环氧化物水解酶固定化研究现状
固定化酶的研究进展和应用前景
固定化酶的研究进展和应用前景固定化酶是指将酶固定在固体载体上，并保持其生物活性的一种技术。
它有许多优点，如可重复使用、稳定性高、易于回收等，因此成为了生物技术领域一种非常有前途的研究方向。
一、固定化酶的发展历程固定化酶的概念最早可以追溯到20世纪50年代。
第一种固定化酶的载体是硅胶，随后又发展了许多种载体，如凝胶、海藻酸盐、纳米材料、磁性颗粒等。
随着技术的进步，目前已有各种方法来制备纳米载体和比之前更优异的凝胶载体。
同时，各种固定化酶的制备方法也在不断改进，包括共价结合、吸附、交联、包埋等。
二、固定化酶的应用固定化酶的应用范围非常广泛，包括生物催化、食品工业、医药工业、制药工业等。
其中，固定化酶在食品工业中的应用最为广泛。
如生产葡萄糖、果汁、醋等。
固定化酶也可以用于制药工业中的药品合成。
此外，还可以在纳米技术、环境保护、制垃圾处理等领域中找到应用。
三、固定化酶的优势1. 重复使用：固定化酶具有可重复使用的优势，节省了时间和成本，具有广泛应用前景。
2. 稳定性：与游离酶相比，固定化酶具有较高的稳定性和耐受性，并可在极端环境中保持其生物活性。
3. 易于回收：固定化酶可以设计成可在固定化酶中回收，增加了其经济价值。
四、固定化酶仍需解决的问题尽管固定化酶在许多领域中具有潜力，但仍存在一些问题。
1. 优化载体：优化载体并不是一件容易的事情，其选择需要结合具体的酶种和应用需求，存在一定的技术难度。
2. 降低成本：目前固定化酶的生产成本仍比较高，限制了其在一些领域中的推广。
3. 稳定性问题：目前许多固定化酶在长时间的储存或使用过程中还会出现酶失活的情况，这需要更好的研究与解决。
综合而言，固定化酶的广泛应用前景与其固有的优势是显而易见的。
在未来，我们需要持续关注固定化酶领域的研究与发展，加快技术优化和成本降低，更好地服务于人类的需求。
环氧化物水解酶的研究进展
环氧化物水解酶的研究进展娄文勇;赵莹;彭飞;宗敏华【摘要】环氧化物水解酶可高效率、高选择性地水解环氧化物生成手性邻二醇,对光学活性的邻二醇的合成和光学活性的环氧化物的制备具有重要意义.文章阐述了环氧化物水解酶的作用、来源、结构及其催化机制,进一步综述了环氧化物水解酶催化环氧化物水解、环氧化物水解酶的克隆表达等研究进展.%Epoxide hydrolases can highly and selectively catalyze epoxides to chiral diols, which is an effective way to synthesize chiral diols. This article introduces the structure, functions, sources and mechanism of catalysis of this enzyme. The research on the hydrolyzation of epoxides by epoxide hydrolases, the enzyme cloning and expression in other bacteria are summarized.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(049)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】水解酶;环氧化物;邻二醇;催化【作者】娄文勇;赵莹;彭飞;宗敏华【作者单位】华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640【正文语种】中文【中图分类】Q556.9环氧化物通过选择性开环可以制备具有光学活性的手性醇类化合物及选择性保留具有重要价值的环氧化物. 如作为神经保护药关键性合成子的(R)-4-氯苯基乙二醇可经环氧化物水解酶水解相应的环氧化物制备而得. 与之类似，茚环类环氧化物经环氧化物水解酶催化开环水解也可以制得抗艾滋病药物齐夫而定的重要中间体物质：(1R,2S)-环氧化合物和(1R,2R)-二醇. 环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，在植物、动物、真菌和细菌中均存在环氧化物水解酶，其催化环氧化物水解反应相比化学催化有诸多优点，如选择性高、催化效率高、环境友好等，因此引起了广泛关注. 然而，从自然界筛选的环氧化物水解酶也存在一定的局限，如理论产率不超过50%，底物的耐受性较低，酶提取纯化困难和酶表达量较低等缺点. 针对这些问题，研究人员采用了基因克隆表达及基因突变等技术有效地克服了这些困难.近年来，光学纯的醇、氨基酸、胺、环氧化物和有机酸的制备成为研究的热点，其中手性醇具有重要的应用价值[1]. 1,2-苯乙二醇是一种手性醇，因其烷基链上α位连有4个不同的化学基团而具有一定的旋光性. 目前，像这种具有旋光性的手性醇被广泛用于医药领域、农药领域和材料领域. 光学纯的(S)-1,2-苯乙二醇因具有光学、热学和化学稳定性等特点不仅是液晶材料中重要的添加剂，同时还可以作为农药的中间体；而光学纯的(R)-1,2-苯乙二醇是制备具有光学活性的医用药物的重要中间体，如进一步合成光学活性药物β-肾上腺素阻断剂、(R)-硝基心定、抗心律失常药等[2-4]. (R)-1,2-庚二醇是用于合成铁电液晶材料的γ-内酯的前体[5].(2R,3S)-3-(4-甲氧基苯基)缩水甘油酸酯可用于合成抗癌药物氨肽酶N抑制剂Besattin、Phebetin、Porbestni和MR-387等一系列化合物[6]. (R)-苄基缩水甘油醚用于合成Acetogenins等免疫抑制剂[7].环氧化物是合成手性醇的重要中间体，其立体选择性开环可得到手性环氧化物或手性醇化合物，并用于后续的应用. 目前，环氧化物开环水解成手性醇的反应多集中在化学法和生物法[8]. 化学法常存在诸多不足，因为环氧化物在水中溶解性较差，需要添加有机溶剂，溶剂的消耗量比较大，步骤较繁琐，反应条件较苛刻，产品光学纯度低，而且反应中需要添加有毒的手性催化剂和保护剂[9-10]. 另外，Jacobsen法虽然能水解外消旋环氧化物得到手性邻二醇和手性环氧化物，但其存在底物谱窄、反应条件苛刻、选择性低、产物分离纯化困难和环境污染等问题. 与化学法相比，生物法利用酶或细胞作为催化剂，不仅具有催化效率高、选择性高、反应温和、污染小等优点，而且能够制备一些化学法难以合成的对映体纯的小分子手性邻二醇和手性环氧化物，因而生物法日益受到人们青睐，逐渐成为手性化合物制备的重要手段[11-13].环氧化物水解酶是可以将水分子选择性地加成至环氧环上，从而生成邻二醇类化合物的一种酶[14]，它还可通过水解人体内环氧化物从而降低人体患癌症的几率[15]. 在活细胞中，芳香族和脂肪族的环氧化物均可被环氧化物水解酶水解，获得二醇，取得解毒和信号调节作用.[16-17]. 环氧化物水解酶的来源较为广泛，普遍存在于自然界的生物体中，几乎所检测过的哺乳动物体内都存在环氧化物水解酶. 在土豆、绿豆、黄豆、香蕉及烟草等植物中均发现了该水解酶. 另外，通过对微生物的研究也发现，该酶广泛存在于微生物体内，其主要微生物来源有Agrobacterium radiobacter、Arthrobacter spp.、Aspergillus niger、Bacillus megaterium、Beauveria Sulfurescens、Chryseomonas luteola、Corynebacterium spp.、Mycobacterium paraffinicum、Methylobacterium spp.、Norcadia spp.、Pseudomonas spp.、Rhodococcus erythropolis、Rhodosporidium toluloides、Rhodotorula glutinis、Streptomyces antibioticus、Trichosporon loubierii、Xanthophyllomyces dendrorhous等[18].自HECHTBERGER等[19]报道了利用来源于红球菌的环氧化物水解酶选择性地催化1,2-环氧庚烷不对称水解生成相应的R-二醇后，在水相中不同来源的环氧化物水解酶催化不同结构的环氧化物不对称水解的研究相继出现. 21世纪初，我国的研究人员在产环氧化物水解酶的菌株筛选方面做了大量工作. 曲音波课题组从全国多地收集到的长期被石油、动物油或植物油污染的土壤或水样中分离得到一株产环氧化物水解酶的类产碱假单胞菌，该菌可用于拆分苯基缩水甘油酸乙酯. 研究发现，在添加吐温60的反应体系中，该菌全细胞催化的底物浓度可达78 mmol/L，且产物的光学纯度达98%，但产率较低(33%)[20-21]. 孙万儒课题组从土壤样品中筛选出一株产环氧化物水解酶的黑曲霉菌株[22]，利用该菌株催化外消旋环氧苯乙烷不对称水解，得到(R)-1,2-苯基乙二醇的光学纯度大于99%，但随着反应时间的延长，底物的非酶水解严重，导致产物的光学纯度明显下降[23]. 许建和课题组从土壤中筛选出一株产环氧化物水解酶的巨大芽孢杆菌，该菌具有较高的对映体选择性，可选择水解(R)-缩水甘油苯基醚，对映体选择率E值高达47.8%，可选择性地水解(R)-缩水甘油苯基醚[24]，后期他们还报道了绿豆中存在环氧化物水解酶的事实[25]. 国外同样也对产环氧化物水解酶的菌株进行了筛选研究. DUARAH等[26]从土壤里筛选到一株塔宾曲霉，该菌株具有反应速度快、选择性高等优点，反应45 min可将外消旋的环氧苯乙烷水解成光学纯度达97%的(R)-苯乙二醇，且底物的转化率高达99%. 同时还研究了苯环上的氯取代对反应的影响，结果表明，取代后底物的转化率不受影响，但是产物的光学纯度以及反应时间受到严重影响.目前，已发现的环氧化物水解酶可以分为以下几类：可溶性环氧化物水解酶、微粒体环氧化物水解酶、保幼激素环氧化物水解酶、胆固醇环氧化物水解酶、羟环氧烯酸水解酶、白三烯A4环氧化物水解酶以及柠檬烯环氧化物水解酶7个亚家族[27-29].对比不同来源环氧化物水解酶的蛋白氨基酸序列发现，不同来源酶的氨基酸序列相似程度很高，且基本上都属于α/β折叠型的水解酶[30]，它们具有三位一体的结构[31]，1个电荷中继网和亲核基团共同组成了催化三联体. 活性位点由核心结构和帽子结构组成，核心结构由2个天冬氨酸残基和1个组氨酸残基构成[32-33].目前接受程度较高的催化机理为：先由酶的帽子结构中2个酪氨酸残基将环氧化物中的1个O原子质子化，再经酶的1个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成1个共价结合的中间体，然后落入酶活性中心的1个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的活化，失去1个质子，形成1个羟基，该羟基进而进攻乙二醇-单酯-酶中间体，酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇[33].然而，不同类型和不同来源的环氧化物水解酶的蛋白相对分子质量大小却明显不同，哺乳动物的可溶性环氧化物水解酶是由2个62 kDa单体结构组成的同型二聚体，而来源于植物的可溶性环氧化物水解酶一般以单体或二聚体蛋白的形式存在，其相对分子质量为35 kDa左右[33-34]. 微粒体环氧化物水解酶的相对分子质量约50 kDa[35]，而羟环氧化物烯酸水解酶和白三烯A4环氧化物水解酶的相对分子质量分别为53 kDa和70 kDa.环氧化物水解酶可以高效催化环氧化物水解并生成邻二醇，这也引起了研究人员对该酶催化反应条件的探索. 娄文勇课题组先后研究了来源于绿豆和黄豆的环氧化物水解酶的催化特性[32,36-40]. 在2012年，该课题组陈文静[32]利用从绿豆中提取的环氧化物水解酶催化环氧苯乙烷. 由于环氧苯乙烷在水相中(特别是在高底物浓度情况下)易水解的性质，建立了在磷酸缓冲液体系中，底物浓度为5 mmol/L的绿豆环氧化物水解酶高效催化环氧苯乙烷的反应体系. 在这个体系里，催化终止时可获得(R)-1,2-苯乙二醇的对映体过量率高达92.6%，且产率高达47.6%. 为解决水相体系中催化反应时底物浓度较低的问题，随后研究了在有机溶剂-缓冲液双相反应体系中绿豆环氧化物水解酶催化环氧苯乙烷，选取6种有机溶剂构建双相催化体系，分别是乙酸乙酯、三氯甲烷、环己烷、正己烷、辛烷和癸烷. 采用这6种有机溶剂-缓冲液双相反应体系，利用绿豆环氧化物水解酶催化环氧苯乙烷生成(R)-1，2-苯乙二醇，对比研究了这6种有机溶剂体系中反应的对映体过量率、产率以及有机溶剂对酶活性的影响. 结果表明，乙酸乙酯和三氯甲烷对绿豆环氧化物水解酶的毒性较大，易使酶失活. 进一步研究底物和产物在双相体系的分配系数发现，所选取的有机溶剂对底物都具有较好的萃取效果，反应体系的底物浓度得到了一定程度的提高，表明在所选取的有机溶剂-缓冲液体系中可以有效解除底物对酶的毒性. 综合酶在6种双相反应体系中的催化结果以及底物的分配情况，最终确定正己烷-缓冲液体系为进一步研究的催化反应体系. 经过催化反应条件的优化后，最终底物浓度有效提高4倍，且产率和对映体过量率也有提高，分别为49.2%和94.3%.离子液体作为一种替代有机溶剂的绿色溶剂，具有低毒、难挥发、呈液态的温度范围大、生物相溶性好的特点，在催化领域表现出较好的应用前景. 用疏水性离子液体替代有机溶剂，构成疏水性离子液体-缓冲液双相体系，研究绿豆环氧化物水解酶在此类双相体系中的催化性能. 在所研究的9种疏水性离子液体中，C4MIM·PF6对绿豆环氧化物水解酶的生物相容性最好，可以较好地保留酶的活性，经过处理后，活性仍保留85.5%. 进一步优化该反应体系的反应条件后，所得产物的产率和对映体纯度均有提高，分别为49%和97%，证明离子液体可用于催化体系中提高环氧化物水解酶的催化性能[36]. 进一步研究发现，亲水性离子液体可以促进环氧化物水解酶的活力，其中C2OHMIM·BF4和C2OHMIM·TfO对该酶的毒性较低，且C2OHMIM·BF4能有效提高酶的催化速度[32].酶的固定化技术有利于提高酶的稳定性，固定化酶可以重复使用并容易与反应体系分离，降低了产物的纯化难度. 本课题组于春杨等[37-38]使用戊二醛作交联剂，形成绿豆环氧化物水解酶交联聚体，该酶聚集体的酶活性回收率达到92.5%，且重复使用4次后，仍保留有原始酶活性的85%以上. 进一步研究酶聚集体在正己烷-缓冲液双相体系中催化环氧苯乙烷发现，该酶聚集体的活性明显较游离酶的活性高，大大缩短了催化的时间(由20 h缩短至6 h)，这也说明该种固定化方法能有效提高酶的稳定性. 黄豆也被证实具有环氧化物水解酶，本课题组岳东梅等[39-40]从黄豆中提取出环氧化物水解酶(SEH)，并成功地将其固定在金属有机框架材料UiO-66-NH2中，制备出SEH@UiO-66-NH2固定化酶. 考察在水相缓冲液体系，添加深度共熔溶剂作助溶剂时发现，SEH@UiO-66-NH2在含氯化胆碱：尿素的缓冲液体系中，利用1,2-环氧辛烷作底物可选择性制备(R)-1,2-辛二醇，产率和产物光学纯度可以达到40.29%和80.52%.环氧化物水解酶因其野生菌株表达量较低、菌体培养周期长、或从其它来源提取酶的过程复杂且酶的纯度较低等缺点，不少研究人员将环氧化物水解酶的基因在大肠杆菌中进行克隆表达，以获得高表达环氧化物水解酶的工程菌，并可使工程菌内的目的基因进一步突变，从而得到更高效的环氧化物水解酶. 另外，又因环氧化物水解酶只能高选择性水解对映体中的一种环氧化物，这样会造成产物的理论产率不超过50%的现象. 为了进一步提升产物的产率，研究人员将可以水解不同构型底物但能生成相同构型产物的环氧化物水解酶的基因克隆表达于同一工程菌中，以提高产物的产率，突破理论上产率不超过50%的限制.HWANG等[41]报道了一株产环氧化物水解酶的Caulobacter crescentus菌株，该菌株所产生的环氧化物水解酶能将外消旋的对氯环氧苯乙烷不对称水解成R型的邻二醇，将该环氧化物水解酶的基因克隆表达于其它细胞中，该细胞在产物浓度大于40 mmol/L时，存在较明显的产物抑制作用. 后续又进行了一个制备级的规模实验，在底物质量浓度为16.8 g/L时，催化终止时可获得高纯度、高产率的产物，对映体纯度为95%，产率为72%. 贺婉红[42]对来源于绿豆环氧化物水解酶的基因进行克隆表达，先提取出编码该酶的mRNA，再通过反转录合成cDNA，然后扩增成双链的DNA，将该DNA在大肠杆菌中进行克隆表达，获得了产绿豆环氧化物水解酶的工程菌株，同时评价了该工程菌株产的绿豆环氧化物水解酶的酶学性质. 该酶的米氏常数为2.05 mmol/L，最大反应速率为14.8 μmol/(min·mg). JIN等[43]发现一株Agrobacterium radiobacter菌株，该菌株具有编码环氧化物水解酶的基因，所编码的水解酶能高效且特异性地拆分外消旋3-氯-1,2-环氧丙烷. 通过将该环氧化物水解酶的目的基因成功克隆表达于大肠杆菌，进一步研究了重组工程菌动力学拆分3-氯-1,2-环氧丙烷的性能. 结果表明，重组后的大肠杆菌对3-氯-1,2-环氧丙烷的两种对映体均有较好的水解能力，但由于S构型的对映体对酶的亲和力较强，催化过程会优先水解S型的环氧化物对映体，从而保留R型的环氧化物对映体. 然而，当S型底物被消耗殆尽后，R型的环氧化物水解加快，导致R型底物的产率下降，因此催化时间的控制对该拆分反应尤为重要. 此外，由于底物和产物的抑制作用，当底物浓度为384 mmol/L时，尽管延长反应时间，最终获得的R型3-氯-1,2-环氧丙烷的光学纯度也明显下降. 在所验证的重组菌菌量的范围内，光学纯度不超过61%. 为进一步提升底物浓度，通过分批添加底物和使用双相反应体系来降低底物的抑制作用. 在分批添加底物时，最终添加底物的尝试浓度为448 mmol/L，可获得目标产物的光学纯度超过80%，而在环己烷-缓冲液双相反应体系中，底物的最终添加浓度为512 mmol/L，目标产物的光学纯度大于98%.来源于Bacillus megaterium ECU1001的环氧化物水解酶的结构与其它来源的水解酶的结构相似，均含有α和β结构，且含有1个覆盖活性位点的盖子. KONG 等[44]成功将该菌株的环氧化水解酶的目的基因克隆表达于大肠杆菌，但来源于该野生菌株的环氧化物水解酶的产物释放通道较窄，限制了酶的催化速率. 通过对释放通道附近的氨基酸(如第128位和第145位氨基酸)进行突变，有效拓宽了产物的释放通道，提升了酶的催化速率.环氧化物选择性水解或拆分受限于理论产率不超50%，通过将选择性不同的两种或多种酶克隆表达于1个工程菌中，可有效突破这一限制. KIM等[45]通过将来源于新月柄杆菌和鲻鱼的环氧化物水解酶基因同时克隆表达于大肠杆菌中，从而实现了对外消旋环氧苯乙烷的催化水解，生成R型邻二醇的产率超过50%，产物光学纯度高达94%，且底物浓度较高，达到50 mmol/L. CAO等[46]将来源于土豆和Agrobacterium radiobacter的环氧化物水解酶的基因表达于大肠杆菌中，该菌可将廉价易得的环氧苯乙烷选择性地水解为(R)-1，2-型苯乙二醇，在底物浓度为5 mmol/L时，其转化率高达100%且产物的光学纯度高达98%.环氧化物水解酶的来源广泛，普遍存在于自然界的植物和微生物中，较易获得. 在水相和非水相反应体系中(如：有机溶剂-缓冲液双相体系、含离子液体反应体系等)，环氧化物水解酶均表现出优异的催化选择性，且酶催化三联体结构清晰. 但是，由于环氧化物难溶于水或易水解的性质，限制了该催化反应在水相体系中的应用，而在非水相反应体系中催化环氧化物水解可有效克服这些问题，提升催化的效率. 分子生物学技术的应用促进了环氧化物水解酶的研究进展，其可以用来获得不同来源的环氧化物水解酶，研究酶的酶学性质，以及对自然来源酶的改造，获得更加高效的环氧化物水解酶或重组工程菌.探索绿色且有利于环氧化物溶解的反应介质是建立高效催化环氧化物反应体系的关键一环，深度共熔溶剂也已证明可用于土豆环氧化物水解酶的催化反应，提高酶对底物的选择性，但其它来源的环氧化物水解酶在该类介质中反应的研究并不多. 随着生物技术的发展，利用基因工程技术改造原有的环氧化物水解酶，提升其催化的选择性、活力以及底物的耐受力，也逐渐成为主要发展趋势.【相关文献】[1] 刘荣仕. 树脂原位吸附提高全细胞不对称制备(S)-苯基乙二醇催化效率研究[D]. 无锡:江南大学,2008.[2] JANSSEN A J M,KLUNDER A H,ZWANENBURG B. PPL-catalyzed resolution of 1,2- and 1,3-diols in methyl propionate as solvent. An application of the tandem use of enzymes[J]. Tetrahedron,1992,23(1):7409-7416.[3] KATAOKA M,KITA K,WADA M,et al. Novel bioreduction system for the production of chiral alcohols[J]. 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固定化酶技术及应用的研究进展
固定化酶技术及应用的研究进展一、固定化酶的制备方法研究进展固定化酶的制备方法包括物理吸附、共价键结和交联结构等。
近年来，研究者们发展了一系列新型的固定化酶制备方法，如钙凝胶法、包埋法、凝胶微球法和溶胶凝胶法等。
这些新方法不仅提高了固定化酶的稳定性和活性，还大幅度降低了制备成本，提高了酶的重复使用性。
固定化酶在生物工程领域的应用主要集中在酶催化反应、生物催化剂制备以及生物催化剂的应用等方面。
例如，固定化酶可以用于生物反应器中进行酶催化反应，实现对废水处理、医药合成和食品工业等的高效处理。
此外，固定化酶还可以用于制备各类生物催化剂，如药物微胶囊和生物传感器，用于治疗疾病和检测生物分子。
固定化酶在食品工业中的应用主要包括生产酶制剂、降解保健食品、生产高价值添加物以及改善食品品质等方面。
固定化酶可以用于生产各类酶制剂，如发酵酶、复合酶和水解酶等，以加速酶催化反应。
此外，固定化酶还可以用于生产特殊功能食品，如降解保健食品、胶原蛋白等，以满足不同人群的需求。
固定化酶在医药学领域的应用主要包括药物制剂、生物芯片、药物代谢和生物传感器等方面。
例如，固定化酶可以用于制备缓控释药物制剂，以提高药物的疗效和降低副作用。
此外，固定化酶还可以用于制备生物芯片，用于分析疾病标志物和药物代谢产物等。
固定化酶在环境保护领域的应用主要包括废水处理、大气污染控制和土壤修复等方面。
固定化酶可以用于废水处理中，加速有害物质的降解和去除。
此外，固定化酶还可以用于大气污染控制，将有害气体转化为无害物质。
固定化酶还可以用于土壤修复，加速土壤中有毒物质的降解和去除。
综上所述，固定化酶技术在多个研究领域取得了重要的进展。
通过不断创新和改进固定化酶制备方法，研究者们加强了固定化酶的稳定性和重复使用性，提高了酶的应用效果和利用价值。
固定化酶技术的进一步发展，将为生物工程、食品工业、医药学和环境保护等领域带来更多创新和突破。
酶固定化在污染物降解中的应用
酶固定化在污染物降解中的应用随着工业化进程的加速和城市化进程的扩张，各种污染问题日益突出。
污染物排放导致环境问题的恶化，造成生态破坏和健康影响。
因此，探索一种高效且环保的污染物处理措施变得尤为重要。
酶固定化技术作为一种新型的污染物处理技术，正在逐渐得到人们的关注，并被广泛应用于环保领域。
本文将探讨酶固定化在污染物降解中的应用。
一、酶固定化技术的基本原理酶固定化是将酶固定在载体上，形成一种稳定的酶催化体系，从而提高酶的稳定性和催化效率。
酶固定化技术可以通过吸附、共价键结、交联等多种方式来实现。
通过这种技术，可以使酶催化过程在更广泛的温度和pH范围内进行，并能够重复使用，从而降低成本和提高催化效率。
同时，与传统的化学催化剂相比，酶固定化技术具有更好的环保性和生物相容性。
二、酶固定化在有机污染物降解中的应用有机污染物是大气、水、土壤中最主要的污染源之一。
有机污染物通常具有毒性，难以降解，对环境和人类健康造成严重影响。
酶固定化技术在有机污染物的处理中发挥了重要作用。
（一）酶固定化在有机废水处理中的应用酶固定化技术在有机废水处理中的应用已得到广泛研究。
有机废水中的有机物一般需要进行生物降解，而酶固定化技术能够提高酶的稳定性和反应速率，从而使有机物的降解更加高效。
酶固定化技术还能够降低化学处理的副产品的产生，从而减少了对环境的污染。
例如，近年来一些研究者已经成功地利用酶固定化技术降解苯酚、硝基芳香族化合物、氨基酸以及对环境有害的染料废水等有机污染物。
（二）酶固定化在土壤修复中的应用土壤是生态系统的重要组成部分，但已经受到不同程度的污染。
重金属、有机污染物等会影响土壤质量，从而导致农作物的生长不正常。
酶固定化技术也可以被应用于土壤污染的修复中。
例如，使用酶固定化技术修复重金属污染土壤时，酶催化过程使得污染物降解更加完全和高效。
三、酶固定化技术的前景酶固定化技术被广泛应用于污染物降解中，因此受到了很多研究者和工业界的重视。
酶固定化技术的最新研究进展
西安工程大学学报J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y第38卷第1期(总185期)2024年2月V o l .38,N o .1(S u m.N o .185)引文格式:潘虹,陆天炆,王晓军,等.酶固定化技术的最新研究进展[J ].西安工程大学学报,2024,38(1):83-91.P A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o j u n ,e t a l .R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y [J ].J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,2024,38(1):83-91. 收稿日期:2023-08-06 修回日期:2023-10-21基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2021J Q -672㊁2022J Q -117);陕西省教育厅专项科研计划项目(22J K 0399) 通信作者:潘虹(1988 ),女,讲师,博士,研究方向为固定化酶和多孔水凝胶㊂E -m a i l :441595837@q q.c o m 酶固定化技术的最新研究进展潘 虹,陆天炆,王晓军,洪一楠(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048)摘要 酶作为一种催化性能好且安全可靠的生物催化剂,在食品㊁医药及环境治理等诸多领域得到了广泛应用,但因受限于游离酶较差的环境稳定性而难以实现进一步的工业化应用㊂酶固定化技术有助于提高游离酶对敏感环境的耐受性和操作过程中的稳定性,大大缩减了应用成本㊂回顾了近五年内固定化技术的发展及现状,总结了吸附法㊁结合法等传统固定化方法,共固定化酶法等新型固定化方法,以及天然材料载体㊁复合材料载体和纳米载体等不同固定化载体在各个领域的研究进展㊂相比于游离酶,固定化酶体系在稳定性和重复使用性等方面得到了显著提升,但同时也存在一些不足,如固定后的活性回收率降低㊁载体合成途径繁琐且成本较高以及固定化酶作用机理尚不完善等㊂结合这些不足之处提出了酶固定化技术在未来的发展方向㊂关键词 酶固定化;固定化载体;固定化方法;纳米载体;共固定开放科学(资源服务)标识码(O S I D )中图分类号:Q 814.2 文献标志码:AD O I :10.13338/j .i s s n .1674-649x .2024.01.011R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yP A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o ju n ,H O N G Y i n a n (S c h o o l o f E n v i r o n m e n t a l a n d C h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,X i a n 710048,C h i n a )A b s t r a c t A s a n e f f i c i e n t a n d s a f e b i o c a t a l y s t ,e n z y m e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d i n m a n yf i e l d s s u c h a s f o o d ,m e d i c i n e a n d e n v i r o n m e n t a lg o v e r n a n c e ,b u t i t i s d i f f i c u l t t o r e a l i z e f u r th e ri n d u s t r i a l a p-p l i c a t i o n d u e t o t h e p o o r e n v i r o n m e n t a l s t a b i l i t y o f f r e e e n z y m e s .E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h -n o l o g y h e l p s t o i m p r o v e t h e t o l e r a n c e o f f r e e e n z y m e s t o s e n s i t i v e e n v i r o n m e n t s a n d t h e s t a b i l i t yd u r i n g o pe r a t i o n ,a n d g r e a t l y r e d u c e s t h e a p p l i c a t i o n c o s t .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e d e v e l o pm e n t a n d c u r r e n t s i t u a t i o n o f i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yi n t h e p a s t f i v e y e a r s ,a n d s u mm a r i z e s t h e r e -s e a r c h p r o g r e s s o f d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s(i n c l u d i n g t r a d i t i o n a l i mm o b i l i z a t i o n m e t h-o d s s u c h a s a d s o r p t i o n m e t h o d a n d b i n d i n g m e t h o d a n d n e w i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s s u c h a s c o-i mm o b i l i z a t i o n e n z y m e m e t h o d)a n d i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s(i n c l u d i n g n a t u r a l m a t e r i a l c a r r i e r s, c o m p o s i t e c a r r i e r s a n d n a n o c a r r i e r s)i n v a r i o u s f i e l d s.I n g e n e r a l,c o m p a r e d w i t h f r e e e n z y m e s, t h e i mm o b i l i z e d e n z y m e s y s t e m h a s b e e n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d i n t e r m s o f s t a b i l i t y a n d r e u s-a b i l i t y.H o w e v e r,t h e r e a r e s o m e s h o r t c o m i n g s,s u c h a s l o w e r r e c o v e r y r a t e a f t e r i mm o b i l i z a-t i o n,c u m b e r s o m e a n d c o s t l y c a r r i e r s y n t h e s i s p a t h w a y,a n d i m p e r f e c t m e c h a n i s m o f i mm o b i l i z a-t i o n e n z y m e.F i n a l l y,t h e d e v e l o p m e n t d i r e c t i o n o f t h e t e c h n o l o g y i n t h e f u t u r e w a s p u t f o r w a r d b a s e d o n t h e s e s h o r t c o m i n g s.K e y w o r d s e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n;i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s;i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d;n a n o c a r r i-e r s;c o-i mm o b i l i z a t i o n0引言生物酶是一类具有催化效率高㊁专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质㊂因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]㊂活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]㊂由此,固定化酶的思想被首次提出㊂随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点㊂酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]㊂经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对p H㊁温度㊁重金属离子等影响因素的耐受性㊂同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]㊂目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]㊁生物传感器[8]㊁纺织印染废水处理[9-10]㊁生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展㊂本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用㊂1酶固定化方法酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法㊂表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法㊂表1固定化酶所用固定化方法T a b.1I mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s u s e d i n d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s固定化方法固定化对象载体材料参考文献传统固定化方法吸附法漆酶/α-淀粉酶生物炭/复合晶凝胶[12-13]共价结合法脂肪酶M I L-53(F e)/球形S i O2[14-15]化学交联法漆酶/葡萄糖淀粉酶磁性纳米粒/纳米S i O2[16-19]包埋法漆酶海藻酸铜微球[20]新型固定化方法吸附-交联法脂肪酶/β-葡糖糖苷酶大孔树脂/纳米S i O2[21-22]吸附-包埋法多种酶/纤维素酶多孔淀粉-阿拉伯胶微囊体/仿生S i O2[23-24]交联-包埋法漆酶聚集体介孔S i O2[25]脂肪酶/磷脂酶聚乙烯亚胺[26]共固定法葡萄糖淀粉酶/葡萄糖氧化酶S i O2[27]葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶磁性聚乙二醇微凝胶颗粒[28]1.1传统固定化方法1.1.1吸附法吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键㊁疏水作用和范德华力等相互作用48西安工程大学学报第38卷使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]㊂WA N G等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-M B)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-M B对MG 表现出最大吸附量757.58m g/g,固定化漆酶A/l a c @A-M B对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]㊂A C E T等以沸石颗粒(P P A)为原料,通过简单方法制备了C u2+-A P P a C包埋型复合晶凝胶(C u2+-A P P a C)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7m g/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]㊂1.1.2结合法结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]㊂G H A S E M I等将M I L-53(F e)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和p H值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]㊂此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]㊂F A N等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(C R L),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]㊂但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力㊂1.1.3化学交联法交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(E D C)㊁二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等㊂C H E N等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶F e3O4@S i O2-N H2-L a c,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂㊁金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]㊂Q I U等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]㊂然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响㊂例如,O U Y A N G等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法 京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]㊂与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色㊁安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业㊂D A N I E L L I等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃(D F F)将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]㊂使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,D F F表现出更低的生物毒性㊂1.1.4包埋法包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]㊂这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散㊂但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降㊂例如,L A T I F等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]㊂相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的p H㊁温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%㊂1.2新型固定化方法1.2.1传统固定化方法的改进传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法㊂常见的包括吸附-交联法[21-22]㊁吸附-包埋法[23-24]㊁交联-包埋法[25]等㊂例如,F A T H A L I等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-C L E A)[25]㊂相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和p H稳定性㊂此外E-C L E A存储21d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%㊂对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]㊂1.2.2共固定化酶法共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法㊂A R A N A-P EÑA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]㊂与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势㊂在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于58第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤㊂G A O等制备了一种化学酶级联反应体系(G A&G O x@A u-S i O2),实现葡萄糖淀粉酶(G A)和葡萄糖氧化酶(G O x)共固定化[27]㊂借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸㊂在保证了固定化双酶稳定性的同时,A u的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率㊂类似地,L I U等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定G O x和辣根过氧化物酶(H R P),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]㊂此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用㊂但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]㊂L O U等基于MO F s膜实现了漆酶和介体A B T S的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]㊂2酶固定化载体用于酶固定化的载体主要包括天然载体㊁人工合成载体和纳米载体,见表2㊂在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等㊂表2固定化酶所用载体材料T a b.2 C a r r i e r s f o r i mm o b i l i z e d e n z y m e材料类别载体材料固定化对象固定化方法参考文献天然材料羧甲基纤维素漆酶包埋法[38]琼脂糖脂肪酶吸附法[39]磁性壳聚糖葡萄糖氧化酶共价结合法[40]藻酸盐脱氢酶/蛋白酶吸附法/包埋法[41-42]壳聚糖-黏土复合微球漆酶+介体包埋法[43]海藻酸钠-壳聚糖中性蛋白酶包埋法[44]人工合成材料改性二氧化硅乳酸脱氢酶/碳酸酐酶/甲酸脱氢酶化学交联法/共价结合法[45-47]二氧化钛漆酶吸附法[48]硅酸盐漆酶/葡萄糖氧化酶吸附-共价结合法/吸附法[49-50]氧化铝漆酶共价结合法[51]聚酰胺-胺树枝状大分子脂肪酶化学交联法[52]聚乙烯醇水凝胶-硅胶烯还原酶包埋法[53]二氧化硅-壳聚糖漆酶共价结合法[54]纳米材料磁性纳米粒子漆酶共价结合法[55]金属有机框架MO F s漆酶化学交联法[56]介孔Z I F-8过氧化物酶化学交联法[57]中空微球漆酶吸附法[58]共价有机框架C O F葡萄糖氧化酶+F e3O4吸附法[59]金属酚醛网络M P N酒精脱氢酶吸附法[60]磁性纳米颗粒漆酶+介体A B T S吸附法[61]2.1天然载体材料天然载体最大的优点就是来源广泛㊁低成本和低生物毒性㊂常用的天然载体有纤维素[38]㊁琼脂糖[39]㊁壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等㊂同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力㊂M E H A N D I A[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(C C B-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定㊂微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏㊂同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(P B R S),对纺织废水的脱色率可达78%,C O D㊁B O D以及毒性水平均下降㊂类似地, B A I等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]㊂固定化酶在较宽的p H(5~8)和温度(30~80ħ)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平㊂68西安工程大学学报第38卷2.2人工合成载体材料2.2.1无机材料无机材料来源广泛㊁合成简单㊁机械强度高,可以直接用于酶的固定㊂常见的无机材料有二氧化硅[45]㊁二氧化钛[48]㊁硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等㊂为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化㊂Z H A I等使用聚乙烯亚胺(P E I)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于C O2酶促转化甲酸盐㊂优化后P D A/P E I-S i O2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍㊂再通过固定化碳酸酐酶(C A)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]㊂随后,L I U等同样对S i O2微球进行P E I的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了C O2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]㊂2.2.2高分子材料人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能㊂如聚酰胺㊁聚乙烯醇等具有良好的固定化能力㊂Z H A O等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(P AMAM)接枝到F e3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的F e3O4@S i O2/P AMAM磁性纳米载体[52]㊂固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的p H和温度范围内的耐受性㊂A L A GÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(E R),再固定到氨基官能化的硅胶上㊂包埋后的E R比游离E R的热稳定性高34.4倍㊂在重复使用10次后,固定后的E R仍保持其初始活性的85%[53]㊂2.2.3复合材料针对有机㊁无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体㊂例如,G I R E L L I等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度㊁热稳定性及生物相容性㊂存储30d后仍具有大于70%的相对活性㊂对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和p H范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]㊂2.3纳米材料载体纳米材料凭借其小尺寸㊁高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点㊂各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展㊂2.3.1磁性纳米载体磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料㊂凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出㊂F e3O4是被广泛使用的一种磁性材料㊂但由于纯F e3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化㊂R A N等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体F e3O4@M o S2@P E I 用于漆酶固定㊂在二硫化钼(M o S2)和聚乙烯亚胺(P E I)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120m g/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]㊂2.3.2介孔纳米载体介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体㊂金属有机框架(MO F s)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用㊂L I等采用水热法合成氨基官能化的MO F材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]㊂L U等以酵母为生物模板,将Z I F-8自组装到酵母上得到杂合Y@ Z I F-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@Z I F-8 @t-C A T㊂固定化酶的温度㊁p H耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45d后活性仍保持在99%以上[57]㊂除此以外,T A N G等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-C O F-OM e)[58]㊂这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果㊂2.3.3金属纳米载体金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用㊂F U等将F e3+/F e2+固定到纳米花形的共价有机框架(C O F)中实现了固定化酶的磁分离[59]㊂L I 等研究了以磁性F e3O4为核,将单宁酸(T A)与不同类型金属离子(C u㊁F e㊁Z n㊁M n㊁A u)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(M P N)涂层[60]㊂不同金属离子的不同极化能力对M P N涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率㊁催化活性78第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展和稳定性带来影响㊂对于漆酶而言,引入C u2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]㊂3结论与展望生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解㊁食品加工㊁生物传感器等诸多领域得到了广泛应用㊂酶固定化技术促使酶在较宽的p H值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性㊂但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足㊂1)酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低㊂可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活㊂同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究㊂2)目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面㊂在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术㊂3)酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战㊂同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费㊂如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战㊂因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s)[1]刘茹,焦成瑾,杨玲娟,等.酶固定化研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(5):1861-1869.L I U R,J I A O C J,Y A N G L J,e t a l.A d v a n c e s o f e n-z y m e i mm o b i l i z a t i o n[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t y&Q u a l i t 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酶的固定化研究及其应用
酶的固定化研究及其应用酶是一种高效的生物催化剂，具有广泛的应用前景，但自由酶的使用存在着许多问题，如易失活、难回收、低稳定性等。
为克服这些缺陷，科学家们研究出了酶的固定化技术，即将酶固定在载体上，形成固定化酶。
固定化酶具有多种优点，如稳定性高、重复使用性好、反应率高等，因此被广泛应用于产业、医药等领域，在此进行探讨其固定化研究及应用。
一、固定化酶的分类将酶固定在载体上的方法有很多种，根据载体的不同，固定化酶可分为微生物固定化酶、无机载体固定化酶和有机载体固定化酶三类。
微生物固定化酶，即将酶固定在菌体或细胞内的方法。
这种方法容易操作，且菌体或细胞具有较好的稳定性，能够保护酶的活性。
常见的微生物固定化酶有酵母固定化酶、乳酸菌固定化酶等。
无机载体固定化酶，即将酶固定在无机材料或人工合成材料上的方法。
与微生物固定化酶相比，无机载体的操作难度较大，但无机载体具有很强的机械强度和稳定性，不容易被生物体攻击。
最常用的无机载体为硅胶、氧化铝、氧化锆等。
有机载体固定化酶，即将酶固定在有机高聚物上的方法。
与无机载体相比，有机载体具有更好的生物相容性和更大的比表面积，能够与底物充分接触，提高反应效率。
常用的有机载体有聚乙烯醇、聚丙烯酸、胶原蛋白等。
二、固定化酶的优点1.稳定性高：固定化酶相对于自由酶，在温度、pH值等条件变化时，具有更好的稳定性，不易失活，能够保持较高的催化效率。
2.反应率高：由于固定化酶在载体上固定稳定，不受外界环境的影响，酶底物反应能力更强，反应率更高。
3.反应可重复使用：固定化酶具有独特的再利用性，可以进行多次循环反应，避免了由于自由酶反应后分离难的困扰。
4.反应得率高：固定化酶可以在低酶浓度、低温度、低反应时间下实现高得率反应，提高了反应效率。
三、固定化酶的应用1.食品工业：在食品工业中，利用固定化酶可将大分子物质转化为小分子物质，例如将葡萄糖转化为果糖等，使食品的甜度更适合人们口感，提高了食品品质。
酶催化剂的固定化研究及其在催化反应中的应用
酶催化剂的固定化研究及其在催化反应中的应用1. 综述(1) 酶催化剂固定化的发展现状(2) 固定化的优势(3) 酶催化剂固定化的方法及其特点2. 酶催化剂固定化(1) 酶结合模式①物理结合②化学结合(2) 酶固定化载体①疏水性载体②表面活性剂聚合物③固定化技术3. 酶催化剂固定化的应用(1)酶催化剂固定化在降解有机污染物的应用①土壤改良及降解②水污染物的降解③降解石油污染物(2) 酶催化剂固定化在精细化学合成中的应用①生物催化反应②制药③有机合成④食品工业综述：酶催化剂固定化是将无价钱粒子限定在固定载体某体，有效地避免了酶在体外释放破坏驱动力或反应活性并能保持酶良好的活性。
随着化学反应技术的发展，酶催化剂固定化技术在精细有机合成工业，环境保护和疾病诊断等领域发挥着重要的作用。
固定化技术已经是酶催化领域一项重要的技术，比如现在可以使用固定化的酶在反应量的的低的情况下节约原料，提高反应稳定性，延长反应时间，提高反应效率，改善反应产物的品质等。
把酶固定化会带来众多优势，如简化过程，保持酶催化活性，提高反应选择性，减少酶介质间的杂质、改善酶稳定性、降低酶介质成本及更安全的使用环境等。
酶催化剂固定化可以用两种方式，一是物理结合，其特点是该方法无法有效改善酶催化稳定性，而且酶结合程度低；二是化学结合，它的特点在于既可改善催化稳定性又可结合固定载体，提高结合程度。
酶催化剂固定化已在近年来改善和降解有机污染物，如土壤改良和水污染物的降解，精细化学合成，如生物催化反应、制药、有机合成和食品工业等应用中发挥重要作用。
酶固定化技术的研究进展
酶分子 和交联试剂之 间 ，将不同的材料添加于交联体系 中， 再 加上一些不 同的交联 条件 ， 从而产生 固定 化酶 。交联法往往不 会独立存在 ， 通常作为其他 固定化方法 的辅助手段 。
包埋 法指 的是混 合载体 和酶溶液 ， 加入 一些引发 剂 ， 使 其
体 和固定化酶 ， 稳定性和重复使用性较好 ， 因此 ， 目前应 用 比较
广泛 。 但是 ， 这种方法有着剧烈的反应 ， 会严重损失 固定化酶的
活性 。
２ 新型酶固定化 方法
在 开发新型酶 固定化方法 时 ， 需 要遵循 以下原则 ： 在进 行 酶的固定化时 ， 需要在 比较 温和 的条 件下实现 ， 并且 在酶活 力 损失方面 ， 也需 要最 大限度地减少 ， 甚至避免 。 在制备高活性 固
１ 传统的酶 固定化方法
很 多的高度激发原 子、 分子 和离子等 ， 在 常温下存 在着大量 的
等离子体。等离子体可以自由修饰载体材料表面， 从而实现活
性基 团引入的 目的。Ｐ ｕ ｌ ｅ ｏ等将钛合金 Ｔ ｉ 一 ６ Ａ ｖ表面用丙 烯
传统 的酶 固定化 方法主要包括四个类型 ，分别是吸 附法 、
定化技术 ， 并且得 到了快速 的发展［ 】 】 。 酶 固定化技术指的是采用
离子体等 。ｔ Ｗ Ｃ ｓ 为辐射源 ， 利用射线在尼龙膜表 面共 聚 甲基丙 烯 酸甲酯接枝 ， 进一步活化 ， 就可以 固定青霉 素酚化酶。 光偶联 单 体聚合物包埋 具有光敏基 团载体 的共 价 固定 化酶或者普 通 的固定化酶 ， 在温和 的条件 下实现转 化 ， 因此获得 的 固定化 酶
其是使用 光敏性 和催化活性等等 ； 但是 ， 游离状态的酶对很多物质却有着较差 法是获得具有较高活力 固定化 酶的一种方法 ，
微生物固定化制氢技术的研究现状与展望
微生物固定化制氢技术的研究现状与展望
1. 研究现状
微生物固定化制氢技术是利用细菌从可生物降解的有机物质中
分解氢，从而实现生物工艺制氢的一种技术。
目前，微生物固定化制氢技术伴随着科学的进步，取得了一定的进展。
首先，研究人员已经成功地建立了一系列细菌，获得了多种细菌的生物质氢制备技术，如由放线菌等建立的微生物发酵过程，以及由枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌等建立的基于酸性发酵的系统。
此外，研究人员已经开发了一系列基于催化复合物的新型改性催化剂，能够有效地增加发酵液中的氢气释放。
此外，研究人员也在研究利用细菌聚合酶分解高分子有机物质，如糖，以及利用微生物便携式技术，以提高氢气生成率方面取得了一定的进展。
2. 展望
今后，微生物固定化制氢技术的研究将继续向前发展，可期待的是：
1）逐渐完善基于生物技术的工艺，开发出更高效的微生物固定化氢技术，以便更有效的制氢；
2）发展出可用于大规模工业应用的微生物固定化制氢技术，提高氢气生成率，减少成本，提高投资回报；
3）将微生物固定化制氢技术与其他生物技术相结合，实现可持续发展；
4）研究先进的氢气分离技术，进一步提高氢气的经济性；
5）逐步完善国内外关于微生物固定化制氢技术的管理系统，使之更加完善。
环境工程中固定化酶与固定化微生物的应用初探
环境工程中固定化酶与固定化微生物的应用初探随着环境问题的日益突出，环境工程研究得到了广泛的关注和重视。
固定化酶和固定化微生物是环境工程领域研究的热点之一，具有广泛的应用前景。
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶系统。
相对于游离酶，固定化酶具有更好的稳定性和重复使用性，能够更加高效地催化反应。
固定化酶在环境工程中的应用主要体现在废水处理、空气净化和固废处理等方面。
在废水处理方面，固定化酶可以用于降低废水中有机物的浓度，减少水体的污染。
通过固定化酶系统的使用，可以有效地降低酶的用量，提高酶的利用率，降低废水处理的成本。
固定化酶还可以用于去除废水中的重金属离子，减少对环境的污染。
在空气净化方面，固定化酶可以用于降解空气中的有害气体，提高空气质量。
大气中的甲醛是一种常见的有害物质，可以通过固定化酶的催化作用将其降解为无害物质。
固定化酶还可以用于处理工业废气中的硫化氢、氨气等有害气体，减少工业活动对大气环境的污染。
在废水处理方面，固定化微生物可以用于处理高浓度有机废水，如酒精厂废水、食品厂废水等。
固定化微生物通过附着在载体上，形成微生物聚集体，提供了较大的活性生物膜面积，增强了微生物的代谢能力，提高了废水处理的效率。
在土壤修复方面，固定化微生物可以用于修复污染土壤中的有机物和重金属。
固定化微生物系统能够有效地将重金属离子固定在微生物聚集体上，减少其对土壤的毒害作用。
固定化微生物系统还可以通过代谢有机物，降解土壤中的有机污染物，恢复土壤的自然生物活性。
在油污处理方面，固定化微生物可以通过附着在油水界面上，将油污降解为无害物质。
固定化微生物系统具有较高的油水分离效果和降解效率，能够有效地处理油污。
固定化酶和固定化微生物在环境工程中具有广泛的应用前景。
通过固定化技术，可以提高酶和微生物的稳定性和重复使用性，提高工艺效率，降低成本。
随着研究的深入和技术的不断进步，相信固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用将会得到进一步的拓展和完善。
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环氧化物水解酶固定化研究现状1.环氧化物水解酶/来源环氧化物水解酶(epoxide hydrolase, EH, EC.3.3.2.3)是一种醚水解酶，属于α/β水解酶家族。
该酶可用于催化外消旋环氧化物的对映选择性水解，获得高附加值的手性合成中间体—光学纯的环氧化物或者邻位二醇。
细菌:放射形土壤杆菌Agrobacterium radiobacter,红球菌Rhodococcus sp.,棒状杆菌Corynebacteriuim sp.,分枝杆菌Mycobacterium paranicasm,卡诺氏菌Nocardia sp.，假单胞菌Pseudomonas NRRLB-2994；（Steinreiber, A. et al., 2001；De Vries et al., 2003；Archelas, A. et al., 2001；Orru, R. V. et al., 2001；Faber, K. et al., 1999）真菌：黑曲霉Aspergillus niger, 小麦长蠕孢菌Helminthosporum sativum, 白僵菌Beauveria sulfurescens；（Weijers, C. A. et al., 1999；Kim, H. S. et al., 2006；Yeates, C. A. et al., 2006）酵母菌：粘红酵母Rhodotorulla glutinis; （Kotik, M. et al., 2005）2.固定化EH（酶/细胞）现状2.1吸附法Kroutil等在研究来源于卡诺氏菌环氧化物水解酶固定化过程中，通过对比不同载体固定化酶活力回收发现，环氧化物水解酶吸附于DEAE-cellulose（二乙氨基乙基纤维素）上活力提高2倍以上。
在固定化过程中混入非离子去垢剂（Triton X-100）可显著提高其热稳定性。
(Kroutil et al., 1998)文献阅读过程中发现，利用吸附法固定化环氧化物水解酶研究中大部分都采用了DEAE-cellulose为载体，故列表对比固定化后各参数值。
2.2 共价法—Eupergit C/Eupergit C 250LYildirim等将环氧化物水解酶共价交联于环氧树脂Eupergit C 250L上（图1），使得其对环氧苯乙烯对映体选择性提高2.5倍左右、对环氧丙醇、环氧氯丙烷E均有提高，热稳定性、储藏稳定性亦显著提高（图2），操作稳定性表现为10个批次（活力保留95%、(S)-氧化苯乙烯ee>99% ）。
(Yildirim et al., 2011；Yildirim et al., 2013 ) Mateo等通过将环氧树脂Eupergit C进行改性（图），固定化过程即利用乙二胺或亚氨基二乙酸亲和攻击环氧树脂，接着中性PH下酶与载体共价结合，然后碱性条件下酶分子亲和官能团（氨基、巯基、羟基）与载体上其他环氧基团共价结合，最后添加小分子量的亲和试剂灭活未反应的环氧基团。
(Mateo et al., 2003)通过EDA（乙二胺）改性环氧树脂方法固定化环氧化物水解酶酶活保留均达到95%以上，热稳定性较游离酶有大幅提高，重复利用12批次(S)-氧化苯乙烯ee>99%，酶活未见明显损失。
2.2 吸附共价法—改性环氧硅胶Petri等将硅胶改性表面附带环氧基团后与来源于黑曲霉的环氧化物水解酶进行吸附共价连接，酶活保留达90%，最适T和PH均未变化，拆分2-(对-硝基苯基)环氧乙烷批次可达9次而酶活无显著降低。
研究该固定化酶对助溶剂二甲基亚砜（DMSO）稳定性发现，相比于游离酶，固定化酶在含有20%助溶剂（DMSO）缓冲液中两周后酶活保留达70%以上（图）。
( Petri et al., 2005)2.3 交联法—磁性纳米SiO2颗粒Kim等利用具有船瓶结构的介孔SiO2装配磁性纳米颗粒后将来源于鱼类的环氧化物水解酶共价交联与此纳米酶反应器，该法载体的船瓶结构可有效避免固定化酶的渗漏，磁性颗粒使得固定化酶易重复，热稳定性较游离酶提高10倍以上，拆分氧化苯乙烯重复7个批次（活力保留>50%）(S)-氧化苯乙烯ee>98% 。
(Kim et al., 2013b) Kim等首先利用纳米磁性SiO2及聚苯胺纳米纤维对环氧化物水解酶进行共沉淀，再加入戊二醛进行交联，固定化酶拆分氧化苯乙烯，批次试验可达7次（活力残余40-50%）且ee均大于98%。
(Kim et al., 2013a)2.4 一锅固定化法—Ni-NTA -Fe3O4、NiO/Co(Ⅱ)-SiO2Wang等将氧化铁纳米颗粒与油酸共沉淀后与甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚形成表面附着环氧基团的核壳结构，然后在依次与乙二胺、戊二醛、NTA（氮川三乙酸）衍生物形成席夫碱，最后Ni粒子螯合到NTA臂内，进而可以从粗酶液中一步选择性提取固定化带有His-tag重组酶。
(Wang et al., 2011)2.4 一锅固定化法—Ni-NTA -Fe3O4、NiO/Co(Ⅱ)-SiO2Wang等利用该法固定化环氧化物水解酶拆分2-(对-硝基苯基)环氧乙烷得到ee>99% (R)-2-(对-硝基苯基)环氧乙烷，批次重复8次以上，酶活保留80%以上。
(Wang et al., 2011)Choi 等利用类似的方法（磁性SiO2装配NiO）一步固定化鱼类环氧化物水解酶拆分氧化苯乙烯得到ee>98%(S)-氧化苯乙烯，批次可重复10次以上（酶活保留90%）。
(Choi et al., 2010)Cassimjee等将Wang等方法中用Co(Ⅱ)替代Ni-NTA亦成功实现对环氧化物水解酶的一锅法固定化。
(Cassimjee et al., 2011)2.5 包埋法Maritz等将来源于红冬孢酵母的环氧化物水解酶细胞包埋于海藻酸钙内，活力保留50%，拆分1,2-环氧辛烷可重复操作8个批次（剩余酶活80%）。
(Rhodosporidium et al., 2003)邹等将来源于黑曲霉的环氧化物水解酶重组于大肠杆菌内菌体包埋于海藻酸钙内，酶活保留最高可达82.4%，拆分外消旋的环氧氯丙烷7个批次后酶活残余43%。
(邹树平等，2013)2.6 分子印迹法在有机溶剂（印记溶剂）中，模板分子在交联剂作用下与可聚合功能性单体（如甲基丙烯酸，4-乙烯基吡啶）聚合，当模板分子被取出后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物（大小、形状、化学功能等）具有选择识别特性。
(Gary J. Lye, 1999)Kronenburg等将来源于酵母菌的环氧化物水解酶首先在衣康酸酐作用下进行衍生化，接着在无水环己烷与乙二醇二甲基丙烯酸酯进行共聚合形成生物塑料，在共聚之前，蛋白酶分子在水相中经模板分子（底物）进行分子印迹。
该报道是首次将分子印迹技术应用于隶属于α/β水解酶家族的环氧化物水解酶。
(Kronenburg et al., 2001) 研究发现，经不同构型底物（S型、R型）印记后酶对1,2-环氧辛烷的对映体选择性（E）发生明显变化，甚至颠倒。
对不同构型1,2-环氧辛烷相对活力变化显著。
将环氧化物水解酶与共聚体吸附固定化后发现，相较于游离酶半衰期最高提高15倍，且经强酸（HCl）洗脱后仍可保留50%酶活，游离酶在此情况下瞬间失活。
3.小结及展望现阶段固定化环氧化物水解酶距离工业化固定化酶（如卡拉胶包埋腈水解酶重复批次达200批）尚有很大差距；对比发现EH固定化研究集中在环氧树脂Eupergit 、DEAE-cellulose及磁性纳米SiO2颗粒三种载体；现阶段文献研究多为环氧化物水解酶固定化酶，固定化细胞报道不多；未见有固定化酶后进行填充床生物反应器连续操作拆分制备手性环氧化物的报道；寻找筛选成功工业化应用固定化酶/细胞方法值得借鉴。
参考文献：Cassimjee, K.E., Kourist, R., Lindberg, D., Wittrup Larsen, M., Thanh, N.H.,Widersten, M., Bornscheuer, U.T., Berglund, P., 2011. One-step enzyme extraction and immobilization for biocatalysis applications. Biotechnol J 6, 463-469.Choi, S.H., Kim, H.S., Lee, I.S., Lee, E.Y., 2010. Functional expression and magnetic nanoparticle-based Immobilization of a protein-engineered marine fish epoxide hydrolase of Mugil cephalus for enantioselective hydrolysis of racemic styrene oxide. Biotechnol Lett 32, 1685-1691.Devi, A.V., Lahari, C., Swarnalatha, L., Fadnavis, N.W., 2008. Gelozymes in organic synthesis. Part IV: Resolution of glycidate esters with crude Mung bean (Phaseolus radiatus) epoxide hydrolase immobilized in gelatin matrix. Tetrahedron: Asymmetry 19, 1139-1144.Grulich, M., Maršálek, J., Kyslík, P., Štěpánek, V., Kotik, M., 2011. Production, enrichment and immobilization of a metagenome-derived epoxide hydrolase. Process Biochem 46, 526-532.Karboune, S., Amourache, L., Nellaiah, H., Morisseau, C., Baratti, J., 2001. Immobilization of the epoxide hydrolase from Aspergillus niger. Biotechnol Lett 23, 1633-1639.Karboune, S., Archelas, A., Baratti, J.C., 2010. Free and immobilized Aspergillus niger epoxide hydrolase-catalyzed hydrolytic kinetic resolution of racemic p-chlorostyrene oxide in a neat organic solvent medium. Process Biochem 45, 210-216.Karboune, S., Archelas, A., Furstoss, R., Baratti, J., 2005. Immobilization of epoxide hydrolase from Aspergillus niger onto DEAE-cellulose: enzymatic properties and application for the enantioselective resolution of a racemic epoxide. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 32, 175-183.Mateo, C., Archelas, A., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.M., Furstoss, R., 2003. Enzymatic transformations. Immobilized A-niger epoxide hydrolase as a novel biocatalytic tool for repeated-batch hydrolytic kinetic resolution of epoxides. Org Biomol Chem 1, 2739-2743.Mateo, C., Fernandez-Lafuente, R., Archelas, A., Guisan, J.M., Furstoss, R., 2007. Preparation of a very stable immobilized Solanum tuberosum epoxide hydrolase. Tetrahedron: Asymmetry 18, 1233-1238.Petri, A., Marconcini, P., Salvadori, P., 2005. Efficient immobilization of epoxide hydrolase onto silica gel and use in the enantioselective hydrolysis of racemic para-nitrostyrene oxide. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 32, 219-224. Wang, W., Wang, D.I., Li, Z., 2011. Facile fabrication of recyclable and active nanobiocatalyst: purification and immobilization of enzyme in one pot with Ni-NTA functionalized magnetic nanoparticle. Chem Commun (Camb) 47, 8115-8117.邹树平，颜海蔚，胡忠策，郑裕国.固定化重组大肠杆菌细胞催化合成(R)-环氧氯丙烷[J].现代化工，2010,33(7):55-59.Yildirim, D., Tükel, S.S., Alptekin, Ö., Alagöz, D., 2013. Immobilized Aspergillus niger epoxide hydrolases: Cost-effective biocatalysts for the prepation of enantiopure styrene oxide, propylene oxide and epichlorohydrin. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 88, 84-90.Yildirim, D., Tukel, S.S., Alagoz, D., Alptekin, O., 2011. Preparative-scale kineticresolution of racemic styrene oxide by immobilized epoxide hydrolase. Enzyme Microb Technol 49, 555-559.Kim, Y.H., Lee, I., Choi, S.H., Lee, O.K., Kim, J., Lee, E.Y., 2013a. Nanoimmobilization of Marine Epoxide Hydrolase of <I>Mugil cephalus</I> for Repetitive Enantioselective Resolution of Racemic Styrene Oxide in Aqueous Buffer. J Nanosci Nanotechno 13, 2266-2271.Kim, Y.H., Lee, I., Choi, S.H., Lee, O.K., Shim, J., Lee, J., Kim, J., Lee, E.Y., 2013b. Enhanced stability and reusability of marine epoxide hydrolase using ship-in-a-bottle approach with magnetically-separable mesoporous silica. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 89, 48-51.Kronenburg, N.A.E., de Bont, J.A.M., Fischer, L., 2001. Improvement of enantioselectivity by immobilized imprinting of epoxide hydrolase from Rhodotorula glutinis. J Mol Catal B-Enzym 16, 121-129.贾涛，许建和，何晟.巨大芽孢杆菌环氧水解酶的固定化及其催化性能[J].催化学报，2008,29(1):47-51.Kroutil, W., Orru, R.V.A., Faber, K., 1998. Stabilization of Nocardia EH1 epoxide hydrolase by immobilization. Biotechnol Lett 20, 373-377.Lee, E.Y., Shuler, M.L., 2007. Molecular engineering of epoxide hydrolase and its application to asymmetric and enantioconvergent hydrolysis. Biotechnol Bioeng 98, 318-327.Maritz, J., Krieg, H.M., Yeates, C.A., Botes, A.L., Breytenbach, J.C., 2003. Calcium alginate entrapment of the yeast Rhodosporidium toruloides for the kinetic resolution of 1,2-epoxyoctane. Biotechnol Lett 25, 1775-1781.。