血红素丙酸基甲酯化的细胞色素b_5及其F58位突变体蛋白的研究

第49卷第14期 2004年7月论文血红素丙酸基甲酯化的细胞色素b5及其F58位突变体蛋白的研究苏晖陆君霞王韵华任毅谢毅黄仲贤*(复旦大学化学系化学生物学实验室, 上海200433. *联系人, E-mail: zxhuang@)摘要为了进一步认识Phe58与血红素b之间芳环堆砌相互作用对蛋白质结构稳定性和性质影响的本质, 我们将Cyt b5和它的突变体F58Y, F58W蛋白的血红素丙酸根进行了甲酯化, 考察丙酸根参与的氢键网络是否对Phe58与血红素的π-π相互作用有影响. 各种谱学和反应的研究表明, 野生型及58位突变体蛋白甲酯化后, 58位芳环与周围芳环之间的堆积作用仍然存在, 但由于替代氨基酸残基的体积、疏水性及形成氢键能力等方面性质不同, 对蛋白的稳定性产生了一定的影响.关键词细胞色素b5　芳环堆砌作用 甲酯化血红素细胞色素b5(cytochrome b5, Cyt b5)是一个含血红素b的膜结合蛋白. 实验已经证明, 生物体内的细胞色素b5先在细胞内质网上合成脱辅基蛋白, 然后在线粒体外膜中完成血红素b的合成并插入apo蛋白, 组装成完整的细胞b5. 蛋白质这些反应的驱动力是肽链和辅基之间的氢键相互作用, van der Waals相互作用以及各种疏水相互作用等[1]. 因此, 血红素辅基上的各取代基以及血红素疏水腔中各氨基酸残基的性质, 在诱导蛋白质的正确折叠与组装、维持蛋白质功能结构中起着非常关键的作用. 为了阐明一些关键的或保守的氨基酸残基的具体作用和影响, 本研究组对不同位置的残基做了一系列定点突变研究, 发现细胞色素b5蛋白肽链和血红素b之间的氢键、轴向配位以及疏水相互作用等因素, 都影响着蛋白质的构象稳定性和氧化还原电位等性质[2]; 同时也注意到了血红素疏水腔内残基芳香环的堆积作用、血红素暴露边周围残基的电性相互作用等, 也起着重要的作用[3,4].Phe58是位于细胞色素b5疏水腔内的一个非常保守的氨基酸残基, 晶体结构研究已经表明[5], 该残基和轴向配体His63之间的平行距离为0.4 nm左右, 有一定的π-π相互作用. 当我们用不同的含芳环残基置换Phe后, 这些突变体蛋白的盐酸胍诱导的变性反应和血红素转移反应研究都表明, 这些堆积作用和芳环本身的性质有一定关系, 特别是残基的体积和电性对腔的疏水性产生影响, 从而导致血红素的结合强度改变. 为了进一步认识上述各种因素对蛋白质结构稳定性等性质的协同调控作用, 我们制备了Cyt b5 F58的突变体蛋白F58Y和F58W. 同时, 将血红素丙酸根进行了甲酯化, 以排除丙酸根与肽链间氢键的影响, 以使一方面突出这些不同Phe58突变体中, π-π相互作用变化的影响; 另一方面考察有丙酸根参与的氢键网络是否对Phe58的π-π相互作用有影响. 本文报道用紫外-可见光谱、圆二色散光谱研究甲酯化Cyt b5(DME-Cyt b5)和它的F58Y, F58W突变体蛋白的热变性过程. 各种甲酯化细胞色素b5与脱辅基肌红蛋白之间的血红素转移反应. 研究表明, 野生型及58位突变体蛋白甲酯化后, 虽然58位芳环与周围芳环之间的堆积作用仍然存在, 但由于替代氨基酸残基的体积、疏水性及形成氢键能力等方面性质不同, 对蛋白的稳定性产生了一定的影响.1实验(ⅰ) 细胞色素b5血红素甲酯化衍生物(DME-Cyt b5)的制备及纯化. 野生型细胞色素b5及其F58Y 和F58W突变体蛋白的制备见文献[3]. 脱辅基蛋白的制备采用温和的丁酮萃取法[6]: 将蛋白溶于少量重蒸水中, 用1 mol/L盐酸调节溶液pH < 1.5, 加入等体积丁酮萃取多次, 直至溶液水相无色. 蛋白溶液再先后对0.6 mmol/L的NaHCO3 (含1 mmol/L EDTA)和磷酸缓冲液透析.从Frontier Scientific 公司购买的二甲酯化血红素DME–Heme(Fe(Ⅲ) protoporphyrin dimethyl ester chloride)预先溶解在二甲亚砜中, 以1︰1的计量比缓慢滴加到脱辅基细胞色素b5溶液中. 溶液在4℃放置24 h后, 再加入约20%的DME-Heme, 继续放置24 h, 反应体系过DEAE–DE52阴离子交换柱以除去论 文第49卷 第14期 2004年7月未反应的DME-Heme, 得到的DME–Cyt b 5径超滤除盐后, 冷冻干燥.(ⅱ) 肌红蛋白(Myoglobin, Mb)的纯化及其脱辅基蛋白的制备. 马骨骼肌肌红蛋白购于Sigma 公司, 按文献[7]的方法将蛋白溶解于缓冲液(pH = 6.0, I = 20 mmol/L 的磷酸缓冲液). 经CM-23柱分离纯化, 用洗脱缓冲液(pH = 7.0, I = 20 mmol/L 的磷酸缓冲液)洗脱, 收集A 409/A 280 > 5.48的组分. 纯化后的蛋白脱盐, 冷冻抽干, 于−20℃保存.脱辅基蛋白的制备同上. 制备脱辅基肌红蛋白 (apo-Mb)时, 蛋白溶液先对蒸馏水透析至无丁酮, 然后对醋酸缓冲液透析. apo-Mb 蛋白浓度用消光系数ε 280 = 16 (mmol/L)−1・cm −1计算[8].(ⅲ) 细胞色素b 5及其突变体蛋白的热稳定性. 蛋白质的热稳定性在HP8453紫外可见光谱仪(Hewlett Packard 公司)上测定, 并且使用Neslab 超级恒温槽控制温度(±0.1℃). 蛋白质溶液浓度为 6 µmol/L, 缓冲液为100 mmol/L 磷酸钠(pH 7.0). 测量的温度范围为25∼85℃. 在每一个测量温度下平衡15 min 后, 检测不同温度下蛋白质溶液在412 nm 处的吸光度.细胞色素b 5的血红素解离平衡常数K D 用公式K D =(A H −A )/(A −A A )拟合[9,10]. 其中A 为不同温度下蛋白溶液的吸光度, A H 为蛋白未变性时的吸光度, A A 为蛋白完全变性时溶液的吸光度. 未变性蛋白占总蛋白的百分含量f H 由公式f H =(A − A A )/(A H − A A )计算, f H = 50% 时的温度为变性中点温度T m .(ⅳ) 脱辅基肌红蛋白与细胞色素b 5的血红素转移反应. 用0.01 mol/L, pH = 5.2的醋酸缓冲液配制浓度约为18 µmol/L 的脱辅基肌红蛋白溶液. 用相同的缓冲溶液配制浓度约3 µmol/L 的细胞色素b 5蛋白溶液. 将两种蛋白溶液分别置于双槽比色皿的两隔室中, 用HP8453型紫外-可见光谱仪监测混合前后光谱的变化. 以混合前的溶液作空白, 混合后光谱最大吸收值在405 nm. 监测405 nm 的吸收值∆A t 随时间的变化, 监控时间大约为15000 s. 血红素转移速率常数由方程∆A t = ∆A eq (1 − e −kt )拟合. 其中k 为血红素转移反应速率常数.2 结果2.1 细胞色素b 5血红素甲酯化衍生物(DME-Cyt b 5)的制备由于二甲基酯化的血红素DME–Heme 不溶于水,故把它溶解在可与水互溶的二甲亚砜DMSO 中. 重组过程中, 有相当一部分DME–Heme 因多聚而沉淀出来. 整个重组效率不高, 野生型蛋白及其突变体蛋白的重组率约为60%. DME 的衍生物其紫外-可见光谱Soret 吸收峰有2 nm 左右的紫移, 与文献报道的一致[11].2.2 氧化还原电位细胞色素蛋白是一类存在于生物体中的重要电子传递蛋白. 虽然它们都由一条肽链和一个血红素辅基组成, 但电位却从 −150 mV 跨越到 +300 mV . 电子传递伙伴蛋白间的氧化还原电位差即为相应的电子传递过程的热力学驱动力. 因此, 细胞色素蛋白的氧化还原电位是与其电子传递的功能紧密相关的. 我们用光谱电化学和微分脉冲伏安法研究了血红素丙酸根对细胞色素b 5氧化还原电位的贡献.细胞色素b 5血红素上的丙酸根甲酯化以后, E 0 为70 mV , 与文献报道的电位69 mV 一致[11]. 很明显, 丙酸根上负电荷的中和使蛋白的氧化态稳定性降低, 从而使电位上升. 据报道在Fe-S 蛋白中, 每个电荷的中和对电位产生15∼30 mV 的位移, 其大小与该电荷离金属中心的远近有关. 对血红素类蛋白, 这个影响是5∼15 mV 或0∼10 mV [12]. 因此, 血红素上的丙酸根被甲酯化以后, 电位与野生型相比约上升65 mV , 显然还有其他的影响因素.另外一个对电位影响较大的因素是金属中心对溶剂的暴露程度. 一般来说, 金属中心还原时如果电荷表现为负电荷的增加, 则溶剂暴露程度增加使电位上升; 而如果电荷表现为正电荷的减少, 则溶剂暴露程度增加使电位下降. 细胞色素b 5中, 血红素在还原态可看作是−2价, 氧化态可看作−1价. 根据NMR 结构[13], 在DME–Cyt b 5中铁原子暴露程度增加了15%. 我们推测, 这可能是电位变化的另一个主要原因.2.3 蛋白质稳定性蛋白质的稳定自由能来自多种作用的贡献, 主要包括残基间的静电作用、疏水作用、构象作用、范 德华力、氢键等[14]. 对于有辅基的蛋白质, 蛋白肽链和辅基之间的各种相互作用, 对蛋白稳定性也有较大的贡献. 天然蛋白进行定点突变后, 往往会破坏蛋白分子内各种作用力的平衡, 导致蛋白稳定性的改第49卷 第14期 2004年7月论 文变. 本文通过细胞色素b 5突变体蛋白的热变性以及与脱辅基肌红蛋白的血红素竞争转移反应, 研究了细胞色素b 5疏水腔中氨基酸残基的突变所引起的蛋白稳定性变化.热诱导蛋白质变性主要是通过加热使蛋白肽链的热运动加速, 溶剂分子容易进入蛋白内部, 破坏蛋白分子内各种作用力的平衡. Pace 等人[9]的研究表明, 细胞色素b 5热或变性剂诱导的去折叠过程均符合二态机理, 即:Cyt b 5 ⇔ Heme+apo-Cyt b 5但事实上, 细胞色素b 5的热变性是一个复杂的过程, 当血红素辅基和蛋白肽链解离后, 脱辅基蛋白肽链并不保持完好的高级结构, 而会同时发生部分肽链的去折叠.(1) UV-Vis 光谱研究二甲酯化的细胞色素b 5的热变性. 从图1的DME-Cyt b 5, DME-F58Y 和DME- F58W 的紫外-可见光谱监测的热变性可看出, 随着温度的升高, Soret 峰值逐渐减小. 表1中一个值得注意的结果是血红素丙酸基酯化后其稳定性大幅度地下降, 相应的突变体之间的T m 值差异却不大, 与未酯化的各蛋白相似. 同时, 还原态的酯化各衍生物要比氧化态的稳定性高得多. 从图2的归一化曲线可以看出, 3个氧化态甲酯化蛋白的变性温度区间内都有两个变化的过程, 不同于非甲酯化的WT, F58Y , F58W 蛋白.(2) CD 光谱研究二甲酯化的细胞色素b 5的热变性. 图3是甲酯化细胞色素b 5野生型及突变体蛋白在250~500 nm 波长范围内30, 60, 65, 75, 85, 90℃的CD图1 DME-Cyt b 5热失活的紫外-可见光谱光谱. 在Soret 带区域, 3种蛋白在30℃的峰形基本相似. 在近紫外区268 nm 的负峰来自于Tyr6, Tyr7, Tyr27, Tyr30等4个酪氨酸残基. DME-Cyt b 5, DME-F58Y 在296 nm 的负峰来自于蛋白中仅有的Trp22, 峰值没有发生明显位移, 强度也变化不大. 而DME-F58W 的峰强度明显增大, 这是由于人工引进了一个色氨酸的缘故. 3个蛋白的CD 热变性曲线基本相似, 419 nm 处的强度较大的负峰和390 nm 处的正峰是低自旋的高铁细胞色素b 5的特征吸收峰. 当温度升高, 419 nm 的负峰逐渐蓝移, 峰值逐渐减 小, 390 nm 处的正峰也随之减小. 我们发现当温度升高至60∼65℃左右, 398 nm 处出现了一个新的负峰,表1 甲酯化细胞色素b 5和非甲酯化细胞色素b 5的热力学参数比较细胞色素b 5 T m /℃ ∆H m /kJ ・mol −1∆S m /kJ ・mol −1・K −1氧化态野生型 67.3 573.7 1.7 氧化态DME-野生型 58.1 289.9 0.9 还原态DME-野生型69.8 548.8 1.6 氧化态F58Y 64.5 537.3 1.6 氧化态DME-F58Y 55.3 257.1 0.8 还原态DME-F58Y 68.5 507.2 1.5 氧化态F58W 63.7 586.9 1.7 氧化态DME-F58W 55.2 269.6 0.8 还原态DME-F58W67.5502.91.5论 文第49卷 第14期 2004年7月图2 氧化型和还原型DME-Cyt b 5的相对热失活曲线从65∼75℃, 398 nm 处的负峰强度显著增加, 然后, 随着继续升温该处峰值逐渐减小. 然而, 即使温度升至90℃, 该峰仍未完全消失. 这种结果和本实验室先前的关于细胞色素b 5 F35Y 的CD 热变性结果相似, 不同于Sugiyama 等人的有关兔肝细胞色素b 5 的CD 热变性结果[15]. 267 nm 处的负峰随着温度的升高逐渐减小, 当温度升至60∼65℃, 负峰消失, 一个正峰出现, 强度逐渐增加, 当温度升至75℃, 峰值达到最大, 然后随温度的继续升高, 峰值逐渐减小. 296 nm 处的负峰随着温度的升高峰值单一性减小. Trp22, Tyr6, Tyr7, Tyr27, Tyr30是细胞色素b 5 core 2的主要的芳香性残基组分, 267和296 nm 处的吸收变化方式提示, 即使血红素从蛋白core 1中脱离之后, core 2仍然基本上保持原有构型, 但是随着温度的升高core 2也在经历着结构扰动, 并逐渐去折叠化. 由于3个蛋白的紫外可见光谱、CD 光谱基本一致, 表明甲酯化的突变体蛋白和甲酯化的野生型蛋白结构, 在整体上没有太大的变化. 这些结果表明血 红素7位的丙酸与Ser64的氢键, 以及血红素与疏水腔中残基的疏水相互作用, 在蛋白质的稳定性上起着重要的影响, 而第58位残基在芳环氨基酸间的变化并不对蛋白质的稳定性产生太大的影响. 2.4 细胞色素b 5和脱辅基肌红蛋白的血红素转移反应细胞色素b 5和脱辅基肌红蛋白的血红素竞争转移反应, 可以反映血红素和脱辅基细胞色素b 5的相互作用. 在比较温和的条件下, 细胞色素b 5中的血红素被传递到脱辅基肌红蛋白中去的过程可以表述为:Cyt b 5 ⇒ apo-Cyt b 5 + Heme Heme + apo-Mb ⇒ Mb在一般条件下, 细胞色素b 5溶液中血红素的插入和脱出处于平衡状态. 一旦过量的脱辅基肌红蛋白存在, 由于它对血红素的结合能力远远大于脱辅基细胞色素b 5, 所以反应就迅速向生成肌红蛋白的方向移动. 又因为细胞色素b 5的血红素解离相对于血红素与脱辅基肌红蛋白的结合要慢得多, 因此整个反应可视为血红素从细胞色素b 5中的解离过程[16].细胞色素b 5 F58及其突变体以及它们酯化的衍生物与apo-Mb 之间的血红素转移反应的结果列在表2和图4 中. 甲酯化蛋白较非甲酯化蛋白速率常数大. DME-F58W, DME-F58Y 和DME-WT 的变化趋势相似. 说明甲酯化后由于氢键的消失, 蛋白的稳定性降低, 肽链与血红素的结合强度降低. 3个甲酯化蛋白之间的速率常数比较表明, DME-WT 和DME-F58Y , DME-F58W 的k −H 值大小顺序和蛋白稳定性的顺序一致, 但DME-F58W 的血红素转移反应速率却明显大于DME-F58Y 和野生型蛋白.3 讨论3.1 蛋白质的稳定性根据Cyt b 5 F58Y 的晶体结构a), 相对于细胞色素b 5的其他突变体, F58Y 突变体与野生型之间的整体结构没有大的变化, 突变位点残基F58Y 处的局部构象与野生型中Phe58差异也很小. 同时由于酪氨酸残基的疏水自由能、体积等和苯丙氨酸残基的差异不大, 这一取代对血红素疏水口袋结构与性质的扰动较小. 紫外-可见光谱进行热变性研究表明, 突变体a) San L, Lu J X, Xia Z X, et al. The crystal structures of cytochrome b 5 P58Y and F58W. Crystal Acta D, 2004(待发表)第49卷第14期 2004年7月论文图3 DME-Cyt b5热失活的圆二色散光谱表2 血红素转移反应速率和动力学参数比较细胞色素b5k H /h−1E a /kJ・mol−1ΔH≠/kJ・mol−1ΔS≠/J・mol−1・K−1野生型0.82 119.6 117.1 75.2DME-野生型 1.36 106.7 104.2 40.8 F58Y 1.00 97.7 95.2 6.1DME-F58Y 1.92 85.3 82.8 −29.7 F58W 2.46 78.1 75.6 −58DME-F58W 3.12 60.1 57.6 −116.1论 文第49卷 第14期 2004年7月图4 紫外-可见光谱监察Cyt b 5及其突变体蛋白和脱辅基肌红蛋白间血红素转移反应蛋白的肽链与血红素辅基结合的稳定性仅比野生型略有降低.在F58W 的晶体结构中a), 58位从Phe 突变为Trp 后, 由于该残基侧链体积变大, 迫使附近一些相关的残基侧链指向发生变化, 连带着使与这些残基相关的另几个残基的侧链甚至主链构象发生变化, 突变后Trp58侧链的吲哚环平面与Phe58侧链的苯环平面相比有所扭转, His63侧链的咪唑环由于主链原子的移动也有所扭转, 它们之间以及它们与血红素辅基的芳香环堆积作用也相应地有所减弱. 同时, 疏水口袋壁周围Glu59, Arg68之间的盐键和氢键作用有所破坏, 并使得周围一些氨基酸残基(His26, Tyr27)的构象变得不稳定, 搅动了疏水口袋内的微环境. 所有这些因素都降低了蛋白肽链与血红素辅基的结合强度. 蛋白质各种性质的研究结果也表明, F58W 全蛋白的稳定性比野生型细胞血素b 5及F58Y 都要低得多.第58位芳香环的改变对蛋白的稳定性从甲酯化和非甲酯化蛋白之间的T m 值比较可以看出, 3种蛋白的甲酯化都使得T m 值较甲酯化之前有明显的下降, 稳定性降低. 蛋白稳定性大小顺序为DME-WT > DME-F58Y ≈DME-F58W. 这是由于甲酯化破坏了原有血红素的丙酸与Ser64间的氢键作用, 使得血红素周围的疏水环境有所变化. 甲酯化对Phe58不同的突变体的T m 值的影响相同, 表明血红素丙酸根的甲酯化只破坏丙酸根和Ser64之间的氢键的作用, 而血红素与疏水袋残基的疏水作用和氢键之间没有协同作用.甲酯化突变体的热变性显示出两个过程. 而且这两个过程的不同在蛋白的还原态下不如氧化态下来得明显. 热变性具有两个过程可以解释为在血红素和部分解离的多肽之间形成了中间体(同Phe35Tyr 突变体的情况相同). CD 检测的热变性证实了我们的结论. CD 光谱研究甲酯化蛋白的热变性中我们发现, 在397 nm 处出现一个新的吸收峰, 显示出不同的变性行为. 该处吸收很明确地显示它来源于血红素的衍生物. 由于血红素是一个低对称的发色基团, 它没有内在的光学活性. 我们的实验也显示了血红素在缓冲液中本身也没有任何的CD 吸收. 同时, 在250~ 500 nm 30∼90℃范围内, 脱辅基细胞色素b 5在Soret 带区域没有吸收. 在60∼65℃时, 419和397 nm 处同时出现两个吸收峰表明, 在溶液中可能有两种血红素的衍生物存在. 此时, 血红素并没有从蛋白质的血红素疏水口袋中完全解离到周围的水环境中, 随着His-Fe 键的破坏和 α-螺旋的部分去折叠, 部分的低自旋和六配位的血红素转变成为高自旋的状态, 细胞色素的core 1开始坍塌. 这一温度区域也正是用UV-Vis 光谱检测细胞色素b 5的热变性的转变区间. 因此397 nm 处的CD 吸收反映的是另外一种血红素形式, 一种在core 1坍塌之后的中间过渡态. 在这种状态中, 血红素没有和两个组氨酸残基配位, 也没有a) 见1359页脚注第49卷 第14期 2004年7月论 文正常地呆在血红素疏水口袋中, 更有可能依附在部分未折叠的细胞色素b 5多肽链上. 此时, 色氨酸和酪氨酸的CD 吸收曲线表明, 在这一温度范围内core 2仍然完好, 397 nm 处的吸收峰即使在90℃, 也没有完全消失.实验还表明, 还原态野生型Cyt b 5蛋白的T m 比氧化态的值高. 而这种还原态比氧化态T m 高的现象, 源于血红素和疏水袋肽链的疏水相互作用. 甲酯化突变体的还原态的T m 值比氧化态的值也高, 而且, 3个蛋白的氧化态与还原态之间的T m 差值相近, 表明在氧化态转变为还原态的过程当中, 氢键作用对该过程的影响很小.热变性过程中的焓变、熵变显示, 氢键的消失造成热力学参数减少约一半, 表明heme b 和血红素疏水袋中的氢键作用和疏水相互作用对维持heme 的稳定性同等重要. 3.2 血红素转移反应图4和表2的结果表明, 尽管芳环残基的置换对蛋白质的热稳定性影响不大, 然而它对血红素的转移反应却有明显的作用, 对F58W 表现得尤为显著. 这表明血红素转移反应对于探索血红素腔内的相互作用的变化是更为灵敏的方法.F58W 和甲酯化的F58W 之间的活化能的变化要比WT 和F58Y 对应的甲酯化衍生物来得大, 提示在F58W 中第6位丙酸根和Ser64之间的氢键的确影响血红素转移反应. 一旦该氢键被破坏, heme 更容易被转移到apo-Mb 中, 这是由于Trp 的体积比较大, 整体上减小了heme 和袋之间的疏水相互作用.由反应活化熵和反应活化焓比较可知, 血红素转移反应速率主要由反应活化焓决定, 但还受到疏水口袋中对血红素依赖的稳定程度以及反应活化能的影响.致谢 本工作为国家自然科学基金(批准号: 20372017)资助项目.参 考 文 献1Xue L L, Wang Y H, Xie Y, et al. 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