十字花科根肿病

摘要：根肿菌引起的根肿病，主要分为两个阶段。

初次侵染发生在多数品种中，次及侵染仅仅发生在完全的易感品种中。

关于根肿病发病机理的研究认为，从油菜和黑麦被侵染的根毛上聚集次级游动孢子，植物种类间进行交叉侵染。

两个物种和两个种菌相互组合作为处理，接菌5天后，根毛侵染是相似的，在整个处理中占50%-68%。

50%的油菜和40%的黑麦中观察到次级侵染。

中间的处理显示，油菜中的次级侵染和次级原质团较黑麦中的较多。

接种35天后，注射油菜中次级游动孢子，形成典型肿瘤到达总油菜数的14%，注射黑麦中的次级游动孢子，微小肿瘤达到16%。

忽视种菌的来源，1/3的油菜发生次级侵染，但是却没有形成肿瘤。

结果表明，在黑麦初级侵染阶段，诱发了抵抗次级侵染的物质。

在非寄主上产生的次级游动孢子能够侵染寄主，并且证实了在非寄主中发生次级侵染。

主要词：根肿病致病性初级侵染抗性休眠孢子引言芸薹属根肿菌侵染引起的十字花科蔬菜根肿病，成为加拿大油菜生产中最大的威胁。

根肿菌的生活史分为三个阶段，作为休眠孢子在土壤中生存，二是初次侵染根毛，三是次级侵染直至到皮层。

每个休眠孢子生长到释放一椭圆形和梨形有两个鞭毛能动的孢子时被称初级游动孢子。

这些游动孢子通过穿透细胞壁侵入根毛，当温度条件合适时，初级原质团快速发育，直至裂解成游动孢子囊，每个都包含4-16个次级游动孢子，继而释放到土壤中。

初级侵染不会有宏观上的症状。

次级游动孢子穿透寄主根表皮侵入主根皮层组织。

次级游动孢子与初级游动孢子在外观上是没有差别的。

次级侵染后会在根皮层里形成次级原质团，继而导致了根肿病的症状，畸形的棒状根。

每个次级的多核原质团最终在根重裂解成大量的休眠孢子。

随着根组织的破碎，休眠孢子释放到土壤中完成整个侵染循环。

十字花科中的许多物种，包括农作物和十字花科野草都可作为根肿菌的寄主。

MacFarlane (1952)在Lolium perenne L. (perennialryegrass), Reseda odorata L. and Tropaeolum majusL.等非寄主中观察到了初级侵染，但是没有皮层侵染。

在其他的研究中，在T. majus, Carica papaya, R. alba and Betavulgaris等非寄主中观察到了次级侵染。

根肿病的发病机理的许多方面还不是很清楚，但清晰的发病机制可能在新抗病育种策略或根肿病管理的发展中做出贡献。

根肿菌致病性其中一方面是易感作物对非寄主根毛侵染起到什么样的作用，因此，目前研究次级游动孢子通过交叉侵染对油菜和黑麦草的影响。

研究目的是确定寄主和非寄主初级侵染是否有差别，次级游动孢子能否重复侵染，次级游动孢子在寄主和非寄主上产生的致病性是否有差别。

材料和方法植株材料和根肿菌被用作寄主和非寄主的油菜品种和多年生的黑麦草。

Galls that had developed on plants of cv. Westar after infection by P. brassicae were collected from experimental field plots in Edmonton, AB, Canada (53°38′49″N and 113°22′40″W). 从根瘤上分离到休眠孢子最为原种群。

幼苗的准备油菜和黑麦草种子用1%次氯酸钠进行表面消毒5min，用蒸馏水洗净，在湿润的滤纸上发芽7天，将休眠孢子和次级游动孢子接种在幼苗上。

接种休眠孢子将小部分肿根放在含有蒸馏水的搅拌机里，搅拌成匀浆，八层纱布进行过滤，得到休眠孢子悬浮液。

将孢子悬浮液与少量的土进行混合。

幼苗被转移到混有少量土40cm*25cm*15cm的穴盘里。

穴盘放在温度为24℃、18℃（白天，黑夜），光周期16h，80%水分的生长箱里，每隔一天从底部浇PH=6.4的自来水。

次级游动孢子的接种接上休眠孢子的幼苗生长7天后，大约含有3.1*107个休眠孢子。

拔出油菜和黑麦草幼苗个200株，用自来水冲洗干净。

减掉地面上部植株，将其根部放在含有200ml蒸馏水的500ml的容量瓶里，漂洗三次震荡150rpm每20min。

根放在50ml蒸馏水里100rpm摇晃20h，促进释放次级游动孢子。

然后移走肿根，10ml 游动孢子悬浮液5000g离心5min，最后调整到2.5*106孢子∕ml。

用显微镜观察游动孢子悬浮液中没有休眠孢子。

原始的悬浮液调整到1*104个∕ml，立即用于接种。

30ml的游动孢子悬浮液被转移到无菌的96个口，200微升的移液管的盒子里。

七天后，将油菜和黑麦草的幼苗用齿条插入移液管里，确保植株站立并且根部接触到游动孢子悬浮液。

盒子摇晃48h30rpm∕min，幼苗被转移到含有经过高压灭菌土的40cm*25cm*15cm穴盘里。

这个实验分为四个处理，分别是C C,C R,R C,R R,指出油菜或者黑麦草接种其中一种植株上的游动孢子(Fig. 1b)。

在同一水平条件下，黑麦草幼苗被转移到含有1*105个∕ml休眠孢子中。

根肿病测验接种5天后，每个处理收集10棵幼苗30个根系样本，用显微镜进行观察。

对于每个样本，用10*镜头观察10个区域。

在每个观察的区域里，收集三部分资料：根毛初级侵染及其总数量，次级侵染的有无，次级原质团的总数量。

接种35天后，收获所有的植株，用显微镜或者宏观山观察根侵染和根肿病的症状。

实验重复的做。

数据分析计算每个根的初级和次级侵染的比例和次级原质团的数量。

用SAS软件进行分析，确保每个实验的重复次数不会存在偏差，应用与后面的分析。

处理间的偏差用Duncan’s多范围测试进行估计。

结果和讨论接上休眠孢子7天后，油菜和黑麦草上都产生了大量的休眠孢子。

证实了初级侵染阶段在某些非寄主上能够完成。

接上来自油菜和黑麦草的次级游动孢子5天后，每个处理多于50%的根毛被侵染（Figs. 2a and 3a)。

证实了来自黑麦草（非寄主）上的次级游动孢子也能侵染寄主和非寄主的根毛。

先前的研究证实了寄主根毛上的次级游动孢子能够侵染寄主植株，这次试验首次证实了非寄主植株上的游动孢子也能侵染寄主植株。

次级游动孢子能够侵染寄主和非寄主根毛这一事实为根肿菌次级侵染之前先在根毛内进行增值循环。

在根毛内通过重复的循环，快速增加了次级游动孢子的数量，增强了根肿菌在皮层组织处侵染的成功率。

每个处理中根毛侵染次数是没有差异的(Fig. 2a)，有限的说明了了在黑麦草根毛里存寄主抗性。

不论是油菜还是黑麦草的次级游动孢子，接种后大约50%的油菜和40%的黑麦草均导致了次级侵染(Fig. 2b)。

油菜幼苗接上油菜游动孢子后，其次级侵染率和在任一区域观察到的次级原质团的数量都高于黑麦草幼苗接上黑麦草游动孢子的处理及其他两个中间处理(Fig. 2b and c)。

说明了根肿菌的次级侵染寄主比侵染非寄主植株是相对容易的，次级侵染和原质团的数量在交叉接种处理间没有差异CR and RC)。

可能说明了在易感寄主上产生的高致病性的次级游动孢子克服了接种上油菜游动孢子的黑麦草幼苗的非寄主的抗性。

（2）（4）（3）如果不考虑次级游动孢子的来源，黑麦草上产生的次级原质团与油菜上的次级原质团在宏观上是相似的。

非寄主植株的次级侵染在以前的研究中曾经被报道过。

比较而言，2周后，黑麦草接种的只有20%的被侵染，但是也没有观察到次级侵染。

这也说明了在根肿菌初次侵染之间通过接种的次级游动孢子忽视了非寄主根肿菌的作用。

因此，黑麦草幼苗不会受到根肿菌的刺激，而引起非寄主抗性的表达。

接种35天后，从黑麦草55R C和60R R上没有发现肿瘤。

RC和RR两个处理，1∕3根中含有次级原质团，在形态上没有差异，观察到了没有活力的原质团和休眠孢子。

这写观察说明了在黑麦草根中，次级原质团生存长达35天，植株生长阶段，根肿菌不会再继续侵染。

接种上油菜游动孢子，35天后，10%的油菜植株发现有较大的根瘤(Fig. 5a)。

相反，接种黑麦草游动孢子，16%的油菜发现了微小的肿瘤(Fig. 5b and c)。

这些肿瘤像在根上部形成的一串念珠。

每一个肿瘤内，被侵染的皮层组织内都有休眠孢子(Fig. 5d)。

接种物（油菜和黑麦草上根肿菌）不同，导致肿瘤大小不同。

同时说明了在诱导肿瘤形成过程中，来自寄主和非寄主的次级游动孢子侵染的能力不同。

这些数据表明，黑麦草等非寄主对根肿菌的抗性的机制主要是在根肿菌生命周期的不同阶段受到刺激，油菜和黑麦草在初侵染很少或者没有差异，也就是说，油菜和黑麦草初侵染阶段导致了大量次级游动孢子的产生和释放。

在以前的研究数据中，给黑麦草接种上休眠孢子很少观察到次级侵染，有三个解释：一是来自黑麦草上的次级游动孢子不具有致病性；二是黑麦草对于根肿菌的次级侵染是完全具有抗性的;三是根肿菌的初级侵染诱导了黑麦草对次级侵染的抗性。

目前研究中，排除了前两种解释，因为在R C和R R中黑麦草的次级侵染是有可能发生的，在处理油菜C R中，来自黑麦草的次级游动孢子是具有致病性的。

接黑麦草游动孢子的油菜形成的不规则的肿瘤，说明了黑麦草上游动孢子的次级侵染与油菜上游动孢子的次级侵染比较是不精确进行的。

也就说明了来自油菜和黑麦草上的游动孢子在寄主对其次级侵染中表达的抗性存在着差异。

在初侵染阶段，容易引起寄主的抗性。

例如，拟南芥中的分生孢子的萌发，附着孢的形成和大麦白粉病穿透表层进行侵染，但是当菌丝穿透植物细胞时菌丝会停止生长。

先前的研究认为根肿菌非寄主的抗性反应时被诱导的，但目前的研究认为抗性反应时由根肿菌在根毛初次侵染阶段与黑麦草之间的相互作用，从而影响次级侵染和肿瘤的形成。

从目前的研究结果看，在初侵染是诱导了对次级侵染的抗性，黑麦草的抗性反应需要很长一段时间才能形成。

另外，已根肿菌的发病机理信息为条件，就会导致两个研究方向。

第一，清楚的知道了次级游动孢子能够引起初次侵染，暗示这应该用较低浓度的休眠孢子分析初次侵染。

如果休眠孢子浓度较高，在初次侵染时，次级游动孢子就会立即覆盖初级游动孢子，发挥巨大侵染能力。

第二，寄主植株能发生初次侵染，并产生能够侵染易感寄主的次级游动孢子。

因此，温室和试验田里的寄主和非寄主都能够影响研究结果，要小心的控制试验条件。