流式细胞术
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
流式细胞术名词解释
流式细胞术名词解释
流式细胞术（flow cytometry）是一种高速、高效的单细胞分析
技术，广泛应用于生命科学中。
该技术利用激光束和多重探针对单个
细胞进行多参数分析，可以快速获取细胞表面、内部分子以及细胞特
性的详细信息。
在流式细胞术中，细胞被分散在流动液体中，通过细胞分流器进
入流式细胞仪的测量单元。
激光器对细胞进行激发，然后由散射仪和
荧光仪收集并分析激发光信号。
散射光可以提供关于细胞大小和形状
的信息，而荧光探针可以用于检测细胞表面抗原、内部蛋白、DNA含量、RNA含量等多种细胞特征。
流式细胞术的优势在于可以快速高效地处理大量的样本，适用于
单细胞和多种细胞的分析。
同时，该技术还可以对细胞进行有效的分
选和分离，具有极高的精确性和灵敏度。
因此，流式细胞术在生物学、医学、生物工程等领域中得到了广泛的应用。
例如，在癌症诊断中，
通过流式细胞术可以区分不同类型的癌细胞，进一步指导治疗方案的
设计和实施。
总之，流式细胞术已经成为现代生命科学中不可或缺的工具之一。
其在高通量、高精度分析和细胞分选中的优势，可以为研究细胞和疾
病提供重要的科学基础。
流式细胞术
流式细胞术流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
基本信息中文名称:流式细胞术外文名称:Flow Cytometry, FCM优点:速度快、精度高、准确性好等作用快速测定细胞或细胞器生物学性质特点:1.测量速度快；2.可进行多参数测量最高速度:每秒钟3万个细胞4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
细胞鉴定 流式和ngs
细胞鉴定流式和ngs
细胞鉴定是对细胞的种类、性质和功能进行确定的过程。
流式细胞术和二代测序（NGS）是两种常用的细胞鉴定技术，它们各有优缺点。
流式细胞术是一种基于细胞表面标志物的快速、高通量的细胞分析技术。
它通过将细胞悬液逐个通过激光束，检测细胞表面标志物的荧光信号，从而实现对细胞的分类和鉴定。
流式细胞术具有快速、灵敏、多参数、高通量等优点，可用于检测细胞表面标志物、细胞周期、细胞凋亡等。
然而，流式细胞术只能检测已知的标志物，对于未知的标志物则无法进行鉴定。
二代测序（NGS）则是一种高通量的基因测序技术，它可以对细胞中的所有基因进行测序，从而实现对细胞的全面鉴定。
NGS 可以检测细胞中的基因突变、基因表达、表观遗传学等信息，从而深入了解细胞的生物学特征和功能。
然而，NGS 技术相对复杂，需要专业的实验技能和生物信息学分析能力，同时成本也较高。
综上所述，流式细胞术和二代测序（NGS）各有优缺点，在细胞鉴定中应根据具体需求选择合适的技术。
如果需要快速、高通量地检测已知的标志物，流式细胞术是一个不错的选择；如果需要全面了解细胞的基因信息，NGS 则更为适合。
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
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▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞术概念
流式细胞术概念
流式细胞术是一种先进的生物技术，能够快速、准确地分析大量细胞，提供细胞的多功能性信息。
它是一种在液流中进行的细胞分析技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面的蛋白质、细胞内部的活性物质等进行检测，从而实现对细胞性质的精确分析。
流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮在液体中，然后通过特异性的抗体标记目标细胞，再通过激光束照射被标记的细胞，测量产生的荧光信号或其他物理化学信号，从而对细胞进行定量和分选。
在流式细胞术中，细胞以单个形式流过激光束，这样每个细胞都会被激光束照射并产生荧光信号，这些信号被光电倍增管收集并转换为电信号，最后通过计算机进行数据处理和分析。
流式细胞术具有以下优点：
1. 高速度：流式细胞术可以同时处理大量细胞，每秒钟可以分析上千个细胞。
2. 高灵敏度：它可以检测微量的蛋白质、DNA等物质，灵敏度非常高。
3. 多功能性：流式细胞术可以同时检测多个细胞特性，可以进行多参数定量分析和分选。
4. 广泛适用性：它可以应用于各种类型的细胞，包括淋
巴细胞、肿瘤细胞、干细胞等。
流式细胞术在医学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用。
在医学方面，它可以用于检测和分选肿瘤细胞、淋巴细胞等，为临床诊断和治疗提供帮助。
在生物学方面，它可以用于研究细胞的发育和分化过程，探索生命奥秘。
在环境科学方面，它可以用于检测空气和水中的微生物污染，评估环境质量。
总之，流式细胞术是一种非常强大的生物技术，可以对大量细胞进行快速、准确的分析，为科学研究提供重要的数据支持。
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微胶囊化技术
一、基本概念
微胶囊造粒技术：或称微胶囊是将固体、液体或气体物质包埋、封存在一种微型胶内成为一种固体微粒产品的技术，这样能够保护被包裹的物料，使之与外界不宜环境相隔绝，达到最大限度地保持原有的色香味、性能和生物活性，防止营养物质的破坏与损失。
二、微胶囊技术的优越性
1、可以有效减少活性物质对外界环境因素（如光、氧、水）的反应
2、减少心材向环境的扩散和蒸发
3、控制心材的释放
4、掩蔽心材的异味
5、改变心材的物理性质（包括颜色、形状、密度、分散性能）、化学性质等
对于食品工业，可以使纯天然的风味配料、生理活性物质融入食品体系，并能保持生理活性，它可以使许多传统的工艺过程得到简化，同时它也使许多用通常技术手段无法解决的工艺问题得到解决。
二、基本原理
微胶囊技术实质上是一种包装技术,其效果的好坏与“包装材料”壁材的选择紧密相关，而壁材的组成又决定了微胶囊产品的一些性能如：溶解性、缓释性、流动性等，同时它还对微胶囊化工工艺方法有一定影响，因此壁材的选择是进行微胶囊化首先要解决的问题。
微胶囊造粒技术针对不同的心材和用途，选用一种或几种复合的壁材进行包覆。
一般来说，油溶性心材应采用水溶性壁材，而水溶性心材必须采用油溶性壁材。
∙心材：微胶囊内部装载的物料。
∙壁材：外部囊的壁膜。
一种理想的壁材必须具有如下特点：
∙高浓度时有良好的流动性，保证在微胶囊化过程中有良好的可操作性能。
∙能够乳化心材并能形成稳定的乳化体系。
∙在加工过程以及储存过程中能够将心材完整的包埋在其结构中。
∙易干燥以及易脱溶。
∙良好的溶解性。
∙可食性与经济性。
三、功能
1、液态转变成固态
液态物质经微胶囊化后，可转变为细粉关产物，称之为拟固体。
在使用上它具有固体特征，但其内相仍是液体。
2、改变重量或体积
物质经微胶囊后其重量增加，也可由于制成含有空气或空心胶囊而使胶囊而使物质的体积增加。
这样可使高密度固体物质经微胶囊化转变成能漂浮在水面上的产品。
3、降低挥发性
易挥发物质经微胶囊化后，能够抑制挥发，因而能减少食品中的香气成分的损失，并延长贮存的时间。
4、控制释放
微胶囊所含的心材可即刻释放出来，亦可逐渐地释放出来。
5、隔离活性成分
微胶囊具有保护心材物质，使其免受环境中温度、氧、紫外线等影响的作用。
并且隔离了各成分，故能阻止两种活性之间的化学反应。
6、良好的分离状态
微胶囊呈高分散状态便于应用。
例如，在等量浓度下，其粘度较低。
四、微胶囊造粒的分类与步骤
1、根据微胶囊造粒的原理不同，可将各种方法分成以下三类
物理方法物理化学方法化学方法
喷雾干燥法
喷雾凝冻法
空气悬浮法
真空蒸发沉积法静电结合法
多孔离心法水相分离法
油相分离法
囊心交换法
挤压法
锐孔法
粉末床法
熔化分散法
复相乳液法
界面聚合法
原位聚合法
分子包囊法
辐射包囊法
2、用于食品用产中的微胶囊机理可以分为:
（1）通过迅速冷却或干燥、将心材包埋在不定形体（玻璃体）的壁材内。
（2）蜡类、脂类做壁材的包埋。
（3）将心材包埋于粮的晶体中。
（4）通过聚合物的交联或凝聚包埋。
（5）物理吸附。
（6）化学吸附。
3、步骤：
形象地说，微胶囊造粒是物质微粒（核心）的包衣过程，可分为以下四个步骤：
a、将心材分散入微胶囊化的介质中。
b、再将壁材放入该分散体系中。
c、通过某一种方法将壁材聚集、沉渍或包在已分散的心材周围。
d、这样形成的微胶囊膜壁在很多情况下是不稳定的，尚需要用化学或物理的方法进行处理，以达到一定的机械强度。
五、在食品工业中的应用
1、在饮料工业中的应用
(1)制造固体饮料
a、配方
阿拉伯树胶160g,食用钛白粉70g，食用明胶182g，白糊精300g，桔子油香精182g，胡萝卜素57g，柠檬酸380g，柠檬酸钠45g，苯甲酸36g，白砂糖30，水适量。
b、工艺流程
白砂糖—>粉碎
↓
原料—>乳化—>混合—>造粒—>干燥—>冷却—>成型—>检验—>包装—>出厂
↑
添加剂
2、在乳制品中的应用
乳制品中添加的营养物质具有不愉快的气味，其性质不稳定易分解，影响产品质量。
将这些添加物利用微胶囊技术包埋，可增强产品的稳定性，使产品具有独特的风味，无异味，不结块，泡沫均匀细腻，冲调性好，保质期长。
利用此法制成的产品有果味奶粉、姜汁奶粉、可乐奶粉、发泡奶粉等。
3、在糖果中的应用
微胶囊技术可应用于糖果的调色、调香、调味以及糖果的营养强化和品质改善。
糖果生产中的天然食用色素、香精、营养强化剂等物质易分解，利用喷雾干燥等方法将其微胶囊化以确保产品质量的稳定。
常用的壁材有水溶性食用胶、环状糊精、纤维素衍生物、明胶、酪蛋白等物质，用此法生产的糖果颜色鲜亮持久，产品货架期长。
4、在食品添加剂中的应用
（1）酸味剂：
用作微胶囊化酸味剂的壁材一般是氢化油，心材的释放借助于热和水。
具体包括肉制品用酸味剂、面团品质改良剂（主要指抗坏血酸）、其它用途的酸味剂如磷酸。
（2）风味与调味料：
这方面是微胶囊技术在食品工业中应用最广的领域。
最常见的如：柠檬油、薄荷油、蒜油、咖喱油等。
（3）甜味剂：
如阿斯巴甜。
（4）色素：
一些天然色素在应用中存在溶解性与稳定性差的问题，微胶囊化后不仅可以改变溶解性能同时也提高了她的稳定性。