Western超详细实验步骤
western实验步骤
制备SDS-PAGE 凝胶(1) 将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。
(2) 配制10%分离胶8ml（见下表），快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
(3) 立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合），室温放置约40min至分离胶凝固。
(4) 配制5%浓缩胶4ml（见下表）。
(5) 倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。
将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约40 分钟。
(6) 轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。
样品变性及电泳(1) 由-80℃冰箱取出提取的组织总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。
(2) 根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，95℃变性10分钟，立即插入冰中待用。
(3) 将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8v/cm）。
电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。
3.4 凝胶转膜及其检测凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。
用于Western 印迹法的固相支持物有多种，本实验采用PVDF膜作为固相支持物。
本实验采用湿转的转膜方式。
(1) PVDF膜的预处理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、电转液依次漂洗2min×2次，置于电转液中备用；(2) 剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。
(3) 取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次。
(4) 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片→3 层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。
Western Blot实验详细步骤
Western Blot实验详细步骤Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h （注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
最详细的Western_Blot过程步骤详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤与问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型与其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
Western blot 实验步骤及其注意事项
Western blot 实验步骤及其注意事项一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
Western超详细实验步骤
Western实验步骤1. 电泳(Electrophoresis)（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
western实验步骤
【实验步骤】1 试剂的配制1.1 30%丙烯酰胺（29:1）的配制（1）称取丙烯酰胺（Acrylamide）29g、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide）1g，置于100ml的烧杯中；（2）向烧杯中加入双蒸水约60ml，充分搅拌溶解，倒入量筒中；（3）加入双蒸水定容至100ml，用0.45μm滤膜滤去杂质；（4）置于棕色瓶中4℃保存，备用。
1.2 电泳缓冲液的配制（1）取Tris 3.0g、甘氨酸14.4g、10%SDS 10ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.3 电转缓冲液的配制（1）取Tris 3g、甘氨酸14.4g、甲醇200ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，然后倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.4 TBST的配制（1）取1M Tris-Cl（PH7.4）20ml、氯化钠8.775g、吐温-20 0.5ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，然后倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制（1）分离胶（12%）的成分（15ml）双蒸水 4.9ml30%丙烯酰胺（29:1）6ml1.5M Tris-Cl（PH8.8） 3.8ml10%SDS 0.15ml10% AP 0.15mlTEMDE 6μl （2）浓缩胶的成分（5ml）双蒸水 3.4ml30%丙烯酰胺（29:1）0.83ml1.0M Tris-Cl（PH6.8）0.63ml10%SDS 0.05ml10% AP 0.05mlTEMDE 5μl1.6显影液的配制将小袋药粉先溶于约50℃适量温水中，完成溶解后再将大袋药粉加入至全溶，按照溶水量冷却至20℃使用。
western试验步骤及注意事项
W estern实验步骤1．制胶及上样：（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。
待胶完全聚合。
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
（5）分别取50µg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5⨯样品缓冲液，以1⨯样品缓冲液？配平上样体积（总体积20µ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
2．电泳（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。
（约30分钟）（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。
（约60分钟）3．转膜（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
4．染色（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
5．封闭把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
6．洗膜与杂交（1）以T-TBS洗膜，10分钟⨯ 3次。
（2）第一抗体封闭：SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
western实验步骤与注意事项
葵花宝典致亲爱的师弟师妹：本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境，师姐在这里把自己所学和资源略写一二。
一、来到实验室，无论你喜欢不喜欢，乐不乐意，一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住，以及实验室里有什么仪器！！！二、关于实验部分1、组织蛋白提取：方法一：（1）4℃下，先生理盐水洗，再加入蛋白提取液，剪刀剪碎，匀质器6000，循环六次，每次都拿下来冰镇，防止蛋白变性，最后14000转，20min，4℃（2）跑western之前，需测BCA，以保证每个组分上样的蛋白总质量一样（此处为定量实验，看目标蛋白的表达量，若仅仅定性则无需做BCA）注意事项：匀质器需要用的小管和玻璃球在郝荣华师姐那里，先加玻璃球一般，目测大概三四毫米高度就行（包括管底小尖尖），且溶液必须装满才振荡效果好，因此，加入细胞裂解液多，容易导致蛋白浓度低。
方法二：（1）取冰（东边实验室，最后面有制冰机）（2）将软骨从﹣80℃冰箱取出，置于冰面上解冻（3）去细胞室的液氮罐里，取出少量液氮置于泡沫箱内，（4）转移至实验室内，取出少量，倒入研钵中，研磨（5）浆糊状，立即转入EP管中，（6）细胞裂解液，2、western blotting（1）抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下.2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系。
一抗来源必须要和二抗搭配,且不能和样本来源相同。
比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学，负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多一般都找得到了（2）β-actin（内参蛋白）分子质量为43KD，因此，目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一致，内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有β-ACTIN，GAPDH等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Western实验步骤
1. 电泳(Electrophoresis)
（1）SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：
1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）
3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面
4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）
注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理
1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀
2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳
1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右
2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）
注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
3.转膜(Transfer)
1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。
2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。
3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序
4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。
5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）
6.转膜，槽放入冰中，槽内放冰槽，设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为40分钟（30-60分钟）。
注意：实验选用PVDF膜但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取，膜不要碰到其他地方特别是手不要碰到膜；动作要轻；赶尽气饱；正负极不要弄错；记录胶的顺序；
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4．封闭
1.转膜完毕后，将蛋白膜放入，TBS漂洗1-2分钟
2.再用TBST封闭，在摇床上摇1小时，装入薄膜内
配制TBS:1MtriHCL (PH8.0) 10ML,1M NaCL 150ml,dd水 840ml；
TBST(MILLK)：5%millk（脱脂奶粉）,0.1%tween20,TBS
注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景；对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
1.切所需蛋白条带后，参考一抗的说明书，按照适当比例用TBST（有奶粉的）稀释一抗。
放置在冰上
2.有薄膜将所需条带封住，立即加入稀释好的一抗后，封口，4℃孵育过夜。
注意：其实室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。
或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
6.二抗孵育(antibody incubation)
1.回收一抗。
2.取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次
注意：如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数，一般洗膜后以MAKER条带背景变淡一些为好。
3.参考二抗的说明书，按照适当比例用TBST(MILLK)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗
4.立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。
5取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数
7.显色和曝光
1.物品准备：显色试剂A、B(A;B=1ml:25ul)，显影液，定影液，保鲜膜，胶片
2.倒掉脱洗液，在曝光盒里铺好保鲜膜；再在皿里将条带铺好（蛋白面朝上），关灯暗室中配好的显色液，加入铺好的膜上（要完全覆盖膜）
3.将蛋白膜铺好在保鲜膜上（要脱掉些显色液），盖上保鲜膜，剪适当大小胶片，曝光，曝光时间分别是15秒、30秒、60、秒
4.曝光后将膜放入显影液中，显影片刻（看到条带出现即可），放入定影液中定影片刻；
5.曝光结束后，清水洗胶片，晾干
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白膜需要再次利用可以使用strippingbuffer处理蛋白膜。
1.将蛋白膜加入stripping buffer 中50°C摇30分钟
2.倒掉stripping buffer,加入新的stripping buffer在25°C（室温即可）摇10分钟
3.再TBST(没有奶粉)摇洗10分钟，共2次
4.封闭，同上4封闭
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
可复制、编制，期待你的好评与关注）。