ISSR标记技术及其在作物遗传育种中的应用

2I SSR 标记在作物遗传育种上的应用
自 1994 年加拿大蒙特利尔大学 Zi et ki ew i cz 等 ( 1994) 发展了 I SSR 标记以来， 因其在分析和应用上 A FLP 和 SSR 更加简便、 比 RFLP、 快捷， 而又能揭 示出比 RA PD 更多的多态性， 现已在小麦的遗传作 图、 基因定位、 遗传多样性等研究方面得到了广泛 应用。
1 河南农业大学农学院,郑州,450002;2 河南西华县农科所,西华县,466600 kh486@ 163. com * 通讯作者，
I SSR ( i nt er s i m pl es equencer epeat ) 标记技术是在 SSR 基础上发展起来的一项新的标记技术， 由于 其引物设计比 SSR 简单， 不需要知道 SSR 两端的碱基序列， 多态性高， 重复性好， 能够提供更多的信息， 已 在多种动植物的种质鉴定、 遗传作图、 基因定位、 遗传多样性等研究方面得到应用。本文对 I SSR 技术的特 点、 实验操作及其在作物遗传育种领域的应用进行了概述。 I SSR,分子标记,作物遗传育种,应用
1I SSR 技术的特点和实验操作
1. 1I SSR 的特点
I SSR 是基于 SSR 发展起来的一种新型分子标 记技术 ( ， 它是根据基因组内广 M or eno etal . ,1998) 泛存在的微卫星序列设计单一引物， 对两侧具有反 向排列 SSR 的一段 D N A 序列进行扩增，然后进行 电泳、 染色， 根据谱带的有无及相对位置， 来分析不 SSR 标记的多态性。 I SSR 引物通常为 同样品间 I 16~18 个碱基，其主体是 2~4 个碱基组成的串联重 复序列，然后在其 5’端和 3’端加上 1~4 个锚定碱 基，从而保证 I SSR 引物能够对 SSR 之间的 D N A 序列进行 PCR 扩增。 由于微卫星在基因组中广泛分 Roderetal . ,1998) ， 且等位变异特别丰富， 因而 布( 另外， I SSR 可以检测到高的多态性。 I SSR 不像 SSR 具有物种特异性， 它可以和 RA PD 一样用于各类动 植物的研究。只是引物设计要求不同， 但其产物多 SSR 、 RA PD 更加丰富， 可以提供更 态性远比 RFLP、 多的关于基因组的信息， 而且比 RA PD 技术更加稳 定可靠， 实验重复性更好( Bl ai retal . ,1999;G i l ber tet 。 al . ,1999)
I SSR M ar kerand i t sA ppl i cat i on i n Cr op G enet i csand Br eedi ng
1* 1 Sun H ong1 Cheng J i ng1 Zhan K ehui Zhang X i angw u2 Y ang Y anhui
1 Col l ege ofA gr onom y,H enan A gr i cul t ur alU ni ver s i t y,Zhengzhou,450002;2 X i hua Res ear ch I ns t i t ut e ofA gr i cul t ur alSci encesi n H enan Pr ovi nce, Xi huaCount y,466600 * Cor r es pondi ng aut hor ,kh486@ 163. com
SSR 技术中最关键、最重要的一 引物设计是 I SSR 步。基因组中 一般为 2~6 个寡聚核苷酸，用于 三核苷 I SSR 的引物常为 5’或 3’端加锚的二核苷酸、 酸、 四核苷酸重复序列， 重复次数( 一般为 4~8 次， n) 使引物的总长度达到 16~18bp。5’或 3’端用于锚定 的碱基数目一般为 1~4 个，锚定的目的是引起特定 位点退火，使引物与相匹配 SSR 的一端而不是中间 结合， 从而对基因组中特定片段进行扩增、 检测。由 于植物基因组中最多的 SSR 是 ( A T) ( TA) ( G A) n、 n、 n、 ( CT) Zi et ki ew i czetal . ,1994) ， n 等二核苷酸重复序列( SSR 引物时， 在选择 I 应以二核苷酸重复序列为主， 少选寡聚三核苷酸、 四核苷酸引物。 1. 2. 3 扩增反应 在确定了引物之后， 就可以在 PCR 仪上对基因 组中的 SSR 间序列进行扩增。 扩增步骤与其它基于 PCR 的标记技术一样， 而且不同引物、 不同植物材 料的扩增条件存在差异。为了保证得到清晰、 准确 的电泳谱带， 必须对扩增条件进行优化， 包括对 !"# 2+ 酶、 引物浓度及其退火温度、 M g 浓度、 模板浓度等 的优化。 1. 2. 4 电泳及染色 PCR 产物一般经电泳分离、染色显示后才能获 得指纹图谱进行谱带观察、 统计。目前 D N A 分离中 所用的电泳介质都可用于 I SSR 扩增产物的分离， 5% ~2. 0% ，聚丙烯酰胺浓度为 常用琼脂糖浓度为 1. 6% ~8% 。用硝酸银或溴化乙锭( EB) 染色后， 在可见 光( 银染 ) 或紫外光( 下进行观察， 统计带纹 EB 染色) 的有( 计为 1) 或无( 计为 0) 及相对位置， 然后即可根 据研究目的应用相关软件进行分析。
2. 1遗传作图
由于I 又遍布于 SSR 标记可以揭示高度多态性， 整个基因组，因此它是绘制遗传连锁图的理想标 记。1998 年 K oj 首先将 I i m a 等( 1998) SSR 标记用于 SSR 标记分布于整 一粒小麦遗传作图，结果表明 I
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2005 年， 分子植物育种， 第 3 卷， 第 1 期， 第 123－127 页 M ol ecul arPl antBr eedi REV I EW
I SSR 标记技术及其在作物遗传育种中的应用
孙洪 1 程静 1 詹克慧 1* 张相武 2 杨艳会 1
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分子植物育种 M ol ecul arPl antBr eedi ng
SSR 操作更简单， 出更多的多态性。由于 I 多态性更 RFLP RA PD 高， 所以被看作是克服了 和 许多局限 性( D evos and G al e,1992;Raf al s kietal . ,1991)的新 标记。近年来， I SSR 标记已广泛应用在多种动植物 的遗传作图、 基因定位、 遗传多样性等研究方面， 笔 SSR 技术的特点、实验操作及其在作物遗传 者就 I 育种领域的应用进行概述。
Recent l y,i nt er s i m pl es equence r epeat ( I SSR)m ar ker s have em er ged as an al t er nat i ve s ys t em wi t hr el i abi l i t y and advant ages ofm i cr os at el l i t es ( SSR) .I SSR pr i m er can be des i gned w i t houtt he know l edge aboutm i cr os at el l i t er egi ons ,and i t s des i gn i s eas ert han t hatofSSR.I SSR m ar kerhas good pol ym or phi s m and r epet i t i on,and can pr ovi de m or ei nf or m at i on t han ot her s .I t st echni que has been w i del y us ed i nt he s t udi es of ger m pl as m i dent i f i cat i on,genet i c m appi ng,gene t aggi ng,genet i c di ver s i t yi n ani m aland pl ant .Thi s paperem phas i zeson t hechar act er i s t i csand pr ocedur esofI SSR and i t sappl i cat i on i n cr op genet i csand br eedi ng. I SSR,M ol ecul arm ar ker ,Cr op genet i csand br eedi ng,A ppl i cat i on 20 世纪 80 年代以来， 随着分子遗传学的发展， 出现了从 D N A 水平上检测动植物遗传差异的分子 标记技术， 特别是随着大量限制性核酸内切酶的成 功分离和提纯，基于 D N A 杂交的限制性片段长度 多态性 ( r es t r i ct i on f r agm entl engt h pol ym or phi s m， RFLP) 技术受到密切关注， 并被广泛用于遗传作图、 基因定位、 系统与进化等研究领域 ( 顾红雅 ,1994) 。 90 年代 PCR 技术的广泛应用，促生了许多基于 PCR 扩增的分子标记 技 术 ， 如 随 机 扩 增 多 态 性 DNA ( r andom am pl i f i ed po1ym or phi c D N A ,RA PD ) ( Wi l l i am setal . ,1990) mi cr os at el l i t e) 、 微卫星( 或称简 s i m pl es equence r epeat SSR) 单序列重复( ， 、 扩增片段 长度多态性 ( am pl i f i ed f r agm ent l engt h po1ym or 等。SSR 标记技术是根据微卫星序列 phi s m， A FLP) 两侧的保守序列设计引物， 对串联重复的微卫星序 列进行 PCR 扩增，结果可以显示出 SSR 序列拷贝 数的差异， 该技术重复性和稳定性都较好， 被广泛 用于遗传作图、 种质鉴定等研究中( Seni orand H eun, 。但由于 SSR 两侧引 1993;W u and Tanks l ey,1993) 物具有物种特异性，引物设计及其应用研究费时、 耗力、 耗资， 这在一定程度上阻碍了该技术的广泛 K oj i m a etal . ,1998) 应用( 。加拿大蒙特利尔大学 Zi 发展的 I et ki ew i cz 等 ( 1994) SSR 标记在引物设计和 应用上比 SSR 更加简便， 因为在引物设计时不需要 了解 SSR 的序列顺序，免去了 D N A 测序和引物设 har a( 1997) SSR 计等复杂环节。 N agaoka 和 O gi 用I 引物对小麦的研究表明，此类引物的分析结果与 并发现( RFLP 分析结果一样可靠， A C) n 引物能扩增