4.1.1蛋白质地分离与纯化方法
蛋白质的纯化方法
蛋白质纯化的方法蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。
由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。
一般温度低蛋白质溶介度降低。
但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。
（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。
（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。
因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。
硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。
蛋白质分离与纯化技术的原理及方法
蛋白质分离与纯化技术的原理及方法蛋白质是生物体内重要的基本分子组成，对于维持正常生命活动和疾病诊断都具有重要的意义。
但是，大多数蛋白质在生物体内含量非常低，而其他非蛋白质物质影响蛋白质的检测和分离，因此需要分离和纯化。
本文将详细介绍蛋白质分离与纯化技术。
一、蛋白质分离技术的原理蛋白质分离技术是指根据生物分子的特异性，将混合的蛋白质样品分离为纯度高的蛋白质样品的一种技术。
蛋白质分离技术主要基于蛋白质之间不同的特异性，如不同蛋白质之间的分子量、等电点、亲和性、化学性质等。
目前，常用的蛋白质分离技术包括血凝素亲和层析，酸碱沉淀，凝胶过滤层析，离子交换层析等。
在这些技术中，用于分离纯化特定蛋白质的介质通常都是指具有某种亲和性的化合物。
例如，离子交换层析的介质是酰胺基结构化支链多孔聚合物，允许基于蛋白质的带电性进行区分和分离。
二、蛋白质纯化技术的原理在蛋白质的分离基础上，蛋白质纯化技术是指将分离出来的蛋白质再次通过特殊的操作方法，使蛋白质纯度相对较高，以获取更精确的蛋白质信息。
纯化方法的选择和分离方法的选择有关。
一般而言，蛋白质分离后，样品中常常含有一定的杂质。
因此，在纯化前应该清洁样品。
清洁样品的方法可以是简单的酸洗化或钠氢硝酸纯化。
为了获得高纯度的蛋白质，需要使用更高效的纯化方法，如离子交换，凝胶过滤，凝胶电泳等。
除此之外，还有一些高端的纯化技术如傅立叶红外显微光谱（FTIR），二维蛋白质凝胶电泳，蛋白质结构分析和序列识别等。
这些纯化技术在制备高纯度蛋白质样品中都有广泛的应用。
三、蛋白质分离和纯化的方法（一）离子交换层析技术离子交换是分离和分析离子化合物的一种方法，其原理是根据样品分子溶液里的离子性质（酸性或碱性）将蛋白质通过介质分离。
离子交换层析主要分为阴离子交换（AEC）和阳离子交换（CEC）两种，每种层析介质都包括两种类型的树脂：强的交换树脂（强酸性或强碱性）和弱的交换树脂。
强交换树脂具有极高的层析能力和选择性，但有时会在操作中造成带电蛋白质的不良堵塞。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
蛋白质的分离与纯化
（1）凝胶的选择：
。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀
后，配成
。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
① 固定：将色谱柱处置固定在支架上
② 装填：将
一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，
使凝胶填装均匀。
③ 洗涤平衡: 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用
3、具体过程：
相对分子质量 较小的蛋白质
（1）
（2） （3） （4）
（5）
相对分子质量 较大的蛋白质
A B
A
的蛋白质由于
作用进入凝胶颗粒内部而被滞
留；
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间
迅速通过。
B（1）
混合物上柱；
（2）洗脱开始，
的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；
的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3）
子
以及分子本身 、
的不同使带电分子产
生不同的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶
电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的
大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入
(4) 透析
2. 凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
① 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
② 底塞的制作：打孔 挖出凹穴
安装移液管头部 覆
盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切
蛋白质的分离和纯化技术
蛋白质的分离和纯化技术蛋白质是生命活动的重要组成部分，广泛存在于个体组织中，参与细胞各方面生理过程。
蛋白质的研究对于生命科学领域的发展有着极为重要的作用。
然而，对于蛋白质的分离与纯化技术，科学家们远非游刃有余。
因此，本文将深入探究蛋白质的分离与纯化技术。
一、蛋白质的分离技术蛋白质的分离技术是指将蛋白质分离出不同的组成分。
这一技术对于深入理解蛋白质的结构与性质具有至关重要的意义。
在蛋白质的分离技术中，一般采用以下几种方法。
1. 色谱法色谱法是一种常用的蛋白质分离技术。
该技术利用分子在色谱柱内路程的长短及其与固定相的亲疏性不同进行分离。
色谱法的种类繁多，包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、逆相色谱等等。
其中，离子交换色谱是一种常用的技术，其原理是利用带电离子在固定相和流动相之间的移动，实现蛋白质分离。
2. 应用电泳法电泳法是一种通过电场力使带电分子（如蛋白质等）在凝胶或液体中运动的技术。
电泳法分为水平电泳和竖直电泳两种。
其中，竖直电泳依托了载体凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，通过蛋白质在其上的移动距离从而进行分离。
而水平电泳利用了专门的电泳分离仪器，将蛋白质定向在凝胶内运动，从而完成分离。
3. 超高速离心法超高速离心法是一种通过在高速旋转离心管内快速离心并重复洗涤，分离出不同种类的蛋白质的技术。
其原理是根据分子量大小、形状及密度的不同，将蛋白质分离开来。
超高速离心法的优点在于适用范围广、精度高。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术是指将带有杂质的蛋白质组分经过一系列处理后，得到较为单一、纯度高的蛋白质的技术。
蛋白质纯化技术对于蛋白质结构及性质的研究极为重要。
在蛋白质的纯化技术中，一般采用以下几种方法。
1. 电吸附法电吸附法是一种利用电动势引起蛋白质在吸附固定相上的吸附性分离方法。
其基本原理是电动势过程将分子有序地排列在吸附剂上，从而实现蛋白质的吸附。
该方法适用于小分子量蛋白，具有纯化速度快，操作简便等特点。
2. 亲和层析亲和层析是官能团彼此配对的分子间吸引力引导下发生的某种物质在吸附剂上选择性吸附的分离方法，分离了同种蛋白彼此间在电性等方面的异质。
简述一般根据蛋白质的哪些性质分离、纯化蛋白质
离子交换层析 带正电的离子交换树 脂结合带负电的蛋白。
（四）利用选择性吸附的纯化 方法
疏水作用层析是根据蛋白质表面的疏 水性差别。
在疏水作用层析中，不是暴露的疏 水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互 作用，而是连接支持介质(如琼脂糖)上 的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水 基团结合。
由于疏水作用层析要求盐析化合物 如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面 的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可
电泳法原理
2、离子交换层析法
蛋白质对离子交换剂的结合力取 决于彼此间相反电荷基团的静电吸引， 而这和溶液的pH有关，离子交换剂有阳 离子交换剂 （羧甲基纤维素 ）和阴离子 交换剂（二乙氨基乙基纤维素 ），当被 分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱 时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白 质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱 下来。
（2）pH值带净电荷越多，它的溶解度就越大。改 变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改 变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度 大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀 蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附 近。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱 而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致 蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋 白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用 偏碱性的提取液。
超滤技术的应用 有很好的前景，应引 起足够的重视。
2、密度梯度（区带）离心
蛋白质沉降不仅决定于它的大小，而且也 取决于它的密度。蛋白质颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量 和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗 粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时， 即停止不前，前后各种蛋白质在离心管中被分 离成各自独立的区带。
蛋白质的分离纯化技术
蛋白质的分离纯化技术一、依照蛋白质带电性质不同的分离技术以离子互换剂作为柱填充物，在中性条件下，依照由于蛋白质和多肽的带电性不同而引发的离子互换亲和力的不同而取得分离。
其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类, 还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子互换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。
离子互换剂有阳离子互换剂和阴离子互换剂。
当被分离的蛋白质溶液流经离子互换层析柱时，带有与离子互换剂可互换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子互换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。
随后用改变pH或离子强度的方法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序前后洗脱下来。
电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
蛋白质混合样品通过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷和分子大小和形状的不同而达到分离。
此刻经常使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），能够因不同蛋白质所带电荷的不同和大小不同高分辨率地分离或分析蛋白质。
在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,能够排除蛋白质所带电荷的不同，组成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最经常使用的方式。
二、依照蛋白质溶解度不同的分离技术蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并前后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的成效。
有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，致使溶解度的降低；还有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在必然浓度的有机溶剂中便沉淀析出。
最近几年来的研究以为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生转变，致使一些原先包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而分离的方式即为有机溶剂沉淀法。
经常使用的有机溶剂有乙醇或丙酮。
蛋白质纯化原理
蛋白质的纯化原理一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。
由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。
一般温度低蛋白质溶介度降低。
但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。
（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。
（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。
因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。
硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。
此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
课题：4.1.1蛋白质的分离与纯化方法
生物成分的分离与测定技术导学案
一、学习目标：
二、知道蛋白质的分离常用的细胞破碎的方法，蛋白质抽提方法，掌握蛋白质的分离与纯化方法。
二、知识构成：
1．蛋白质的分离常用的细胞破碎的方法有：根据蛋白质的不同特性，分别可选择哪些抽提方法？、
、
蛋白质的纯化主要是根据之间以及之间在、、、等方面存在的差异进行的。
常用的方法包括、、等。
2．用电泳分离纯化蛋白质时，泳动速度主要取决于，即。
此外，、等因素对泳动速度也有影响。
3．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的实验的基本步骤包括：、
、、、、、、、、。
4．浸泡醋酸纤维薄膜前，用笔做记号是在(填“光泽面”或“非光泽面”)；点样是在(填“光泽面”或“非光泽面”)；平悬薄膜时，(填“光泽面”或“非光泽面”)朝上。
5．经电泳后，可以在薄膜上看到条色带，它们分别是、
、、、。
'6．植物芳香油的提取方法有和等。
三、学法和自检：本节内容主要通过看书、分析蛋白质的提取、分离、纯化的不同方法。
动手试一试：
[1]盐析法分离蛋白质的原理是( )
A．破坏蛋白质的一级结构B．破坏蛋白质的二级结构
C．破坏蛋白质水化膜而改变溶解度D．使蛋白质发生变性沉淀
[2]利用透析法将蛋白质和其他小分子物质分离的原理是( )
A. 利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性B．利用蛋白质分子的水溶性
C．利用蛋白质分子的胶体性D．利用蛋白质分子所带电荷
[3]．下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的说法不正确的是( )
A．实验所用的巴比妥缓冲液的pH为8．6 B．点样是在薄膜的光泽面上进行的
C．实验后可以得到五条色带D．整个实验最关键的步骤是点样
[4]．有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pH分别为4．5、5．2、6．6、7．2，电泳时欲使其中三种泳向正极，则缓冲液的pH应该是( ) A．2．0 B．5．0 C．6．0 D．7．0
四、、学习小结和课外作业：
1、学习小结：
2、上本作业：列举蛋白质粗提取时次报的破碎、蛋白质的抽提、纯化方法。
3、课本：64页1、2、3、
4、5
4、补充练习：
8．请根据血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验回答下列问题：
(1)实验所用的主要试剂有：
(2)实验所用的缓冲液的pH为，因为。
(3)点样应点在薄膜的面，方法是用在血清中蘸一下，在离薄膜一端cm处
轻轻按下，随即提起。
(4)实施电泳时，所用电压为，膜宽电流强度，时间。
(5)实验结果时，薄膜上呈条色带，分别代表。