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反⽐，因此通过已知⼤⼩的标准物移动的距离与未知⽚段的移动距离时⾏⽐较，便可测出未知⽚段的⼤⼩。
但是当DNA分⼦⼤⼩超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分⼦⼤⼩，因此，就⽤琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分⼦⼤⼩不宜超过此值。
（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？溴化⼄锭是⼀种⾼度灵敏的荧光染⾊剂,可插⼊DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成⼀种荧光络合物。
在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄⾊的荧光。
⽤溴化⼄啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。
（6）制备基因组DNA时⽤到的以下试剂分别起什么作⽤？CTAB等离⼦型表⾯活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋⽩，使核蛋⽩解聚，从⽽使DNA得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋⽩质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)⽔溶性很强，经离⼼后即可从抽提液中除去细胞碎⽚和⼤部分蛋⽩质。
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四、实验步骤
①5μl连接产物加入到感受态细菌中，置冰上10min。 ②42℃水浴90s进行热休克（不可晃动），冰浴510min。 ③加入800μl不含抗生素的LB，37℃， 250r/min， 1hr 。
④ 3000rpm，4min，轻轻弃掉500μl上清（留上清的 量视平板干燥程度）。 ⑤加入40μl (40mg/ml)X-gal、2μl IPTG（400mmol/ml） 和8μl Amp+(100mg/ml) 抗生素涂布平板，37℃培养 过夜。
五.实验结果
图1
图2
ห้องสมุดไป่ตู้
如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本来Amp敏感的菌株也 可以在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不成功则Amp敏感的 菌株和阴性对照不会在含有Amp的LB固体培养基上生长。如图2
六.思考题
重组基因的导入方法有哪些?
实验七
重组DNA分子的转化
一、实验目的
掌握将外源DNA分子导入感受态细胞的技术
二、实验原理
转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致 其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗 传型与表型的改变。
三、实验材料
水浴锅、离心机、超净工作台、恒温培养箱、各式 移液器、培养皿； LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素。 DNA样品：重组DNA分子pCR2.1-Rv1791。