环氧化物水解酶介导的对映会聚水解及其应用

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可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU改善阿尔茨海默病的作用和机制

可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU改善阿尔茨海默病的作用和机制陈庆状;高峰;关燕菲;胡莹莹;陈春玲;樊铁浒;肖晓丹【期刊名称】《中国老年学杂志》【年(卷),期】2024(44)3【摘要】目的利用小鼠模型探讨新型可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂(TPPU)改善阿尔茨海默病(AD)的分子机制。

方法将5xFAD转基因小鼠随机分为WT溶剂组、5xFAD溶剂组和5xFAD-TPPU干预,5xFAD-TPPU干预组每日腹腔注射1.5 mg/kg体质量TPPU,连续注射8 w。

免疫荧光染色观察β淀粉样蛋白水平和小胶质细胞活化。

Y迷宫检测小鼠认知功能。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测白细胞介素(IL)-6、IL-β和肿瘤坏死因子(TNF)-α三种炎症因子mRNA水平。

高效液相和质谱联用技术检测环氧四烯酸(EETs)水平。

Western印迹检测给药前后Toll样受体(TLR)2及其下游信号分子表达。

结果外源性给予TPPU可显著抑制小胶质细胞的活化和炎症因子的释放,并且能够改善AD小鼠病理症状。

与WT溶剂组相比,5xFAD溶剂组TLR2相关信号通路异常,给予TPPU后,可有效抑制TLR2信号通路的激活。

结论 sEH抑制剂TPPU可能通过TLR2信号通路抑制小胶质细胞的过度激活,从而改善AD的病理症状。

【总页数】5页(P653-657)【作者】陈庆状;高峰;关燕菲;胡莹莹;陈春玲;樊铁浒;肖晓丹【作者单位】广东医科大学;广州市中西医结合医院【正文语种】中文【中图分类】R749.16【相关文献】1.可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU对大鼠局灶脑缺血后血脑屏障的保护作用2.可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU治疗周围神经痛效果研究3.可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU促进低灌注脑白质损伤后髓鞘再生的相关机制4.可溶性环氧化物水解酶抑制剂对小鼠内皮祖细胞分泌血管内皮生长因子及缺氧诱导因子-1α的促进作用5.新型可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU对缺血性脑卒中的保护机制因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

环氧化物水解酶的研究进展

环氧化物水解酶的研究进展娄文勇;赵莹;彭飞;宗敏华【摘要】环氧化物水解酶可高效率、高选择性地水解环氧化物生成手性邻二醇,对光学活性的邻二醇的合成和光学活性的环氧化物的制备具有重要意义.文章阐述了环氧化物水解酶的作用、来源、结构及其催化机制,进一步综述了环氧化物水解酶催化环氧化物水解、环氧化物水解酶的克隆表达等研究进展.%Epoxide hydrolases can highly and selectively catalyze epoxides to chiral diols, which is an effective way to synthesize chiral diols. This article introduces the structure, functions, sources and mechanism of catalysis of this enzyme. The research on the hydrolyzation of epoxides by epoxide hydrolases, the enzyme cloning and expression in other bacteria are summarized.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(049)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】水解酶;环氧化物;邻二醇;催化【作者】娄文勇;赵莹;彭飞;宗敏华【作者单位】华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,应用生物催化实验室,广州510640;华南理工大学,广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广州510640【正文语种】中文【中图分类】Q556.9环氧化物通过选择性开环可以制备具有光学活性的手性醇类化合物及选择性保留具有重要价值的环氧化物. 如作为神经保护药关键性合成子的(R)-4-氯苯基乙二醇可经环氧化物水解酶水解相应的环氧化物制备而得. 与之类似，茚环类环氧化物经环氧化物水解酶催化开环水解也可以制得抗艾滋病药物齐夫而定的重要中间体物质：(1R,2S)-环氧化合物和(1R,2R)-二醇. 环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，在植物、动物、真菌和细菌中均存在环氧化物水解酶，其催化环氧化物水解反应相比化学催化有诸多优点，如选择性高、催化效率高、环境友好等，因此引起了广泛关注. 然而，从自然界筛选的环氧化物水解酶也存在一定的局限，如理论产率不超过50%，底物的耐受性较低，酶提取纯化困难和酶表达量较低等缺点. 针对这些问题，研究人员采用了基因克隆表达及基因突变等技术有效地克服了这些困难.近年来，光学纯的醇、氨基酸、胺、环氧化物和有机酸的制备成为研究的热点，其中手性醇具有重要的应用价值[1]. 1,2-苯乙二醇是一种手性醇，因其烷基链上α位连有4个不同的化学基团而具有一定的旋光性. 目前，像这种具有旋光性的手性醇被广泛用于医药领域、农药领域和材料领域. 光学纯的(S)-1,2-苯乙二醇因具有光学、热学和化学稳定性等特点不仅是液晶材料中重要的添加剂，同时还可以作为农药的中间体；而光学纯的(R)-1,2-苯乙二醇是制备具有光学活性的医用药物的重要中间体，如进一步合成光学活性药物β-肾上腺素阻断剂、(R)-硝基心定、抗心律失常药等[2-4]. (R)-1,2-庚二醇是用于合成铁电液晶材料的γ-内酯的前体[5].(2R,3S)-3-(4-甲氧基苯基)缩水甘油酸酯可用于合成抗癌药物氨肽酶N抑制剂Besattin、Phebetin、Porbestni和MR-387等一系列化合物[6]. (R)-苄基缩水甘油醚用于合成Acetogenins等免疫抑制剂[7].环氧化物是合成手性醇的重要中间体，其立体选择性开环可得到手性环氧化物或手性醇化合物，并用于后续的应用. 目前，环氧化物开环水解成手性醇的反应多集中在化学法和生物法[8]. 化学法常存在诸多不足，因为环氧化物在水中溶解性较差，需要添加有机溶剂，溶剂的消耗量比较大，步骤较繁琐，反应条件较苛刻，产品光学纯度低，而且反应中需要添加有毒的手性催化剂和保护剂[9-10]. 另外，Jacobsen法虽然能水解外消旋环氧化物得到手性邻二醇和手性环氧化物，但其存在底物谱窄、反应条件苛刻、选择性低、产物分离纯化困难和环境污染等问题. 与化学法相比，生物法利用酶或细胞作为催化剂，不仅具有催化效率高、选择性高、反应温和、污染小等优点，而且能够制备一些化学法难以合成的对映体纯的小分子手性邻二醇和手性环氧化物，因而生物法日益受到人们青睐，逐渐成为手性化合物制备的重要手段[11-13].环氧化物水解酶是可以将水分子选择性地加成至环氧环上，从而生成邻二醇类化合物的一种酶[14]，它还可通过水解人体内环氧化物从而降低人体患癌症的几率[15]. 在活细胞中，芳香族和脂肪族的环氧化物均可被环氧化物水解酶水解，获得二醇，取得解毒和信号调节作用.[16-17]. 环氧化物水解酶的来源较为广泛，普遍存在于自然界的生物体中，几乎所检测过的哺乳动物体内都存在环氧化物水解酶. 在土豆、绿豆、黄豆、香蕉及烟草等植物中均发现了该水解酶. 另外，通过对微生物的研究也发现，该酶广泛存在于微生物体内，其主要微生物来源有Agrobacterium radiobacter、Arthrobacter spp.、Aspergillus niger、Bacillus megaterium、Beauveria Sulfurescens、Chryseomonas luteola、Corynebacterium spp.、Mycobacterium paraffinicum、Methylobacterium spp.、Norcadia spp.、Pseudomonas spp.、Rhodococcus erythropolis、Rhodosporidium toluloides、Rhodotorula glutinis、Streptomyces antibioticus、Trichosporon loubierii、Xanthophyllomyces dendrorhous等[18].自HECHTBERGER等[19]报道了利用来源于红球菌的环氧化物水解酶选择性地催化1,2-环氧庚烷不对称水解生成相应的R-二醇后，在水相中不同来源的环氧化物水解酶催化不同结构的环氧化物不对称水解的研究相继出现. 21世纪初，我国的研究人员在产环氧化物水解酶的菌株筛选方面做了大量工作. 曲音波课题组从全国多地收集到的长期被石油、动物油或植物油污染的土壤或水样中分离得到一株产环氧化物水解酶的类产碱假单胞菌，该菌可用于拆分苯基缩水甘油酸乙酯. 研究发现，在添加吐温60的反应体系中，该菌全细胞催化的底物浓度可达78 mmol/L，且产物的光学纯度达98%，但产率较低(33%)[20-21]. 孙万儒课题组从土壤样品中筛选出一株产环氧化物水解酶的黑曲霉菌株[22]，利用该菌株催化外消旋环氧苯乙烷不对称水解，得到(R)-1,2-苯基乙二醇的光学纯度大于99%，但随着反应时间的延长，底物的非酶水解严重，导致产物的光学纯度明显下降[23]. 许建和课题组从土壤中筛选出一株产环氧化物水解酶的巨大芽孢杆菌，该菌具有较高的对映体选择性，可选择水解(R)-缩水甘油苯基醚，对映体选择率E值高达47.8%，可选择性地水解(R)-缩水甘油苯基醚[24]，后期他们还报道了绿豆中存在环氧化物水解酶的事实[25]. 国外同样也对产环氧化物水解酶的菌株进行了筛选研究. DUARAH等[26]从土壤里筛选到一株塔宾曲霉，该菌株具有反应速度快、选择性高等优点，反应45 min可将外消旋的环氧苯乙烷水解成光学纯度达97%的(R)-苯乙二醇，且底物的转化率高达99%. 同时还研究了苯环上的氯取代对反应的影响，结果表明，取代后底物的转化率不受影响，但是产物的光学纯度以及反应时间受到严重影响.目前，已发现的环氧化物水解酶可以分为以下几类：可溶性环氧化物水解酶、微粒体环氧化物水解酶、保幼激素环氧化物水解酶、胆固醇环氧化物水解酶、羟环氧烯酸水解酶、白三烯A4环氧化物水解酶以及柠檬烯环氧化物水解酶7个亚家族[27-29].对比不同来源环氧化物水解酶的蛋白氨基酸序列发现，不同来源酶的氨基酸序列相似程度很高，且基本上都属于α/β折叠型的水解酶[30]，它们具有三位一体的结构[31]，1个电荷中继网和亲核基团共同组成了催化三联体. 活性位点由核心结构和帽子结构组成，核心结构由2个天冬氨酸残基和1个组氨酸残基构成[32-33].目前接受程度较高的催化机理为：先由酶的帽子结构中2个酪氨酸残基将环氧化物中的1个O原子质子化，再经酶的1个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成1个共价结合的中间体，然后落入酶活性中心的1个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的活化，失去1个质子，形成1个羟基，该羟基进而进攻乙二醇-单酯-酶中间体，酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇[33].然而，不同类型和不同来源的环氧化物水解酶的蛋白相对分子质量大小却明显不同，哺乳动物的可溶性环氧化物水解酶是由2个62 kDa单体结构组成的同型二聚体，而来源于植物的可溶性环氧化物水解酶一般以单体或二聚体蛋白的形式存在，其相对分子质量为35 kDa左右[33-34]. 微粒体环氧化物水解酶的相对分子质量约50 kDa[35]，而羟环氧化物烯酸水解酶和白三烯A4环氧化物水解酶的相对分子质量分别为53 kDa和70 kDa.环氧化物水解酶可以高效催化环氧化物水解并生成邻二醇，这也引起了研究人员对该酶催化反应条件的探索. 娄文勇课题组先后研究了来源于绿豆和黄豆的环氧化物水解酶的催化特性[32,36-40]. 在2012年，该课题组陈文静[32]利用从绿豆中提取的环氧化物水解酶催化环氧苯乙烷. 由于环氧苯乙烷在水相中(特别是在高底物浓度情况下)易水解的性质，建立了在磷酸缓冲液体系中，底物浓度为5 mmol/L的绿豆环氧化物水解酶高效催化环氧苯乙烷的反应体系. 在这个体系里，催化终止时可获得(R)-1,2-苯乙二醇的对映体过量率高达92.6%，且产率高达47.6%. 为解决水相体系中催化反应时底物浓度较低的问题，随后研究了在有机溶剂-缓冲液双相反应体系中绿豆环氧化物水解酶催化环氧苯乙烷，选取6种有机溶剂构建双相催化体系，分别是乙酸乙酯、三氯甲烷、环己烷、正己烷、辛烷和癸烷. 采用这6种有机溶剂-缓冲液双相反应体系，利用绿豆环氧化物水解酶催化环氧苯乙烷生成(R)-1，2-苯乙二醇，对比研究了这6种有机溶剂体系中反应的对映体过量率、产率以及有机溶剂对酶活性的影响. 结果表明，乙酸乙酯和三氯甲烷对绿豆环氧化物水解酶的毒性较大，易使酶失活. 进一步研究底物和产物在双相体系的分配系数发现，所选取的有机溶剂对底物都具有较好的萃取效果，反应体系的底物浓度得到了一定程度的提高，表明在所选取的有机溶剂-缓冲液体系中可以有效解除底物对酶的毒性. 综合酶在6种双相反应体系中的催化结果以及底物的分配情况，最终确定正己烷-缓冲液体系为进一步研究的催化反应体系. 经过催化反应条件的优化后，最终底物浓度有效提高4倍，且产率和对映体过量率也有提高，分别为49.2%和94.3%.离子液体作为一种替代有机溶剂的绿色溶剂，具有低毒、难挥发、呈液态的温度范围大、生物相溶性好的特点，在催化领域表现出较好的应用前景. 用疏水性离子液体替代有机溶剂，构成疏水性离子液体-缓冲液双相体系，研究绿豆环氧化物水解酶在此类双相体系中的催化性能. 在所研究的9种疏水性离子液体中，C4MIM·PF6对绿豆环氧化物水解酶的生物相容性最好，可以较好地保留酶的活性，经过处理后，活性仍保留85.5%. 进一步优化该反应体系的反应条件后，所得产物的产率和对映体纯度均有提高，分别为49%和97%，证明离子液体可用于催化体系中提高环氧化物水解酶的催化性能[36]. 进一步研究发现，亲水性离子液体可以促进环氧化物水解酶的活力，其中C2OHMIM·BF4和C2OHMIM·TfO对该酶的毒性较低，且C2OHMIM·BF4能有效提高酶的催化速度[32].酶的固定化技术有利于提高酶的稳定性，固定化酶可以重复使用并容易与反应体系分离，降低了产物的纯化难度. 本课题组于春杨等[37-38]使用戊二醛作交联剂，形成绿豆环氧化物水解酶交联聚体，该酶聚集体的酶活性回收率达到92.5%，且重复使用4次后，仍保留有原始酶活性的85%以上. 进一步研究酶聚集体在正己烷-缓冲液双相体系中催化环氧苯乙烷发现，该酶聚集体的活性明显较游离酶的活性高，大大缩短了催化的时间(由20 h缩短至6 h)，这也说明该种固定化方法能有效提高酶的稳定性. 黄豆也被证实具有环氧化物水解酶，本课题组岳东梅等[39-40]从黄豆中提取出环氧化物水解酶(SEH)，并成功地将其固定在金属有机框架材料UiO-66-NH2中，制备出SEH@UiO-66-NH2固定化酶. 考察在水相缓冲液体系，添加深度共熔溶剂作助溶剂时发现，SEH@UiO-66-NH2在含氯化胆碱：尿素的缓冲液体系中，利用1,2-环氧辛烷作底物可选择性制备(R)-1,2-辛二醇，产率和产物光学纯度可以达到40.29%和80.52%.环氧化物水解酶因其野生菌株表达量较低、菌体培养周期长、或从其它来源提取酶的过程复杂且酶的纯度较低等缺点，不少研究人员将环氧化物水解酶的基因在大肠杆菌中进行克隆表达，以获得高表达环氧化物水解酶的工程菌，并可使工程菌内的目的基因进一步突变，从而得到更高效的环氧化物水解酶. 另外，又因环氧化物水解酶只能高选择性水解对映体中的一种环氧化物，这样会造成产物的理论产率不超过50%的现象. 为了进一步提升产物的产率，研究人员将可以水解不同构型底物但能生成相同构型产物的环氧化物水解酶的基因克隆表达于同一工程菌中，以提高产物的产率，突破理论上产率不超过50%的限制.HWANG等[41]报道了一株产环氧化物水解酶的Caulobacter crescentus菌株，该菌株所产生的环氧化物水解酶能将外消旋的对氯环氧苯乙烷不对称水解成R型的邻二醇，将该环氧化物水解酶的基因克隆表达于其它细胞中，该细胞在产物浓度大于40 mmol/L时，存在较明显的产物抑制作用. 后续又进行了一个制备级的规模实验，在底物质量浓度为16.8 g/L时，催化终止时可获得高纯度、高产率的产物，对映体纯度为95%，产率为72%. 贺婉红[42]对来源于绿豆环氧化物水解酶的基因进行克隆表达，先提取出编码该酶的mRNA，再通过反转录合成cDNA，然后扩增成双链的DNA，将该DNA在大肠杆菌中进行克隆表达，获得了产绿豆环氧化物水解酶的工程菌株，同时评价了该工程菌株产的绿豆环氧化物水解酶的酶学性质. 该酶的米氏常数为2.05 mmol/L，最大反应速率为14.8 μmol/(min·mg). JIN等[43]发现一株Agrobacterium radiobacter菌株，该菌株具有编码环氧化物水解酶的基因，所编码的水解酶能高效且特异性地拆分外消旋3-氯-1,2-环氧丙烷. 通过将该环氧化物水解酶的目的基因成功克隆表达于大肠杆菌，进一步研究了重组工程菌动力学拆分3-氯-1,2-环氧丙烷的性能. 结果表明，重组后的大肠杆菌对3-氯-1,2-环氧丙烷的两种对映体均有较好的水解能力，但由于S构型的对映体对酶的亲和力较强，催化过程会优先水解S型的环氧化物对映体，从而保留R型的环氧化物对映体. 然而，当S型底物被消耗殆尽后，R型的环氧化物水解加快，导致R型底物的产率下降，因此催化时间的控制对该拆分反应尤为重要. 此外，由于底物和产物的抑制作用，当底物浓度为384 mmol/L时，尽管延长反应时间，最终获得的R型3-氯-1,2-环氧丙烷的光学纯度也明显下降. 在所验证的重组菌菌量的范围内，光学纯度不超过61%. 为进一步提升底物浓度，通过分批添加底物和使用双相反应体系来降低底物的抑制作用. 在分批添加底物时，最终添加底物的尝试浓度为448 mmol/L，可获得目标产物的光学纯度超过80%，而在环己烷-缓冲液双相反应体系中，底物的最终添加浓度为512 mmol/L，目标产物的光学纯度大于98%.来源于Bacillus megaterium ECU1001的环氧化物水解酶的结构与其它来源的水解酶的结构相似，均含有α和β结构，且含有1个覆盖活性位点的盖子. KONG 等[44]成功将该菌株的环氧化水解酶的目的基因克隆表达于大肠杆菌，但来源于该野生菌株的环氧化物水解酶的产物释放通道较窄，限制了酶的催化速率. 通过对释放通道附近的氨基酸(如第128位和第145位氨基酸)进行突变，有效拓宽了产物的释放通道，提升了酶的催化速率.环氧化物选择性水解或拆分受限于理论产率不超50%，通过将选择性不同的两种或多种酶克隆表达于1个工程菌中，可有效突破这一限制. KIM等[45]通过将来源于新月柄杆菌和鲻鱼的环氧化物水解酶基因同时克隆表达于大肠杆菌中，从而实现了对外消旋环氧苯乙烷的催化水解，生成R型邻二醇的产率超过50%，产物光学纯度高达94%，且底物浓度较高，达到50 mmol/L. CAO等[46]将来源于土豆和Agrobacterium radiobacter的环氧化物水解酶的基因表达于大肠杆菌中，该菌可将廉价易得的环氧苯乙烷选择性地水解为(R)-1，2-型苯乙二醇，在底物浓度为5 mmol/L时，其转化率高达100%且产物的光学纯度高达98%.环氧化物水解酶的来源广泛，普遍存在于自然界的植物和微生物中，较易获得. 在水相和非水相反应体系中(如：有机溶剂-缓冲液双相体系、含离子液体反应体系等)，环氧化物水解酶均表现出优异的催化选择性，且酶催化三联体结构清晰. 但是，由于环氧化物难溶于水或易水解的性质，限制了该催化反应在水相体系中的应用，而在非水相反应体系中催化环氧化物水解可有效克服这些问题，提升催化的效率. 分子生物学技术的应用促进了环氧化物水解酶的研究进展，其可以用来获得不同来源的环氧化物水解酶，研究酶的酶学性质，以及对自然来源酶的改造，获得更加高效的环氧化物水解酶或重组工程菌.探索绿色且有利于环氧化物溶解的反应介质是建立高效催化环氧化物反应体系的关键一环，深度共熔溶剂也已证明可用于土豆环氧化物水解酶的催化反应，提高酶对底物的选择性，但其它来源的环氧化物水解酶在该类介质中反应的研究并不多. 随着生物技术的发展，利用基因工程技术改造原有的环氧化物水解酶，提升其催化的选择性、活力以及底物的耐受力，也逐渐成为主要发展趋势.【相关文献】[1] 刘荣仕. 树脂原位吸附提高全细胞不对称制备(S)-苯基乙二醇催化效率研究[D]. 无锡:江南大学,2008.[2] JANSSEN A J M,KLUNDER A H,ZWANENBURG B. PPL-catalyzed resolution of 1,2- and 1,3-diols in methyl propionate as solvent. An application of the tandem use of enzymes[J]. Tetrahedron,1992,23(1):7409-7416.[3] KATAOKA M,KITA K,WADA M,et al. Novel bioreduction system for the production of chiral alcohols[J]. 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一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(R)

专利名称：一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(R)‑苯乙二醇的方法
专利类型：发明专利
发明人：邬敏辰,王瑞,胡蝶,李闯,宗讯成,李剑芳
申请号：CN201610926649.5
申请日：20161031
公开号：CN106244637A
公开日：
20161221
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(R)‑苯乙二醇的方法，属于生物催化技术领域。

本发明以外消旋环氧苯乙烷(rac‑SO)为底物，以双环氧化物水解酶：环氧化物水解酶突变体AuEH2和环氧化物水解酶VrEH3对映归一性水解外消旋环氧苯乙烷(rac‑SO)制备高对映纯产物(R)‑苯乙二醇(PED)。

本发明是首次把来源于绿豆的VrEH3和来源于宇佐美曲霉的AuEH2结合对映归一性水解rac‑SO。

催化10mM rac‑SO制备(R)‑PED的ee值为96.0％。

具有适合于工业应用的理想特性，本发明为该酶的产业化生产奠定了理论基础，有较大的工业化应用潜力及经济价值。

申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：张勇
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环氧化物水解酶PvEH3的表达及手性邻二醇的合成

2018年第37卷第5期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS·1933·化工进展环氧化物水解酶Pv EH3的表达及手性邻二醇的合成王瑞1，许耀辉1，王克伟2，邬敏辰2（1江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122；2 江南大学无锡医学院，江苏无锡 214122）摘要：基于环氧化物水解酶（EHs ）一级结构的计算机辅助分析，以菜豆（Phaseolus vulgaris ）总RNA 为模板，采用逆转录PCR 和巢式PCR 技术扩增了一种新型环氧化物水解酶（Pv EH3）的编码基因pveh3。

借助表达载体pET-28a （+）将pveh3导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行了异源表达。

一级和三级结构表明，Pv EH3属于α/β水解酶超家族，其催化三联体为Asp 101-His 297-Asp 262，两个保守质子供体为Tyr 150和Tyr 232。

在20℃、pH7.0的反应条件下，Pv EH3能催化环氧苯乙烷及其4种衍生物的对映会聚水解。

实验结果表明，Pv EH3对环氧苯乙烷及其对位取代环氧底物（93.2%、86.6%和85.1% ee p ）的对映会聚性优于其间位取代环氧底物（37.1%和53.3% ee p ）；Pv EH3针对5种环氧底物中的环氧苯乙烷具有最高的区域选择性，区域选择性系数αS 和βR 分别为93.9%和99.0%。

Pv EH3的发现增加了区域选择性高且互补的EHs 数目，为单酶催化环氧化物的对映会聚水解提供了更多的选择余地。

关键词：环氧化物水解酶；生物催化；表达；区域选择性；对映会聚水解中图分类号：Q556.9 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）05–1933–07 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-1287Expression of Pv EH3，a Phaseolus vulgaris e poxide hydrolase ，andsynthesis of chiral vicinal diolsWANG Rui 1，XU Yaohui 1，WANG Kewei 2，WU Minchen 2（1School of Biotechnology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，Jiangsu ，China ；2Wuxi Medical School ，JiangnanUniversity ，Wuxi 214122，Jiangsu ，China ）Abstract ：Based on the computer-aided analysis of primary structures of epoxide hydrolases （EHs ），a Pv EH3-encoding gene ，pveh3，was amplified from Phaseolus vulgaris total RNA by RT-PCR and Nested PCR technique ．Mediated by expression vector pET-28a （+），pveh3 was heterologously expressed in E. coli BL21（DE3）．Primary and three-dimensional structures indicated that Pv EH3 belonged to the α/β-hydrolase superfamily. Its catalytic triad is Asp 101-His 297-Asp 262，and two conservative tyrosine residues served as proton donor are Tyr 150 and Tyr 232．The enantioconvergent hydrolysis of styrene oxide and its four derivatives were conducted by Pv EH3 at a gentle reaction condition ，20℃ and pH 7.0．The experimental results indicated that without substitution or at the para positions （93.2%，86.6% and 85.1%ee p ）of the aromatic ring had a better enantioconvergent than those at the meta position （37.1% and 53.3% ee p ）．Pv EH3 possesses the best regioselectivity towards styrene oxide within five substrates and the regioselectivity coefficients ，αS and βR ，were 93.9% and 99.0%，respectively ．The discovery of Pv EH3 increased the number of EHs possessing high and complementary regioselectivity ，which offered more options for the enantioconvergent hydrolysisof racemic epoxides by single EHs ． Key words: epoxide hydrolase ；biocatalysis ；expression ；regioselectivity ；enantioconvergent hydrolysis@ 。

酶的定向进化及其应用_孙志浩

易错 PCR 是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配, 导致目的基因随机突变。然而, 经一次突变
的基因很难获得满意的结果, 由此发展出连续易错 PCR( sequential error- prone PCR) 策略。即将一次 PCR 扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板, 连续反复地进行随机诱变, 使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。Chen( 陈克勤) 等人用此策略使在非水相( 二甲基甲酰胺, DMF) 溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶 E 的活性获得成功, 所得突变体 PC3 在 60% 的 DMF 中, 催化效率比野生酶高 471 倍[ 14, 15] 。
随着酶分子定向进化的发展, 在常规的定向进化方法的基础上, 又相继开发出了一些定向进化的新方法, 如体外随机引发重组( random priming in vitro recombination, RPR) [ 20] 、不依赖于同源性的蛋白质重组方法( sequence homology- independent protein recomb-i nation, SHIPREC) [ 21] 、交错延伸( stagger extension process, StEP) [22] 、过渡模板随机嵌合生长( random ch-i meragenesis on transient templates, RACHITT ) 、渐增切割产杂合酶方法( incremental truncation for the creation of hybrid enzymes, ITCHY) [23] 以及酶法体外随机- 定位诱变 ( random-site- directed mutagenesis) [ 24~ 26] 等方法,

绿豆环氧化物水解酶基因的克隆、分析及表达

绿豆环氧化物水解酶基因的克隆、分析及表达姚瑶;胡蝶;邬敏辰;叶慧华【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2018(037)002【摘要】环氧化物水解酶可催化制备高光学纯度的环氧化物及邻二醇等高价值手性药物中间体本研究采用RT-PCR和THSO-PCR扩增侧翼未知DNA序列技术从绿豆(Vigna radiata)中克隆了一种新型环氧化物水解酶VrEH3的基因Vreh3,Vreh3编码区DNA序列长度为1178 bp,包含2个142 bp和79 bp的内含子,以及957 bp的开放阅读框,编码31 8个氨基酸.VrEH3的理论相对分子质量和等电点分别为36.2×103和5.59;保守的催化三联体为Asp101-Asp262-His297将Vreh3与表达载体pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组VrEH3.该酶可对映归一性水解外消旋环氧苯乙烷((R,S)-SO)产生(R)-苯基乙二醇,得率高达79.4％,对映体过量值(e.e.值)为94.7％.【总页数】8页(P138-145)【作者】姚瑶;胡蝶;邬敏辰;叶慧华【作者单位】江南大学药学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学无锡医学院,江苏无锡214122;江南大学药学院,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析 [J], 胡蝶;朱利娟;邬敏辰;汪俊卿;唐存多;冯峰;余涛2.土豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及其活性包涵体分析 [J], 李小灵;贺婉红;范立强;程安阳;王刚;潘忠孝;朱庆庆;孟军3.土豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及其活性包涵体分析 [J], 李小灵;贺婉红;范立强;程安阳;王刚;潘忠孝;朱庆庆;孟军4.绿豆总RNA的分离及环氧水解酶基因的克隆 [J], 贺婉红; 华叶; 范立强5.绿豆总RNA的分离及环氧水解酶基因的克隆 [J], 贺婉红; 华叶; 范立强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

微粒体环氧化物水解酶

微粒体环氧化物水解酶微粒体环氧化物水解酶（Microsomal epoxide hydrolase，简称MEH）是一种重要的酶类蛋白质，在细胞内发挥着关键的生物转化作用。

它参与着多种生物代谢过程，特别是对于外源性化合物的代谢和解毒具有重要作用。

本文将从酶的结构、功能、代谢途径等多个方面来介绍微粒体环氧化物水解酶的研究进展和应用前景。

一、微粒体环氧化物水解酶的结构与功能微粒体环氧化物水解酶是一种单体蛋白质，分子量约为62kDa。

其基因位于人类基因组中的1p36.1-36.3区域，编码的蛋白质由451个氨基酸残基组成。

酶的结构主要由N端的信号肽序列、N端的α-螺旋结构、C端的β-折叠结构以及C端的α-螺旋结构组成。

这种特殊的结构使得微粒体环氧化物水解酶能够与多种底物发生特异性结合并发挥其催化作用。

微粒体环氧化物水解酶主要参与外源性化合物的代谢和解毒过程。

它能够催化环氧化物的水解反应，将其转化为相应的二醇。

这种反应对于许多环氧化物类化合物的代谢具有重要意义，如多环芳烃、多氯联苯等。

通过水解反应，微粒体环氧化物水解酶能够将这些具有潜在毒性的环氧化物转化为相对稳定和无毒的二醇类代谢产物，从而保护细胞免受有害物质的侵害。

微粒体环氧化物水解酶参与的代谢途径主要包括环氧化物代谢途径和亚硝酸盐代谢途径。

在环氧化物代谢途径中，微粒体环氧化物水解酶催化环氧化物的水解反应，将其转化为二醇类产物。

而在亚硝酸盐代谢途径中，酶可将亚硝酸盐转化为相应的亚硝酸酯，进而参与到亚硝酸酯的降解过程中。

三、微粒体环氧化物水解酶的研究进展微粒体环氧化物水解酶的研究得到了广泛关注。

研究表明，该酶在人体中的表达水平受到基因多态性的影响。

不同基因型的个体可能表现出不同的酶活性和底物亲和力，从而对药物代谢和毒物解毒能力产生影响。

因此，微粒体环氧化物水解酶的基因多态性已成为一些疾病的遗传易感因素。

微粒体环氧化物水解酶还被广泛应用于药物研发和毒理学领域。

菜豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造

菜豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造手性环氧化物和邻二醇是合成手性化合物的重要中间体,在功能材料、医药和农药等的合成中有着重要的应用价值。

环氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EHs）能催化外消旋环氧化物的选择性开环生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物。

区域选择性高且互补的单一EH催化外消旋环氧化物对映归一性水解是制备手性邻二醇的理想途径,但目前仅有少数EHs具有此特性。

本论文从菜豆（Phaseolus vulgaris）基因组中扩增了一种编码PvEH3的基因pveh3,并将其在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中成功实现异源表达;采用定点和迭代突变技术对PvEH3进行分子改造,以获得高活力和高区域选择性的PvEH3突变体;通过构建双相催化体系解除底物对最优突变体PvEH3G170E/F187L/P237L的抑制作用。

以菜豆总RNA为模板,采用逆转录PCR和巢式PCR技术扩增了一条新型环氧化物水解酶的编码基因pveh3,其长度为957 bp,编码318个氨基酸。

一级和三维结构分析表明PvEH3属于α/β水解酶超家族,其催化三联体为D101-H297-D262,两个保守质子供体为Y150和Y232。

SDS-PAGE结果显示PvEH3的表观分子量为36.1 kDa,催化特性研究表明PvEH3能催化对氯环氧苯乙烷（pCSO）的对映归一性水解,产物（R）-对氯苯乙二醇（pCPED）的对映体过量值（eep）为85.1%。

PvEH3对（S）-和（R）-pCSO的区域选择性系数αS和βR分别为87.0%和98.0%。

通过镍离子亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,PvEH3的比活力为1.36U·mg-1,针对pCSO的动力学参数Km和kcat/Km分别为6.60mM和0.583mM-1·s-1。

微粒体环氧化物水解酶(EPHX1)基因多态性与泌尿系恶性肿瘤易感性的Meta分析

微粒体环氧化物水解酶(EPHX1)基因多态性与泌尿系恶性肿瘤易感性的Meta分析何立;陈志远;王敏;蒋冠军;汪志顺;刘修恒【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2015(030)011【摘要】目的探讨微粒体环氧化物水解酶(EPHX1)编码基因多态性与泌尿系恶性肿瘤的遗传易感性的关系.方法按照制定的检索策略,检索相关数据库中的文献,获取有关EPHX1基因多态性与泌尿系恶性肿瘤易感性的病例-对照研究,提取相关数据进行Meta分析.以病例组和对照组基因型分布的比值比(OR)及其95％可信区间(CI)作为效应指标.结果共纳入EPHX1 Y113H多态位点的6篇文献,累计病例806例,对照1 156例.纳入的结果使用Meta分析显示EPHX1 Y113H基因多态性与泌尿系恶性肿瘤易感性无相关性[(CC vs TT:OR=1.33,95％ CI:0.87 ～ 2.05,P＞0.05);(CT vs TT:OR =1.11,95％CI:0.93～1.33,P＞0.05);(CC/CT vs TT:OR=1.11,95％CI:0.95 ～ 1.30,P＞0.05);(CC vs CT/TT:OR =1.24,95％ CI:0.86～1.78,P＞0.05)].EPHX1 H139R多态位点共4篇文献,累计病例491例,对照760例.Meta分析显示EPHX1 H139R基因多态性与泌尿系恶性肿瘤易感性无相关性[(GG vs AA:OR =0.74,95％CI:0.40 ～ 1.08,P＞0.05);(AG vs AA: OR=1.04,95％CI: 0.83 ～ 1.32,P＞0.05);(GG/AG vs AA: OR=1.00,95％ CI:0.79～1.27,P＞0.05);(GG vs AG/AA:OR =0.72,95％ CI:0.41～1.27,P＞0.05)].结论 EPHX1Y113H或H139R基因多态性与泌尿系恶性肿瘤易感性无明显相关性.【总页数】4页(P1621-1624)【作者】何立;陈志远;王敏;蒋冠军;汪志顺;刘修恒【作者单位】430060 武汉大学人民医院;430060 武汉大学人民医院;430060 武汉大学人民医院;430060 武汉大学人民医院;430060 武汉大学人民医院;430060 武汉大学人民医院【正文语种】中文【中图分类】R73-36【相关文献】1.EPHX1 A415G基因多态性与胃肠道肿瘤易感性的Meta分析 [J], 王东风;刘伟;张冬;许发培;仲坚;姚成云;孙静锋2.微粒体环氧化物水解酶EPHX1基因多态性与肝细胞性肝癌易感性的Meta分析[J], 马良;黄盛鑫;李健;黄山;赵荫农;黎乐群;吴飞翔3.LOX基因多态性与亚洲人群恶性肿瘤易感性Meta分析 [J], 余觅; 何杰; 李小燕; 孙建; 王春茂4.GSTM1基因多态性与中国人群头颈恶性肿瘤易感性的meta分析 [J], 刘小涵;李丽;季洁;张小兵5.中国南方汉族人种微粒体环氧化物酶基因多态性与吸烟者慢性阻塞性肺疾病易感性的相关性 [J], 项轶;黄绍光;万欢英;程齐俭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

微生物环氧化物水解酶的研究进展

玉米须维生素Ｅ提取效率的因素依次为：甲酯化温度＞甲酯化时间＞料液比＞回流提取时间，甲酯化温度对玉米须ＶＥ的提取效率影响最大。
目前，此实验仍处于摸索阶段，着重于ＶＥ的提纯。由于ＶＥ的易被氧化性、不耐高温性等，今后还应考虑ＶＥ活性保护问题。参考文献：［１］匡轩，匡芮，朱海涛，等．玉米须的化学成分及药理保健功能［Ｊ］．中国食物与营养，２００７。（４）：４６—４８．［２］中药大辞典［Ｍ］．上海：上海科技出版社，１９７７：５５５．［３］ＮｏｚｚｏｌｉｔｌｏＣ，ＲｅｉｄＬ．Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｍａｉｚｅｓｉｌｋ［Ｊ］．ＢｕｌｌＬｉａｉｓｏｎ—Ｇｒｏｕｐｅｐｏｌｙ．Ｐｈｅｎｏｌｓ，１９９２，（１６）：１８７．［４］王荣萍，王爱华．天然维生素Ｅ的提取及应用［Ｊ］．河南工业大学，２００５，（１）：２５—２６．［５］赵贵兴，炼霞，赵红宇，等．大豆脱臭馏出物中天然维生素Ｅ的提取［Ｊ］．黑龙江农业科学，２００６，（５）：１１８～１１９．
目前，已报道的快速酶活检测方法一般是基于显色试剂与底物或产物反应，通过颜色变化定性检测酶活或比色法定量检测酶活。这些快速方法的建立将有助于微生物酶源的快
大多数ＥＨ属于ａ／１３折叠型的酶，含有两个功能性的结构域（核心结构域和帽子结构域），由ｄ螺旋和Ｂ折叠组成。活性位点为亲核残基Ａｓｐ、Ｈｉｓ和羧酸残基（Ａｓｐ或Ｇｌｕ），帽子
Ｆａｌ）ｒｉｚｉｏＢａｄａｌａｓｓｉ等¨１以潜荧光的环氧化物为底物，经酶
水解拆分、Ｎａｌ０４氧化、Ｂ一消除反应后，释放荧光物质７一羟基香豆索，筛选ＥＨ活力（图２）。该方法以特定的环氧化物为底物，因此，检测到有活力的ＥＨ并不一定对特定的底物有拆分活力。
ＣｅｓａｒＭａｒｃｏ等¨１利用Ｎａｌ０４氧化苯乙烯类环氧化物水解

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摘
要：氧化物水解酶是一种能水解环氧化合物的酶，环它能够立体选择性水解外消旋的环氧化物产生手性环氧化物
和手性二醇。它普遍存在于动植物、虫及微生物体内，用其合成手性的环氧化舍物及其产物手性醇，昆应受到了科学工作者们的广泛关注。文综述了环氧化物水解酶的对映会聚水解及其在制备手性环氧化物和手性邻二醇中的应用。本关键词：氧化物水解酶；物催化；映会聚水解；体选择性环生对立
食
品与发
酵科技
ＦｏｎＦｒｎａｉｎＴｃｎｌｇｏｄａｄｅｍｅｔｔｅｈｏｏｙｏ
第４８卷（４期）Ｖ１８Ｎｏ第ｏ．。．４４
环氧化物水解酶介导的对映会聚水解及其应用
陈林，申红蕾，勃朱
（江工业大学生物与环境工程学院，江杭州３０１）浙浙１０４
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
中图分类号：Ｑ２．Ｔ９６２
文献标识码：Ａ
文章编号：６４５６２１）４０６ — ０４１７ — ０Ｘ（０２０ — ０７００
ＡｐｌｃｔｎｏｏｏｖｒｅｃｐｉａｉｆＢｉｃｎｅｇｎｅＨｙｒｌｓｓｏｏｉｅＨｙｒｌｓｏｄｏｙｉｆＥｐｘｄｄｏａｅ
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ｄｉ１．６０ｉｎ１７ — ０Ｘ２１．４０８ｏ：０３９．ｓ．４５６．２ — １９ｓ６００
手性环氧化物和手性醇是十分重要的医药中间
及环境友好等。因此，生物法制备手性环氧化物及其二醇产物成为近年来研究的热点Ｈ。
１环氧化物水解酶介导的对映会聚水解的机理
体，在制备手性药物及手性有机合成中用途广泛。目
前制备手性环氧化物的生物法有两种．分别为前手性烯烃的不对称环氧化及外消旋环氧化物的动力学拆分。前手性烯烃的不对称环氧化主要应用的是氧化还原酶，需要辅因子或辅酶。一种外消旋环氧它后化物的动力学拆分主要应用的是环氧化物水解酶
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（ｐｘｄｙｒｌｓｓ，它不需要辅因子或辅酶，ＥｏｉｅＨｄｏａｅ）操
环氧化物水解酶的属于邶折叠型水解酶，环氧化物水解酶催化环氧化物水解不需要任何辅基，也不需要金属离子。目前，ＰＢ酶库中报导的环氧从Ｄ
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（ｎｔｕｅｏｉｏｉｌａｄＥｖｒｎｅｔｎｉｅｒｇＺｅａｇＵｉｒｉｅｈｏｇ，ｎｚｏ１０４Ｃｉ）ＩｓｔｔｆＢｏｇｃｎｎｉｍｎａＥｇｎｅｉ，ｈｊｎｎｅｓｙｏＴｃｎｌＨａｇｈｕ３０１，ｈｎｉｌａｏｌｎｉｖｔｆｏｙａ
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