真核生物rna的分离和鉴定
第十一章 核酸提取与鉴定
Trizol一步法提取总RNA：
附：Trizol法步骤
1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌 处理）配制的75%乙醇4℃预冷； 2）1ml Trizol匀浆好的样品； 3）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀（15秒）——“慢”，氯仿使蛋
白变性
4）室温，静置3分钟； 5）离心机4℃、14000转/分，离心15分钟；静置1分钟（分
（2）体液标本
浆膜腔积液、脑脊液、尿液、关节积液等； 按水样标本方式离心，取沉淀用于核酸提取。
（二）提取用具预处理
1. DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNase处理。
2. RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温， 提取条件要求严格。
条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）
9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟 10）弃上液（移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，
沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接 触到沉淀斑区）
11)沿试管内壁轻轻加入1ml 4℃预冷的75%乙醇,注意切勿 冲击到沉淀斑区 12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟 13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用
• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃ 处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高 压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
真核生物转录起始位点的定位与鉴定
真核生物转录起始位点的定位与鉴定转录起始位点（transcription start site, TSS）是指RNA聚合酶II（RNA polymerase II, Pol II）开始合成mRNA的地点，在真核生物基因表达中具有至关重要的作用。
因此，TSS的准确定位对研究基因的结构、调控及功能等方面都有着重要的价值。
本文将介绍TSS的定位与鉴定、存在的问题以及未来的展望。
TSS的定位与鉴定TSS的定位与鉴定有多种方法，其中最常用的方法是基于高通量测序技术的转录组测序技术（RNA-Seq）。
RNA-Seq是一种高通量测序技术，通过对细胞或组织中的RNA进行测序，可以同时鉴定基因表达和基因的TSS。
这种方法需要对RNA进行反转录和二代测序，然后将测序结果与参考基因组比对，从而鉴定TSS 的位置。
除了RNA-Seq，还有一些其他方法也可以用来定位TSS。
例如，5'-快速扫描技术（5' RACE）和3'-快速扫描技术（3' RACE）可以通过扩增起始位点周围的序列来定位TSS。
其原理是先对RNA进行逆转录反应，然后使用特定的引物扩增其中包含TSS序列的RNA片段。
但是，这些方法受到PCR扩增的特异性和效率的限制，在保证准确性的同时，需要进行多次重复实验来鉴定TSS。
存在的问题尽管现代测序技术使得TSS的定位和鉴定变得更加准确和高通量，但仍然存在一些问题。
第一个问题是不同组织和细胞类型之间TSS的差异。
同一基因在不同组织和细胞类型中的TSS位置可能存在差异，这会影响到基因的表达模式和转录产物的种类。
因此，在研究基因的表达与调控时需要充分了解TSS的差异及其可能带来的影响。
第二个问题是TSS的多样性。
同一基因的TSS位置可能存在多个，这种现象被称为TSS多样性。
这种多样性是复杂的基因表达调控和转录调控机制的结果，有助于产生不同种类和不同剪接异构体的转录产物。
然而，这种多样性也给TSS 的定位和鉴定带来了更大的挑战。
实验三 mRNA的分离纯化
实验三mRNA的分离纯化【实验目的】1．了解分离mRNA的原理2．学习和掌握mRNA的分离、纯化方法和技术【实验原理】真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。
真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。
哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。
其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。
真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。
当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。
目前常用的mRNA的纯化方法有：（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。
本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。
总RNA的提取及
RNA电泳鉴定 通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有降解 电泳检测结果有三条晰的rRNA 带：28S，18S和5S
（普通的1%琼脂糖凝胶电泳也可用于鉴定，电泳槽用去污 剂处理，水冲干净，用新鲜的电泳缓冲液）
Total RNA
实验二 RT-PCR
实验原理
Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合 物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解 离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性 的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后， RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相 中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到 纯化的总RNA。
（一步法）
真核细胞RNA的种类
真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、 tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA （1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位 于细胞质中。
大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚 A(Poly A)尾巴。
实验前的准备
RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。 由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理 而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在 少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备 的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析 的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制 备RNA很重要。
12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml 70%乙醇，震荡数 秒，8000rpm离心5min
小心去上清，室温干燥5min，加入10ul DEPC水，打匀
55℃水浴10分钟助溶
RNA保存： 溶解在无RNAase的水或TE中，在-70℃或更低温度中
关于真核生物转录过程
关于真核生物转录过程真核生物转录过程是指在真核细胞中，通过RNA聚合酶酶解DNA分子并合成RNA分子的过程。
转录是基因表达的第一步，能够将DNA中的遗传信息转化为RNA信使分子，后续再由RNA转化为蛋白质。
真核生物的转录过程与原核生物有很大的不同。
在真核生物中，合成RNA的过程与DNA合成RNA的地点是分离的，真核生物的转录需要通过核孔将合成的mRNA运输到细胞质进行翻译过程。
此外，真核生物的转录还涉及到基因调控的复杂过程，包括启动子和转录因子的结合等。
真核生物转录的过程可以分为三个主要的步骤：启动、延伸和终止。
启动是转录的第一步，也是调控基因表达的关键步骤。
在启动过程中，转录因子结合到DNA上的启动子区域，形成转录起始复合体。
转录起始复合体由RNA聚合酶、一组基本转录因子和其他辅助蛋白质组成。
转录起始复合体的组装过程是一个动态的过程，涉及到DNA的解旋、转录因子的结合和清除等一系列步骤。
延伸是转录的第二步，也是合成RNA分子的过程。
在这一步骤中，核酸链从DNA上解旋，并且RNA聚合酶将核苷酸逐一加入正在形成的RNA链上。
RNA的合成是由模板链上的DNA决定的。
具体来说，在DNA的双链中，开放的链称为模板链，而不开放的链则被称为非模板链。
RNA聚合酶沿着模板链进行按序合成RNA，与模板链配对的碱基由RNA聚合酶选择合成所需的相应RNA碱基。
终止是转录的最后一步。
在转录过程中，当RNA聚合酶碰到终止信号，其解离并释放出合成的RNA链。
真核终止信号的识别与原核终止信号的机制也有所不同。
在真核生物中，终止信号距离转录起始点相对较远，通常由一个富含腺嘌呤的序列组成。
转录动态改变时，转录因子的离开和结合轮番发生，使得RNA聚合酶能够顺利释放合成的RNA链。
总的来说，真核生物的转录过程复杂，需要多个转录因子的参与。
转录除了可以合成编码蛋白质所需的mRNA外，还可以合成非编码RNA和微小RNA等多种类型的RNA。
原核生物与真核生物转录的异同点
原核生物与真核生物转录的异同点原核生物与真核生物是生物界两大主要分类群体，它们在转录过程中存在许多异同点。
本文将以原核生物与真核生物转录的异同点为标题，详细阐述两者在转录过程中的差异和相似之处。
一、转录定义转录是指将DNA序列转化为RNA分子的过程，是基因表达的第一步。
在原核生物和真核生物中，转录都是通过RNA聚合酶酶作用于DNA分子，合成与DNA链对应的RNA分子。
二、转录过程的异同点1. 转录起始位点在原核生物中，RNA聚合酶在DNA上识别并结合到特定的启动子序列上，转录起始位点通常位于启动子上游。
而在真核生物中，转录起始位点位于启动子序列的TATA盒附近。
2. 前处理在真核生物中，转录后的RNA分子需要经过前处理过程，包括剪切、修饰和聚合酶II的解离等步骤，形成成熟的mRNA分子。
而在原核生物中，转录后的RNA分子可以直接作为mRNA使用，不需要前处理。
3. 转录终止在原核生物中，转录终止是由RNA聚合酶遇到终止序列（如转录终止因子、反向重复序列等）时直接停止，释放RNA分子。
而在真核生物中，转录终止需要依赖辅助蛋白和转录终止信号来完成，包括多个信号序列的相互作用。
4. 转录调控在原核生物中，转录调控主要通过启动子上的结合位点和转录因子来实现。
不同的转录因子可以结合到启动子上，促进或抑制转录的进行。
而在真核生物中，转录调控更为复杂，除了转录因子的作用外，还包括染色质结构的改变、组蛋白修饰和DNA甲基化等多种机制。
5. 转录速度原核生物的转录速度较快，转录过程通常在几十秒内完成。
而真核生物的转录速度较慢，转录过程可能需要几分钟甚至更长时间。
三、转录过程的相似点1. RNA聚合酶的作用无论是原核生物还是真核生物，RNA聚合酶都是转录过程的核心酶。
它们能够识别DNA上的启动子序列，并与之结合，开始转录过程。
2. 碱基配对规则原核生物和真核生物在RNA合成中都遵循碱基配对规则，即A与U（在RNA中）或T（在DNA中）配对，C与G配对。
真核生物细胞的 rna 内含子剪接的主要方式。
真核生物细胞的RNA内含子剪接的主要方式有GU-AG和AU-AC类内含子的间接方式以及Ⅰ、Ⅱ类内含子的间接方式。
Ⅰ类内含子的剪接主要是转酯反应，即剪接反应实际上是发生了两次磷酸二脂键的转移。
在Ⅰ类内含子的切除体系中，第一个转酯反应由一个游离的鸟苷或者鸟苷酸介导，鸟苷或鸟苷酸的3’—OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二脂键，从上游切开RNA链。
在第二个转酯反应中，上游外显子的自由3’—OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二脂键，使内含子被完全切开，上下游两个外显子通过新的磷酸二脂键相连。
真核生物细胞的RNA内含子剪接的过程比较复杂，不同类型的内含子可能采用不同的剪接机制。
这些剪接方式的发现和研究，对于理解真核生物基因表达调控的机制具有重要意义。
rna提取实验步骤
RNA提取实验步骤如下：
●匀浆处理：
●组织：将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆
仪进行匀浆处理。
●单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即
3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
●细胞悬液：离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107
细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
2-8℃10000×g离心15分钟。
收集上清液。
使用酒精洗涤RNA，以去除离心管内残留的试剂和盐。
最后利用2-甲基硫氰酸盐（MECT）溶液进行脱水，使RNA干燥而不影响RNA的完整性。
此外，如果是从动物组织中提取RNA，还需要使用DNase I处理RNA，以去除残留的DNA。
如果是从细菌中提取RNA，需要先进行细菌的裂解和细胞壁的破碎。
同时需要注意，整个提取过程需要严格控制RNA酶的污染。
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（1）细胞收集：所有耗材均经高压消毒及DEPC 水处理。
所有操作在无菌超净台中进行。
细胞感染后2、4、5 天，收集细胞，每组至少1×106个细胞，用冰预冷的0.01M PBS 液5ml，1000rpm，离心5min。
洗涤两次，弃上清；（2）细胞沉淀每管加入1ml Trizol 充分吹打溶解细胞，将细胞裂解液转入EP 管中；
（3）按0.2 ml/ml的容积比加入4 oC 保存的氯仿0.2 ml，上下颠倒震荡20 次，室温放置5 min，12000rpm， 4 oC离心10 min。
（4）将上清液转移至另一EP管中，等体积加入4oC的异丙醇约0.4-0.5 ml ，上下颠倒20次，室温放置10 min，12000 rpm，4oC，离心5 min，弃上清。
（5）加入冰预冷含1%DEPC处理的75%的乙醇洗涤2次，每次1 ml ，慢慢旋转无酶EP 管洗涤沉淀，7500 rpm，4 oC，离心 5 min 。
（6）小心吸干残余液体，空气干燥15min。
根据附壁沉淀量多少，向沉淀中加入10-20μl DEPC水，轻轻振荡混匀，获得RNA溶液，-20oC保存或者继续使用。
3. 检测RNA质量，使用微量移液器吸取2μl RNA 溶液按 1 ：100 用DEPC 水稀释，用紫外分光光度计测定OD 值及OD 260/OD 280 比值，计算RNA 浓度。
A260/A230值为大于2.0，A260/A280值为介于1.8-2.0，琼脂糖凝胶电泳检测有完整的28S、18S和5S条带，28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），5S无弥散，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，说明RNA质量较好。