第二讲蛋白组学与二维电泳技术

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY第二讲二维电泳技术黎万玲全军免疫学研究所 2010.7
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COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY蛋白质组学？‡1994, Dr Marc Wilkins首先提出 ‡蛋白质组—组织或是一类细胞全部基因组表达的蛋白质 ‡蛋白质组学—大规模研究细胞,器官或是生物体液里的蛋白质,即研究蛋白质组的科学 ‡全部蛋白质,包含定位、修饰、相互作用、活性以及最终研究其功能
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY蛋白质组学当前的研究技术
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY双向电泳：细胞的快照
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYExtraction of proteinIsoelectric focusing (1D gel)Ettan™ IPGphor™MALDI-TOF SDS-PAGE双向电泳研究流程图stainingSpot excision; Trypsin digestion
双向电泳基本流程 ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY蛋白样品制备蛋白定量一向等电聚焦两维间的平衡二向SDS-PAGE电泳凝胶染色图像分析处理
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY重点介绍一、蛋白质样品的制备我的样品是什么类型的？可溶性样品？组织？细胞？应该怎样处理样品才能达到双向电泳要求？为什么？样品裂解液的组成及作用原理可能会出现什么样的问题？怎么解决？干扰物质的存在及解决
样品制备1.样品来源 可溶性样品 ‹ 组织样品 ‹ 细胞COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY血清、血浆、尿样、脑脊液、细胞和组织的水溶性提取物
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY可溶性样品血清、血浆、尿样、脑脊液细胞和组织的水溶性提取物血浆和血清等含高浓度蛋白的样品: ① 稀释后直接分析② 去除高丰度蛋白质其他类型的液态样品:含有较低的蛋白质浓度或较高盐浓度，将会干扰IEF时蛋白质的分离① 透析或液相色谱脱盐② 浓缩:冻干、聚乙二醇透析或用TCA／丙酮沉淀
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY固体组织样品最好的方法是在组织冷冻及液氮温度的条件下破碎 ‡ 较小组织的样品，用杵和研钵在液氮环境下压碎或采用GE的样本研磨试剂盒破碎 ‡ 大的组织块可在溶解缓冲液中用旋转叶片型匀浆器进行匀浆处理，但尽量避免加热和起泡沫。

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY组织样品的异质性① 基于免疫亲和技术的正性或负性选择-----实现对特殊细胞群的富集② 微量切割技术-----从组织切片中获取纯的细胞群
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY细胞离心收集细胞/通过刮擦方法收获细胞用等渗蔗糖溶液清洗细胞10mmol Tris 250mmol 山梨醇用样品裂解液裂解细胞
样品制备COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY样品的分级处理 ‹ ‹ ‹ ‹亚细胞分级液相电泳吸附色谱选择性沉淀蛋白质溶解度不同(最常用)
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYSampleSolution A Collect supernatePrecipitate 1Very soluble proteins will be extractedLyophilizeSolution A Gel 1Solution B Collect supernatePrecipitate 2Structural proteins, typical insoluble proteinsGel 2Really insoluble and hydrophobic proteins (like membrane proteins)Solution C Collect supernatePrecipitate 3 Incredibly insoluble junk DISCARDGel 3
样品制备COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY样品裂解及溶解液的组成及作用原理变性剂：典型代表是尿素和硫尿去污剂：常用的有阴离子去污剂SDS 非离子去污剂Triton X-100和NP-40 两性离子去污剂CHAPS
和SB3-10 还原剂：常用含自由巯基的DTT或β-巯基乙醇不带电荷的三丁基膦（TBP）
增溶剂：载体两性电解质或IPG缓冲液
样品制备—样品缓冲液的组成及作用原理变 COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY性剂尿素：一种中性变性剂，破坏氨基酸残基之间的非共价键和离子键而不影响等电聚焦。

尿素能使许多种蛋白溶解并展开形成完全随机的结构，所有的离子基团都暴露在溶液中。

硫脲：能提高蛋白质尤其是膜蛋白的溶解度。

一般是 2mol/L的硫尿与5-7mol/L尿素结合使用。

避免将含脲的溶液加热到30℃以上，因为这样会使其水解为氰酸盐，导致蛋白质电荷改变。

氰酸盐导致氨甲酰化横向点‹‹
样品制备—样品缓冲液的组成及作用原理去 COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY污剂蛋白质在去折叠后，会暴露出大量的疏水性残基，去污剂用于破坏蛋白质分子间的疏水相互作用，确保样本完全溶解最初使用非离子型去污剂NP-40和Triton X-100 两性离子去污剂CHAPS(2-4%)效果更好，能在不破坏蛋白质结构，保持生物活性的情况下改善蛋白质的溶解度阴离子去污剂SDS可促进样本完全溶解，但因带负电荷而不利于稳定等电聚焦中蛋白质的等电点，浓度不超过0.25%‹ ‹‹
样品制备—样品缓冲液的组成及作用原理还 ‹COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY原剂打开蛋白质的二硫键，使所有蛋白质处于还原状态常使用二硫苏糖醇（DTT），使用浓度为20-100mM增 ‹溶剂载体两性电解质或IPG缓冲液，最高浓度为2% 通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白质集聚，增加蛋白质的溶解性。

样品制备COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY样品制备基本原则 所有蛋白样品全部处于溶解状态 ‹ 制备方法应具有可重现性 ‹ 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 ‹ 防止抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等） ‹ 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 ‹ 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白
样品制备去除干扰物质COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY—关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 ‹ ‹ ‹ ‹盐离子和带电小分子人血清中的白蛋白和IGg 核酸、多糖、脂类酚类化合物不溶物质
样品制备—去除干扰物质盐离子和带电小分子zCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY对电泳的影响① 在第一向分离时增加传导性，
使其无法达到设置电压② 积聚在胶条内的阳极或阴极端，导致高传导性区域，使蛋白质
不能在此处聚焦③ 造成水的流动，使胶条一端肿胀，一端变干，导致两端的酸、碱性蛋
白无法聚焦，造成拖尾或丢失横条纹和点聚焦不佳 z 解决方法透析、超滤、TCA/丙酮沉淀、低离子洗涤溶液（Tris-山梨醇缓冲液）、进样后更换样品槽
样品制备—去除干扰物质人血清中的白蛋白和IgGzCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY对电泳的影响占人血清蛋白质的60%，会掩盖其他具有类似等电点和/或分子的蛋白质。

清除后可改善低丰度蛋白质的分辨率。

z解决方法亲和树脂选择性地清除白蛋白和IgG
样品制备—去除干扰物质核z ① ② ③ z ① ②COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY酸对电泳的影响增加样品的粘度，与蛋白形成
复合物导致不能有效分离使IEF胶上的酸性区域难以聚焦会出现假象迁移和条纹银染时
会产生高背景解决方法核酸酶: DNase/RNase A纵向的空白条带利用两性电解质使其形
成复合物后，超速离心去除
样品制备—去除干扰物质多zCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY糖对电泳的影响带负电的多糖会与蛋白质形成复合物导致拖尾和
影响聚焦解决方法超速离心、TCA/丙酮沉淀法z脂z类水平条纹和蛋白质点的不完全聚焦与蛋白质结合，降低蛋白质的可溶性，影响PH值和分子量对电泳的影响解决方法强
变性条件，增加去污剂；有机溶剂沉淀；TCA/丙酮沉淀z
样品制备—去除干扰物质酚类化合物zCOLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY对电泳的影响存在于植物组织中，能通过酶催化氧化反应修饰蛋白质解决方法利用还原剂防止产生酚类氧化物 TCA/丙酮沉淀法硫脲直接抑制
多酚氧化酶的作用用吸附剂吸附去除z ① ② ③ ④
样品制备COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY样品处理过程中需注意的问题 样品制备过程中所用的试剂应该是最高质量的。

溶液应该现用现配，或分装后冷冻保存‹ 第一向等电聚焦之前快速制备样品，并立即上样可以最好地保证样品质量。

如果样品必须保存，可分装后保存在-80℃以下 在第一
向等电聚焦之前，样品中所有的颗粒物都应离心除去
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY二、蛋
白质定量保证合适的蛋白质载样量载样量完全相同的相似样本进行比较 基本原理常用
方案
各种蛋白质定量法基本原理(1) (2) (3) (4)COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYBiuret Method: 铜离子与蛋白质骨架上的 C=O 基团结合，再还原成铜 (红橙色)。

Lowry Method:前半为 Biuret Method，再加上磷钼酸与磷钨酸对
酪氨酸吸附呈蓝色。

UV absorbance:蛋白质骨架上 C=O对200nm 波长，芳香族氨基酸对280nm 有吸光。

Bradford Method:考马斯亮蓝G250吸附到蛋白质后会变成蓝色，蛋白质越多，蓝色越深。

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COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY几种蛋
白质定量方法比较方法灵敏度1～20mg原理干扰物质双缩脲（ Biuret Method） Folin-
酚试剂法（Lowry法）紫外吸收法5μg硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸磷钼酸-磷钨
酸试剂硫酸铵，Tris缓被Tyr和Phe还原冲液，甘氨酸，各种硫醇多肽键加碱性铜离
子生成紫色络合物各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸50～100μg 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280nm处的光吸收 1～5μg考马斯亮蓝法 (Bradford法)考马斯亮蓝染料与强碱性
缓冲液，蛋白质结合时其 TritonX-100,SDS λmax由465nm变为595nm
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY含有沉
淀剂，定量沉淀样本中的蛋白质，污染物质则留在溶液中。

用二价铜离子碱性溶液再溶
解沉淀，二价铜离子可与蛋白质的多肽骨架结合，加入比色剂，与未结合的二价铜离子
发生反应，样本溶液的色密度与蛋白质浓度成反比，通过与标准曲线的比较，就可以精确测定蛋白质的浓度。

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY重点介绍三、一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG） ‹ ‹ ‹ ‹ ‹基本原理: pI pH IPG凝胶制备及胶条选择 pH梯度的选择 IPG胶条重泡胀加样和运行聚焦时间的优化
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY等电聚焦利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰胺凝胶上制造一个pH梯度，电泳时被分离的蛋白质迁移到各自等电点的pH处，聚集形成很窄的区带，称为等电聚焦。

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY蛋白质
在环境pH 值低于pI 时带正电，高于pI 值时带负电。

若将蛋白质分子所带电量与环境
pH 值作图，结果曲线在等电点处与横轴相交
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY+pH 3 pH 7.5–pH 10+pH 3 pH 7.5–pH 10+pH 3 pH 7.5–pH 10+pH 3 pH 7.5–pH 10
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYpH 梯度
的形成Carrier Ampholytes（载体两性电解质） Immobilised pH Gradients 目前常用的IPG胶条为该类型
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYsynthetic Carrier Ampholytes （合成载体两性电解质）z合成过程复杂，其重复性很难控制，导致
同一蛋白质在不同批次等电聚焦中所出现的位置有所偏差，限制了蛋白质分离的重复性。

分子量相对较小，难以在IEF胶内固定，在等电聚焦过程中由于水合正离子引起的电渗
流将致使SCA分子向负极迁移（负极漂移），结果使pH值的不稳定性增加。

z z负极漂
移导致碱性区蛋白质难以成功聚焦甚至丢失
Immobilized pH gradients
Immobilines，为8种丙烯酰胺衍生
物，其中R包含羧基或叔氨基团，
构成了分布在pH3~10不同值的缓
冲体系。

每个分子都有一个单一的酸性或
碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连。

分子一端的双键可以在聚合过程
中共价镶嵌到聚丙烯酰胺介质
中。

所以它是固相的，即使是在
电场中也不会漂移。

通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF
分离达到真正的平衡状态。

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY选择胶条长度 如果进行快速、高性价比的筛选，或所感兴趣的是最高丰度蛋白质，可选择较短的胶条，即13cm 以下。

胶条越短，电泳速度越快，不过载样量就受到限制。

‡ 如果想获得最大分辨率和载样量，可选择较长的胶条，即18cm 和24cm 胶条。

胶条越长，所能检测出的斑点越多，蛋白质的选取与鉴别也越容易，但是第一向和第二向电泳均需要较长的时间。

要获得最大分辨率，须选择 24cm 长的胶条。

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COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY选择 pH 梯度先宽后窄先线性后非线性先短后长预试验确定
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COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY对一新样品，常使用宽范围、线性pH3-10的IPG梯度。

但对大多数样品，这样做会丧失pH5-7区域的分辨率，许多蛋白质的pI值在该区域。

利用非线性pH3-10 IPG IEF胶在一定程度上缓解了这个问题。

pH3-10非线性胶条在pH5-7区域的梯度要比pH7-10 更为平坦，保证在大部分碱性蛋白质都能得到分辨的前提下， pH5-7区域能得到更好的分离。

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY等电聚焦上样 泡胀的实质：让样品能完全以可溶性的形式进入 IPG内，从而能进行接下来的IEF ‡ 方法：将样品与重胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时样品也渗入胶条，在重泡胀过程中加30V的低电压，可以使样品聚焦更好 ‡ 一般使用Protean IEF cell、IPGphor等集成设备
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY蛋白载样量IPG胶条对蛋白载样量的要求： ‡ 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析 ‡ 待研究蛋白的丰度 ‡ IPG胶条的pH范围 ‡ 染色方法避免超载
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYIPG胶条的蛋白质大约载样量IPG Strip length 7cm 11cm 17cm Analytical Load (silver staining) 10~100 µ g /125 µ l 50~200 µ g /185 µ l 100~300 µ g/300 µ l Preparative Load (Coom staining) 200~500ug/125 µ l 250~1000ug/185 µ l 1~3mg/300 µ l
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY聚焦时间的优化 理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性不完全聚焦产生横纹所需最佳时
间是 IEF分离达到稳定态所需的时间。

若聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，但要避免过度聚焦 ‡最佳聚焦时间必须根据不同蛋白质样品、蛋白上样量和所用特定pH范围及IPG胶条长度通过度聚焦产生横纹过经验来确定
利用IPGphor的运行条件
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY四、两维间的平衡‡ 一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于－80℃保存数月 ‡ 在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE时电泳能顺利进行。

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYIEF完成之后在-70℃放置数小时然后解冻再向二向转移的话， SDS中蛋白质点的分离效果会更好
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COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYSDS作用不充分IAA作用不充分严格控制好平衡时间！
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY重点介绍五、第二向SDS-PAGE‡同普通SDS-PAGE类似 ‡但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂N, N甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY聚丙烯酰胺凝胶孔径的可调性凝胶的孔径大小是最重要的决定蛋白质分离效果的因素。

T值和C 值决定了凝胶的孔径大小，其中T值更重要。

要得到最优的分离效果，就要对T值和C 值进行选择 C值常用2.6% T值3-20%之间，数值越大孔径越小
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY聚丙烯
酰胺凝胶电泳原理浓缩效应：浓缩胶将蛋白压缩成一条狭窄的起始区带分子筛效应：分
子量小、球形蛋白迁移快电荷效应：蛋白表面净电荷多则迁移快与分子量大小、分子形
状和表面电荷三个因素有关
SDS在蛋白质表面均匀附上一层负电荷
原态蛋白质变性蛋白质成一线状分子
SDS 是一种表面活性剂，可以吸附到蛋白质的非极性区域。

原态蛋白质都有一定的分子构形(左图)，若加入SDS并且加热，则SDS 分子上的非极性
区(黃色尾巴)，会与蛋白质上的非极性区结合，并且使蛋白质变性，成为一线状长条分子，上面布满SDS 分子。

SDS 分子的极性区(洋红色圆点)，则露在外面，以增加亲水性。

这样
的蛋白质，几乎不会有活性；但注意有些蛋白酶在SDS 中还具有极佳的活性，如proteaseK。

COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYSDS-PAGE电泳:分离效果只与分子量相关
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY第二相
垂直电泳转移步骤
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY第二相
垂直电泳
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY六、凝
胶上蛋白质的检测优良染色方法应具备的7个S安全(Safety)：不应该含有害材料灵敏(Sensitivity)：检测到亚纳克级蛋白，线性范围宽简单(Simplicity)：孵育简单，对显色时
间无苛刻要求特异性(Specificity)：只特异性检测蛋白质快速(speed)：可以快速检测蛋白，不需脱色稳定(Stability)：具有化学稳定性，保存期长兼容性(Synergy)：和多种分离技术兼容，与质谱兼容
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY七、凝胶的图像处理分析和典型流程‡ 凝胶图像的扫描 ‡ 图像加工 ‡ 斑点检测和定量 ‡ 凝胶配比 ‡ 数据分析 ‡ 数据呈递和解释 ‡ 2-DE数据库的建立
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY蛋白点获取 人工切胶 ‡ 自动切胶仪
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY八、蛋白鉴定 蛋白斑点的酶解（将蛋白切成肽段） ¾凝胶内酶切 ¾电洗脱后在溶液中酶切 ¾电转移到膜上在膜上酶切 ¾在印迹过程中酶切 ‡ 质谱分析 ¾MADLI-TOF ¾ESI-MS-MS…...
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY九、2-DE的局限性及改进 分辨率：使用大胶，多种窄pH梯度的IEF胶非线性胶，样品预先分级‹ ‹ ‹灵敏度：去除高丰度蛋白，富集低丰度蛋白表现度：膜蛋白，分级分离，亚蛋白质组分离自动化：图像分析软件，自动切胶仪
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY二维电泳流程总结
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYSample preparationLysis solution:8M 4% 40mMCell line Lysis solution Sonication vacuum Lysis solution Centrifugation Measurement of [protein] 2-DE sampleUrea NP-40 or CHAPS Tris base
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYIPG strip rehydration and sample loading2-DE sample Rehydration solutionRehydration solution:8M 2% 2% 0.28% Trace Urea NP-40 or CHAPS IPG buffer (Ampholyte) DTT Bromophenol blueIPG strip holderPosition the IPG strip
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYIPG strip rehydration and sample loadingStrip holderAnode (+) electrodeCathode (-) electrode COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYFirst dimension: Isoelectric focusing1. 30 voltage 12hr 2. 200 V 3. 500 V step-n-hold step-n-hold 1.5hr 1.5hr 1500vhr 36000vhr4. 1000 V gradient 5. 8000 V gradient
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITYSecond dimension: SDS-PAGE• SDS equilibration • SDS-PAGE SDS equilibration buffer50 mM 6M 30% 2% Trace Tris-HCl Urea Glycerol SDS Bromophenol0.5% agarose in running bufferIPG stripMarker in paperSDSSDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE。